Artigo de método

Split-Ubiquitina Yeast Membrana Baseado Two-Hybrid (MITO) do sistema: uma ferramenta poderosa para identificação de interações proteína-proteína

DOI:

10.3791/1698

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1 de fevereiro de 2010

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1Department of Biochemistry, University of Toronto, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto, 3Terrence Donnelly Centre for Cellular and Biomolecular Research (CCBR), University of Toronto

Neste artigo

Resumo

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MITO permite a detecção de interações sensíveis transitória e estável entre as proteínas que são expressas no modelo de Saccharomyces cerevisiae organismo. Tem sido aplicado com sucesso para estudar exógenos e leveduras proteínas integrais da membrana, a fim de identificar seus parceiros interagem de uma forma de alto rendimento.

Resumo

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A importância fundamental biológico e clínico de proteínas integrais da membrana solicitado o desenvolvimento de um sistema baseado em levedura para a identificação de alto rendimento de interações proteína-proteína (PPI) para as proteínas transmembrana full-length. Para este fim, nosso laboratório desenvolveu o split-ubiquitina Yeast membrana baseada Two-Hybrid (MITO) do sistema. Esta tecnologia permite a detecção sensível de interações proteína transiente e estável usando

Protocolo

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1. Informação de fundo

Interações proteína-proteína (IBP) são os blocos fundamentais que regem todos os envolvidos em processos celulares. Por conseguinte, é essencial que todas as interações são estritamente reguladas, a fim de manter a homeostase celular, como uma mudança neste equilíbrio biológico normalmente desempenha um papel na doença e transformação de células cancerígenas. Proteínas da membrana associados estão entre a classe mais importante de proteínas biologicamente como eles podem iniciar complexas cascatas de sinalização, e mediar a importação e exportação de várias moléculas, incluindo drogas, que tem sido de importância rece....

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Discussão

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MITO é o sistema de débito primeira alta que permite a identificação de interações entre proteínas de longa-metragem de membrana e citosólica ou ligada à membrana parceiros. Ela tem sido usada para estudar proteínas de membrana de uma série de organismos [3-7]. Há, no entanto, detalhes específicos que podem precisar de ser examinado para assegurar a proteína de interesse é passível de estudo com MITO.

Muitos ligada à membrana proteínas são direcionadas para a membrana plasmática através de u.......

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Divulgações

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Igor Stagljar é um co-fundador da DualSystems Biotech, Suíça.

Agradecimentos

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Gostaríamos de agradecer Edmonds Alvorada para uma leitura crítica deste manuscrito. O laboratório Stagljar é apoiado por fundos da Fundação Canadense para Inovação (CFI), o Instituto Canadense de Pesquisa em Saúde (CIHR), a Fundação do Coração e Derrame, da Sociedade Canadense do Câncer, e Novartis.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Polietileno Glicol (PEG3350)BioShop CanadaPEG335
Acetato de Lítio DihidratadoBioShop CanadaLIA001
X-Gal (5-Bromo-4-Cloro-3-Indolil-β-D-galactopiranosídeo)BioShop CanadaXGA001
N,N-dimetilformamidaBioShop CanadaDMF 451
3-amino-1,2,4-triazol (3-AT)BioShop CanadaATT124
Fosfato de sódio dibásicoBioShop CanadaSPD307
Fosfato de sódio monobásicoFisher ScientificBP329-500
ADN de esperma de salmãoVWR internationalCA80601-120
D-GlucoseBioShop CanadaGLU501
Caldo LB LENOXBioShop CanadaLBL405
Base de Nitrogênio para LeveduraBioShop CanadaYNB406
Extrato de LeveduraBioShop CanadaYEX401
PeptonaBD Biosciences211677
Bio-TriptonaBioShop CanadaTRP402
Sulfato de AdeninaBioShop CanadaADS201
L-UracilaBioShop CanadaURA241
L-TreoninaBioShop CanadaTHR002
L-HistidinaBioShop CanadaHIS200
L-MetioninaBioShop CanadaMET222
L-ValinaBioShop CanadaVAL201
L-FenilalaninaBioShop CanadaPHA302
L-IsoleucinaBioShop CanadaISO910
L-TirosinaBioShop CanadaTYR333
L-LeucinaBioShop CanadaLEU222
L-ArgininaBioShop CanadaARG006
L-TriptofanoFisher ScientificBP395-100
L-LisinaBioShop CanadaLYS101
L-AlaninaFisher ScientificBP369-100
ÁgarBioShop CanadaAGR001
Contas de Vidro de Cal SódicaBiospec Products11079105
Cloreto de SódioBioShop CanadaSLD002

Referências

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  1. Stagljar, I., Fields, S. Analysis of membrane protein interactions using yeast-based technologies. Trends Biochem Sci. 27 (11), 559-563 (2002).
  2. Iyer, K. Utilizing the split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid s....

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