Worms transgênicos são comumente usados em C. elegans Pesquisa. Descrito é um protocolo simples, mas eficaz, para introduzir transgenes em vermes usando biobalística bombardeio com partículas de DNA revestido de ouro. O esforço envolvido e os resultados do bombardeio comparam favoravelmente com microinjeção para a geração de animais transgênicos.
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Artigo de método
Geração de transgênicos C. elegans Por biobalística Transformação
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Resumo
Resumo
O número de laboratórios usando o C. nematóide de vida livre elegans está crescendo rapidamente. A popularidade deste modelo biológico é atribuído a um tempo de geração rápido e vida curta, manutenção fácil e barata, o genoma completamente seqüenciado, e matriz de RNAi recursos e animais mutantes. Além disso, a análise do C. elegans genoma revelou uma grande semelhança entre worms e vertebrados superiores, o que sugere que a pesquisa em vermes pode ser um complemento importante para os estudos realizados em ratos inteiros ou células em cultura. Uma parte poderosa e importante de pesquisa worm é a capacidade de usar animais transgênicos para estudar a localização ea função do gene. Animais transgênicos podem ser criadas através de microinjeção da linha germinativa worm ou através do uso de bombardeio biobalística. Bombardeio é uma nova técnica e é menos familiar para uma série de laboratórios. Aqui nós descrevemos um protocolo simples para gerar worms transgênicas por biobalística bombardeio com partículas de ouro usando o Bio-Rad PDS-1000 do sistema. Em comparação com a microinjeção de DNA em células germinativas hermafroditas, este protocolo tem a vantagem de não exigir habilidades especiais do operador com relação à identificação de anatomia worm ou realizar microinjeção. Além disso várias linhagens transgênicas são normalmente obtidos a partir de um único bombardeio. Também em contraste com a microinjeção, bombardeio biobalística produz animais transgênicos com ambos os arrays e extracromossómicos transgenes integrados. A capacidade de obter linhagens transgênicas integrada pode evitar o uso de protocolos mutagênico para integrar DNA estranho. Em conclusão, o bombardeio biobalística pode ser um método atrativo para a geração de animais transgênicos, especialmente para os pesquisadores não estão interessados em investir o tempo eo esforço necessário para se tornar hábil em microinjeção.
Protocolo
Visão global
Worms tradicionalmente transgênicos foram gerados por microinjecting DNA transgene no C. elegans germline 1,2,3,4. Embora bem-sucedida, esta abordagem necessários equipamentos especializados eo desenvolvimento de experiência com a anatomia verme e da técnica de microinjeção. Mais recentemente bombardeio biobalística foi desenvolvido como uma abordagem alternativa que usa partículas de DNA revestido de ouro para introduzir DNA estranho no 5,6 germinativas. Essa abordagem requer menos investimento de tempo em termos de prática para se tornar bem sucedido.
O bombardeio de....
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Discussão
Bombardeio biobalística é um método simples para introduzir DNA estranho para muitos organismos, incluindo C. elegans 1,5,6,7,16. Ele se baseia partículas de ouro formando um complexo com o DNA na presença de CaCl 2. Poliaminas catiônicas, tais como a espermidina, proteger o DNA de nuclease degradação in vivo. Desde espermidina é uma molécula instável, é importante para armazená-lo em pequenas alíquotas a -20 ° C, e fazer a solução certa antes de realizar o bombardeio. Como descrevemos no .......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por fundos de sementes da Universidade de Pittsburgh e conceder NIH AG028977 para ALF
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Partículas de ouro | Inbio gold | BD021 | 1micron |
| Kit para midiprep | Qiagen | 12143 | |
| Espermidina | Sigma-Aldrich | S4139 | |
| Protamina | Sigma-Aldrich | P4505 | |
| Macroportadores | Bio-Rad | 165-2335 | |
| Sistema PDS-1000/He Hepta | Bio-Rad | 165-2257 | |
| Disco de ruptura | Bio-Rad | 165-2330 | |
| Nistatina | Sigma-Aldrich | N1638 | |
| Streptomycin | MP Biomedicals | 100556 |
Referências
- Evans, T. C. Wormbook. , 1-15 (2006).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. , (2008).
- Mello, C., Fire, A. DNA tr....
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Reimpressões e permissões
Errata
Formal Correction: Erratum: Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation
Posted by JoVE Editors on 12/12/2012. Citeable Link.
The volume for a solution in, Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation, was incorrect.
