Genética induzível Destino Mapping (GIFM) marcas e faixas de células com o controle espacial e temporal bem In vivo E elucida como as células de uma linhagem genética específica contribuir para o desenvolvimento e tecidos adultos. Demonstrado aqui são as técnicas necessárias para o destino mapa E12.5 embriões de camundongos para a análise de epifluorescência e explante.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Uma Abordagem Prática para mapeamento genético induzível Fate: Um Guia Visual para Mark e Track Células In Vivo
Neste artigo
Resumo
Resumo
Mapas destino são gerados por marcação e rastreamento de células in vivo para determinar como progenitores contribuir para estruturas específicas e tipos de células no desenvolvimento e tecidos adultos. Um avanço neste conceito é G enetic eu nducible F comeu Mapear (GIFM), ligando a expressão do gene, o destino de células, e os comportamentos de células in vivo, para criar mapas de destino com base na linhagem genética.
GIFM exploits X-creer linhas onde X é um gene ou conjunto de elementos reguladores de genes que conferem expressão espacial de uma proteína bacteriófago modificados, Cre recombinase (creer T). Creer T contém uma versão modificada e estrogênio r domínio ligante eceptor ligação que torna creer T seqüestrado no citoplasma na ausência da droga tamoxifen. A ligação do tamoxifeno releases creer T, que transloca para o núcleo e recombinação faz a mediação entre seqüências de DNA flanqueado por sites loxP. Em GIFM, a recombinação ocorre normalmente entre um loxP ladeado Parar cassete precedentes um gene repórter, como GFP.
Camundongos são criados para conter uma região ou célula creer tipo específico e um alelo repórter condicional. Ratos não tratados não terá marcação porque a cassete Parar na transcrição impede repórter adicional do gene repórter. Nós administrar tamoxifeno por sonda oral para grávidas timed-fêmeas, que oferece um controle temporal da liberação creer T e translocação subseqüente ao núcleo remover a cassete Parar a partir do repórter. Após a recombinação, o alelo repórter é constitutivamente expressa e hereditariamente. Esta série de eventos marca as células de tal forma que sua história genética está indelevelmente gravada. O repórter recombinados, portanto, serve como um marcador de alta linhagem genética que a fidelidade, uma vez, é desacoplado da expressão do gene inicialmente usado para acionar T creer.
Nós aplicamos GIFM em rato para estudar o desenvolvimento normal e contribuição de tomar conhecimento das linhagens genéticas de tipos de células adultas e tecidos. Nós também usamos GIFM para seguir em células mutantes origens genéticas para compreender melhor fenótipos complexos que imitam características mais salientes das doenças genéticas humanas.
Este artigo vídeo guias pesquisadores através de métodos experimentais para aplicar com êxito GIFM. Nós demonstramos o método usando o nosso bem caracterizada Wnt1-creer T; ratos mGFP pela administração do tamoxifeno no dia embrionário (E) 8.5 via gavagem oral, seguida de dissecção no E12.5 e análise por estereomicroscopia epifluorescência. Também demonstramos como micro-destino dissecar domínios mapeados para a preparação do explante ou análise FACS e dissecar adultos destino cérebros mapeados para a imagem latente montar toda fluorescente. Coletivamente, esses procedimentos permitem aos pesquisadores para debater questões críticas em biologia do desenvolvimento e modelos de doença.
Protocolo
Tamoxifeno Preparação e Procedimento Gavage Oral (E8.5)
- Prepare uma solução estoque 20 mg / ml de tamoxifeno dissolvendo tamoxifeno na pré-aquecido o óleo de milho.
- Incubar a solução a 37 ° C por 2 horas em um vortex nutator e de forma intermitente.
- Proteger o estoque da loja tamoxifeno luz, a 4 ° C, e usar por até um mês.
- Para experimentos de mapeamento destino, estabelecer um par de reprodução que consiste em um Webster suíço feminino (tipo selvagem; comprado de Taconic) e um macho portador tanto um gene específico creer alelo T e um alelo repórter. Para fins de demonstração, estamos usando W....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
O sistema GIFM que temos demonstrado pode ser usado para responder a uma ampla gama de questões em uma variedade de processos celulares. Por exemplo, ratos geneticamente modificados com drivers diferentes Cre pode ser usado para atingir qualquer tipo de célula, tecido ou linhagem genética de interesse. Além disso, como o tamoxifeno pode ser administrado em nenhum momento embrionário ou pós-natal, a recombinação pode ser direcionada para qualquer fase de desenvolvimento relevantes. O controle espacial e temporal deste si.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Todos os autores contribuíram igualmente para este trabalho e estão listados em ordem alfabética. A contribuição de cada indivíduo é aparente por sua participação no artigo vídeo.
Agradecimentos
Somos gratos a S. Arber para os ratos mGFP e aos membros do laboratório que Zervas criticamente ler o jornal e prestou assistência técnica. A. Brown foi apoiado por uma Kaplan Ciência Prêmio Cérebro Verão de Pesquisa de Pós-Graduação. E. Normand foi apoiado por uma Ciência Prêmio Programa de Pós-Graduação Brain Research. Esta pesquisa também foi financiada por fundos de pesquisa de inicialização (MZ).
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Referências
- Ellisor, D., Koveal, D., Hagan, N., Brown, A., Zervas, M. Comparative analysis of conditional reporter alleles in the developing embryo and embryonic nervous system. Gene Expr Patterns. 9, 475-489 (2009).
- Zervas, M., Millet, S., Ahn, S., Joyner, A. L.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
