Uma Abordagem Prática para mapeamento genético induzível Fate: Um Guia Visual para Mark e Track Células In Vivo</em

Resumo

Genética induzível Destino Mapping (GIFM) marcas e faixas de células com o controle espacial e temporal bem In vivo E elucida como as células de uma linhagem genética específica contribuir para o desenvolvimento e tecidos adultos. Demonstrado aqui são as técnicas necessárias para o destino mapa E12.5 embriões de camundongos para a análise de epifluorescência e explante.

Resumo

Mapas destino são gerados por marcação e rastreamento de células in vivo para determinar como progenitores contribuir para estruturas específicas e tipos de células no desenvolvimento e tecidos adultos. Um avanço neste conceito é G enetic eu nducible F comeu Mapear (GIFM), ligando a expressão do gene, o destino de células, e os comportamentos de células in vivo, para criar mapas de destino com base na linhagem genética.

GIFM exploits X-creer linhas onde X é um gene ou conjunto de elementos reguladores de genes que conferem expressão espacial de uma proteína bacteriófago modificados, Cre recombinase (creer ^T). Creer ^T contém uma versão modificada e estrogênio r domínio ligante eceptor ligação que torna creer ^T seqüestrado no citoplasma na ausência da droga tamoxifen. A ligação do tamoxifeno releases creer ^T, que transloca para o núcleo e recombinação faz a mediação entre seqüências de DNA flanqueado por sites loxP. Em GIFM, a recombinação ocorre normalmente entre um loxP ladeado Parar cassete precedentes um gene repórter, como GFP.

Camundongos são criados para conter uma região ou célula creer tipo específico e um alelo repórter condicional. Ratos não tratados não terá marcação porque a cassete Parar na transcrição impede repórter adicional do gene repórter. Nós administrar tamoxifeno por sonda oral para grávidas timed-fêmeas, que oferece um controle temporal da liberação creer ^T e translocação subseqüente ao núcleo remover a cassete Parar a partir do repórter. Após a recombinação, o alelo repórter é constitutivamente expressa e hereditariamente. Esta série de eventos marca as células de tal forma que sua história genética está indelevelmente gravada. O repórter recombinados, portanto, serve como um marcador de alta linhagem genética que a fidelidade, uma vez, é desacoplado da expressão do gene inicialmente usado para acionar ^T creer.

Nós aplicamos GIFM em rato para estudar o desenvolvimento normal e contribuição de tomar conhecimento das linhagens genéticas de tipos de células adultas e tecidos. Nós também usamos GIFM para seguir em células mutantes origens genéticas para compreender melhor fenótipos complexos que imitam características mais salientes das doenças genéticas humanas.

Este artigo vídeo guias pesquisadores através de métodos experimentais para aplicar com êxito GIFM. Nós demonstramos o método usando o nosso bem caracterizada Wnt1-creer ^T; ratos mGFP pela administração do tamoxifeno no dia embrionário (E) 8.5 via gavagem oral, seguida de dissecção no E12.5 e análise por estereomicroscopia epifluorescência. Também demonstramos como micro-destino dissecar domínios mapeados para a preparação do explante ou análise FACS e dissecar adultos destino cérebros mapeados para a imagem latente montar toda fluorescente. Coletivamente, esses procedimentos permitem aos pesquisadores para debater questões críticas em biologia do desenvolvimento e modelos de doença.

Protocolo

Tamoxifeno Preparação e Procedimento Gavage Oral (E8.5)

• Prepare uma solução estoque 20 mg / ml de tamoxifeno dissolvendo tamoxifeno na pré-aquecido o óleo de milho.
• Incubar a solução a 37 ° C por 2 horas em um vortex nutator e de forma intermitente.
• Proteger o estoque da loja tamoxifeno luz, a 4 ° C, e usar por até um mês.
• Para experimentos de mapeamento destino, estabelecer um par de reprodução que consiste em um Webster suíço feminino (tipo selvagem; comprado de Taconic) e um macho portador tanto um gene específico creer alelo ^T e um alelo repórter. Para fins de demonstração, estamos usando Wnt1 ^creer-T; mGFP homens (Ellisor 2009).
• Verifique fêmeas suíço Webster todas as manhãs para o aparecimento de um plug vaginal. Designar pela manhã (0900) do dia um plug vaginal é visto como 0,5 dias pós-coito e calcular a data de administração do tamoxifeno com base neste ponto de partida. (Para este experimento, dia embrionário 8.5 foi utilizado).
• Use uma seringa de 1 ml com agulha de alimentação animal (20G x 1-1/2) a elaboração de 200 mL da solução de tamoxifeno (4 mg tamoxifeno).
• Firmemente restringir o tempo de gravidez suíço feminino Webster segurando a nuca do pescoço e costas para imobilizar a cabeça e virar para o lado ventral é voltada para cima.
• Segure a cauda entre os dedos livres para manter o corpo em uma linha reta.
• Coloque a agulha de alimentação para o canto da boca e gentilmente guiar a agulha ao longo do céu da boca.
• Gire a agulha para que ela fique paralela ao corpo, ao mesmo tempo, inclinando a cabeça para trás para manter o pescoço reto.
• Guiar a agulha para o esôfago, em direção ao estômago. Tenha cuidado para não entrar na traquéia. Se houver resistência na agulha, envolve o animal reflexo de vômito, ou se o mouse lutas, remover imediatamente a agulha e tentar o gavage novamente.
• Uma vez que a agulha é a alimentação no estômago, administrar o tamoxifeno para o estômago e voltar a fêmea para a gaiola em casa até a data de dissecção.

Craniotomia:

• Intracardially perfundir o destino adulto mapeados mouse com PFA 4% e remover a cabeça com uma tesoura, cortando a coluna vertebral um pouco acima dos ombros.
• Executar um bisturi ao longo da linha média dorsal da cabeça (rostral caudal) para cortar o couro cabeludo e expor o scull.
• Usando o bisturi, raspar qualquer excesso de tecido ou músculo de ao longo da lateral e posterior do crânio.
• Punção com uma pinça, o crânio na linha média rostral apenas para os bulbos olfatórios e criar um buraco pequeno para acomodar as pontas de uma tesoura fina.
• Inserir a tesoura bem neste buraco e fazer uma incisão medial para lateral, aproximadamente o comprimento do bulbo olfatório. Este corte vai quebrar o crânio na intersecção do osso nasal e do osso frontal e fornecer acesso bom para a tesoura.
• Corte ao longo das suturas sagital no crânio (linha média dorsal) certificando-se de manter as pontas em ângulo tesoura longe do cérebro para evitar danos ao tecido subjacente.
• Gentilmente segure o crânio com uma pinça e descascar o osso ao longo da incisão medial para expor o cérebro. O crânio pode chip de fora em pequenos pedaços ou romper em seções maiores. Continuar a usar a pinça para retirar todos os ossos frontal, parietal, interparietal e occipital.
• Rachar os ossos que envolvem os paraflocculi (localizado ao longo das bordas laterais do cérebro ao nível do cerebelo) apertando os ossos esférica de cada lado. Gentilmente se afastar dos ossos.
• Gire a cabeça para baixo (lado dorsal para baixo) e use a pinça para cortar os nervos cranianos e libertar o cérebro do crânio.

Microscopia Monte todo: Cérebro Adulto

• Avaliar cérebro adulto para GFP marcação utilizando um escopo fluorescentes de dissecação.
• Transferência do cérebro para uma placa de Petri contendo PBS e fotografar usando PictureFrame ou software apropriado.

Microscopia Monte todo: E12.5 Embriões

• Avaliar embriões montar toda a GFP marcação utilizando um escopo fluorescentes de dissecação.
• Transferência aqueles que são GFP positivas por montar toda a uma placa de Petri contendo PBS e fotografar usando PictureFrame ou software apropriado.
• Use uma pinça para beliscar fora um pequeno pedaço da cauda de cada embrião, coloque cada pedaço em um tubo de PCR e do genótipo do tecido usando PCR (Ellisor 2009) para ambos os alelos para confirmar os resultados vistos através de análise de montar todo.

Micro dissecação e preparação do explante do mesencéfalo ventral de embriões E12.5

• Após dissecção da cadeia uterina e identificação do destino mapeada embriões por todo o monte de fluorescência, embriões transferir para gelada estéril PBS em um prato de cultura de células.
• Com uma tesoura fina, retire a parte da cabeça do embrião corte transversalmente, caudal de rhombomere 1.
• Em seguida, remova a parte rostral da cabeça com um corte coronal através do diencéfalo. Isto irá expor uma estrutura de tubo, em que o ventrículo quarto através do formulário de vesícula mesencefálica um canal entre os tecidos dorsal e ventral.
• Insira cuidadosamente a tesoura dicas para o ventrículo 4, e snip ao longo da linha média dorsal, caudal a rostral, totalmente a abertura do tubo, criando um "livro aberto" de preparação. Mesencéfalo ventral agora será exposta medialmente, enquanto as duas metades dorsal do mesencéfalo residirá lateralmente.
• Remover qualquer tecido não-neural restantes debaixo do mesencéfalo ventral para que o tecido para colocar mais sem rodeios. Se necessário, fazer entalhes nos aspectos rostral e caudal de tal forma que o dorsal "asas" do explante vai colocar o plano também. O explante deve agora se parecer com uma borboleta ", em que o mesencéfalo dorsal representa as asas, e rhombomere uma cauda.
• Para isolar ainda mais o mesencéfalo ventral para FACS análise ou experimentos de cultura celular, remova a lateral (aspectos dorsal) do tecido.

Resultados representativos:

Neste experimento GIFM, Wnt1 células que expressam são permanentemente e hereditariamente marcado durante a embriogênese através da administração de tamoxifeno em E8.5 para Wnt1-CreERT; embriões mGFP. Posteriormente, essas células marcadas são visualizadas por meio de fluorescência montar todo e imunohistoquímica seção para determinar como Wnt1 células derivadas de contribuir para estruturas neurais em desenvolvimento. Toda montagem de fluorescência depende o componente de membrana ligado GFP do repórter mGFP e, portanto, fornece informações celular, bem como uma visão global de derivados de projeções Wnt1 neural. Por exemplo, com o tamoxifeno administração em E8.5, Wnt1-CreERTmGFP embriões em E12.5 fluorescência da GFP mostra principalmente no mesencéfalo, rombencéfalo posterior ea medula espinhal (Figura 1A). Em grandes ampliações, multa projeções neuronais são vistos inervação do mesencéfalo, parede do corpo, a integridade física, e na região craniofacial. Nesta fase de desenvolvimento, o embrião é translúcido e rotulagem GFP interna é facilmente percebida. No entanto, como o cérebro se desenvolve, a densidade do tecido maduro obscurece GFP fluorescência proveniente de estruturas cerebrais internas. Portanto, com tamoxifeno administração em E8.5, apenas rotulagem GFP menor é observado no colículos superiores do adulto por toda montagem de fluorescência (Figura 1C, detalhe). Além disso, algumas projeções axonais são vistos correndo ao longo da superfície ventral do cérebro posterior (não mostrado). Em contraste, quando o tamoxifeno é administrado em E9.5, rotulagem GFP substancial ocorre em todo o colículo inferior inteira (Figura 1B, inset). Este aumento na fluorescência montar toda pode indicar que Wnt1 células que expressam em E9.5 contribuir mais significativamente para a regiões superficiais do mesencéfalo dorsal ou estender os processos mais dentro desta região de células que expressam Wnt1 de E8.5. Independentemente disso, esta diferença no todo montagem de fluorescência reflete a natureza dinâmica do Wnt1 expressão durante o desenvolvimento e demonstra como GIFM pode ser usado para seguir populações de células distintas do embrião para o adulto maduro.

Com imunohistoquímica, o destino de secções de tecido mapeados a partir Wnt1-CreERT; animais mGFP são analisadas no nível celular. Anticorpos contra GFP e β-galactosidase (β-gal) são usados ​​em conjunto com uma variedade de tecidos específicos biomarcadores para determinar a contribuição escala fina celulares da linhagem Wnt1 às estruturas neurais e tipos celulares. Com tamoxifeno administração em E8.5 e análise de tecidos em E12.5, duplo células positivas (GFP + e + β-gal) são observados ao longo do mesencéfalo e rombencéfalo com projeções correndo através do mesencéfalo ventral (Figura 1B). No cérebro adulto, o Wnt1 linhagem marcados a E8.5 dá origem a estruturas mesencéfalo, inclusive a colículos superiores e inferiores, bem como nas proximidades de populações de células dopaminérgicas da área tegmental ventral e substantia nigra (Figura 1D) (ver também Zervas 2004). Em contraste, a linhagem Wnt1 marcados a E9.5 dá origem ao colículo inferior, bem como para os neurônios nos arredores de populações de células dopaminérgicas (Figura 1F).

Figura 1 Resultados Representante para Wnt1 destino mapeamento.:

Exemplos de toda montagem e resultados imunocitoquímica em Wnt1-CreERT; embriões mGFP e destino cérebros adultos mapeados (marcado) em E8.5 (AD)e E9.5 (EF). A. Wnt 1-creer; embriões mGFP na E12.5 fluorescência da GFP mostra principalmente no mesencéfalo (Mb), rombencéfalo posterior (Hb) ea medula espinhal (Sp). Células B. Marcado visualizados e analisados ​​a nível celular por imuno-histoquímica como mostrados nesta seção um mícrons de espessura óptica (objetiva de 40x, z-series aquisição). Rotulagem de anticorpos nucleares β-galactosidase (nβ-gal) (vermelho) e GFP rotulagem de anticorpos (verde) indica o destino mapeada células mostrado no mesencéfalo ventral. Aqui, as células recombinadas são duplamente positivo (nβ-gal + / GFP +) por causa da natureza do repórter mGFP condicional. C. Todo-mount microscopia de fluorescência revela fluorescência da GFP fraco no colículo superior (SC) do adulto (inset). Avaliar a linhagem Wnt1 marcado em E8.5 em seções adultos com baixa ampliação (5x) A microscopia revela que a linhagem Wnt1 dá origem a estruturas mesencéfalo, incluindo o superior (SC) e inferior (IC) colículos (C). D. A 40x, seção 1 mm óptica retirado do mesencéfalo ventral na vizinhança dos neurônios dopaminérgicos com células-gal nβ + e uma rica GFP + plexo axonal. E. Marcação de resultados E9.5 na rotulagem GFP substancial que é facilmente observado no colículo inferior do mesencéfalo por toda montagem de fluorescência (inset). A linhagem Wnt1 marcado em E9.5 em seções para adultos (+ β-gal, vermelho) está concentrada no colículo inferior (mesencéfalo dorsal-posterior), como visto com baixa ampliação (5x) microscopia (E). F. A 40x, seção 1 mm óptica retirado do mesencéfalo ventral na vizinhança dos neurônios dopaminérgicos com células-gal nβ + e uma rica GFP + plexo axonal. Neurônios Wnt1 derivados marcado em E8.5 E9.5 contra são progressivamente restrito de contribuir para mesencéfalo dorsal, enquanto a linhagem Wnt1 persiste em contribuir para mesencéfalo ventral.

Discussão

O sistema GIFM que temos demonstrado pode ser usado para responder a uma ampla gama de questões em uma variedade de processos celulares. Por exemplo, ratos geneticamente modificados com drivers diferentes Cre pode ser usado para atingir qualquer tipo de célula, tecido ou linhagem genética de interesse. Além disso, como o tamoxifeno pode ser administrado em nenhum momento embrionário ou pós-natal, a recombinação pode ser direcionada para qualquer fase de desenvolvimento relevantes. O controle espacial e temporal deste si...