Para cultivar células-tronco da crista neural (NCSC) in vitro, um meio especial (NCSCM) é necessária. Parte essencial da NCSCM é extrair pinto embrião (CEE). Nós aqui descrever as técnicas precisas para produzir uma quantidade maximizada de puro e de alta qualidade CEE, incluindo detalhes como o isolamento, maceração, centrifugação, filtração e processos.
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Artigo de método
Produção de Extrato de embrião de galinha para o cultivo de células-tronco neurais murino Crest
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A crista neural surge a partir da neuro-ectoderma durante a embriogênese e persiste apenas temporariamente. Os primeiros experimentos já corrigido células progenitoras pluripotentes a ser parte integrante da crista neural 1. Fenotipicamente, as células-tronco da crista neural (NCSC) são definidos por, simultaneamente, expressando p75 (low-affine nervo receptor do fator de crescimento, LNGFR) e SOX10 durante a sua migração da crista neural 2,3,4,5. Estas células progenitoras podem se diferenciar em células musculares lisas, células cromafins, neurônios e células gliais, bem como a cartilagem melanócitos e osso 6,7,8,9. Para cultivar NCSC in vitro, um especial da crista neural meio de células-tronco (NCSCM) é necessária 10. A parte mais complexa do NCSCM é a preparação de extrato de pinto embrião (CEE), que representa uma fonte essencial de fatores de crescimento para o NCSC, bem como para outros tipos de explantes neural. Outros ingredientes NCSCM lado CEE estão disponíveis comercialmente. Produzindo CCE usando equipamentos de laboratório padrão é de grande importância para saber sobre os detalhes desafiador como o isolamento, maceração, centrifugação, filtração e processos. Neste protocolo, descrevemos técnicas precisas para produzir uma quantidade maximizada de puro e de alta qualidade CEE.
Protocolo
Os autores afirmam que experiências em animais foram realizados de acordo com as Comunidades Europeias Directiva do Conselho (86/609/CEE), seguindo as orientações do NIH sobre o cuidado e uso de animais em procedimentos experimentais e os regulamentos estabelecidos pelo animal Institucional Cuidado e Uso Committee (IACUC) da Universidade de Duisburg-Essen (Alemanha).
Parte 1: Configurando (não mostrado no vídeo)
PREPARAÇÃO DE MATERIAIS E SOLUÇÕES (antes de tomar os ovos da incubadora)
- Os ovos devem ser incubados em incubadora umidificada por 11 dias a 37 ° C (100 ° F).
- Spray de etanol 70%, placas limpas, precisas pinças limpas, 4 ° C (40 ° F) DMEM estéril frio no gelo e 60 mL seringas esterilizadas
- 50 mL tubos estéreis corning têm de ser half-filled com 4 ° C frio DMEM para misturar os embriões macerados em uma proporção de 1:1 (massa maceradas: DMEM). Assim que os ovos são retirados da dissecção da incubadora embriões de galinha tem que ser iniciado.
- Esterilizar instrumentos de dissecação em autoclave ou no dia da dissecção, mergulhe as ferramentas em etanol 70% por 20 minutos.
Parte 2: Dissecção da embriões de galinha (demonstrado no vídeo)
- Wet os ovos incubados com um spray de etanol 70% por pelo menos 30 segundos e seque-os cuidadosamente com toalhas de papel macio limpo, enquanto não apertar os ovos em excesso.
Nota: Recomendamos não dissecar mais de 60 embriões de galinha simultaneamente. - Abra os ovos com cuidado com o rápido contra uma borda afiada e retirar o embrião com cuidado de não destruir o saco vitelino ou o embrião de galinha em si.
- Pesquisa para o início do cordão umbilical de forma rápida e abrir o embrulho clara, sem destruir o saco vitelino ou qualquer vasinhos. Então dissecar o cordão umbilical com uma pinça precisa limpar.
- Leve o embrião fora do saco vitelino.
Nota: Os embriões devem ser decapitado rapidamente (não mostrado no vídeo). - Coletar os embriões em meio essencial mínimo a 4 ° C.
Parte 3: maceração do embriões de galinha
- Pegue o êmbolo de uma seringa de 60 ml estéril.
- Transferência de cerca de 10 embriões em uma seringa de 60 mL.
- Coloque o êmbolo com cuidado para a seringa para não arriscar perder o material macerado.
- Macerar empurrando o êmbolo.
- Coletar a massa maceradas nos tubos preparados corning half-filled com DMEM, na proporção de 1:1 (massa maceradas: DMEM). Usando 10 embriões um volume de aproximadamente 25 mL é produzido.
- Coloque a mistura em um agitador por 45 min a 4 ° C.
Parte 4: A centrifugação do embrião de galinha - Suspensão DMEM
- Transferir o embrião de galinha - suspensão DMEM nos tubos de centrifugação.
- Adicionar hialuronidase estéril a uma concentração de 1 mg por 25 mg de embrião.
- Tara os tubos de centrifugação com muita precisão.
Nota: Esta etapa deve ser realizada com cautela, de centrifugação é executado em alta g-force e danos materiais ou centrífuga poderia ocorrer se usar tubos de desequilibrado. Com alta precisão de acordo com peso do equipamento, quanto as três posições após o ponto decimal para todos os tubos devem ser recebidos, ajustando o montante em falta com DMEM. - Reduzir a temperatura da centrífuga a 4 ° C.
Nota: Além disso, o rotor de centrifugação deve ser armazenado em uma câmara de refrigeração ou geladeira durante a noite. - Centrífuga 6 horas pelo menos para 180,000 xgx h. Nota: Para resultados superiores em relação à separação das fases de uso único 266,000 xgx h. Se possível, use o ajuste de vácuo.
Parte 5: Filtração do Extrato de embrião de galinha
Após a centrifugação, três fases podem ser notados: A fase líquida superior dingy com fragmentos de gordura, a fase de líquidos claros no meio e do sedimento no fundo do tubo de centrifugação. Nota: vibração ou movimento rápido da mistura centrifugada tem que ser evitado, pois isso destruiria o resultado da etapa de centrifugação por perder a fase de líquido claro central.
Nota: Todos os seguintes passos devem ser realizados em condições estéreis usando um fluxo de ar laminar de bancada:
- Pipeta a fase clara líquido em um sistema de filtro com poros de 0,45 mM. Em seguida, ligue a bomba de vácuo conectada.
Nota: Não toque na pelota no fundo. Isso levaria a uma contaminação do extrato e um bloqueio do sistema de filtragem. - Transfira o extrato de pré-em um sistema de filtro com poros de 0,22 mm e ligar a bomba de vácuo ligada novamente.
- Alíquota do extrato do embrião atingido pintoestéril em tubos de 15 mL corning.
- Armazenar rapidamente as alíquotas a -80 ° C (-62 ° F). Nota: A CEE durar até dois anos se armazenado a -80 ° C.
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Discussão
Este protocolo é baseado em modificações de procedimentos que têm sido descritas 10,11 no passado. Além de publicações antigas que aqui mostram os passos individuais diferentes do processo mais expandida. Isto suporta o experimentador com detalhes importantes assegurando corretos procedimentos e resultados confiáveis. Além disso, como o processo de dissecção é uma parte essencial de extração CEE descrevemos o procedimento de tomar os embriões fora do saco vitelino em cada detalhe. Há vários pontos importantes...
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
O apoio e aconselhamento de Markus Pajtler Bohrer e Robert foram inestimáveis para a visualização deste protocolo.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ovos de galinha incubados por 11 dias | Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH | ||
| Aspersão desinfetante alcoólica | Schülke Mayr GmbH | ||
| DMEMGlutamax | GIBCO, by Life Technologies | ||
| Seringa estéril (60 ml) | BD Biosciences | ||
| Tubos estéreis (50; 15 ml) | Greiner Bio-One | ||
| Pontas de pipeta estéreis | Starlab GmbH | ||
| Hialuronidase tipo IV-S | Sigma-Aldrich | ||
| Milipore stericups estéreis (0.45; 0.22 μl) | Fisher Scientific | ||
| Pipetas estéreis (25; 10; 5 ml) | Greiner Bio-One | ||
| Centrífuga L5-50 | Tipo de rotor Ti-45 |
Referências
- Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. Cell lineage analysis reveals multipotency of some avian neural crest cells. Nature. 335, 161-164 (1988).
- Stemple, D. L., Anderson, D. J. Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest. Cell. 71, 973-985 (1992).
- Rao, M. S., Anderson, D. J. Immortalization and controlled in vitro differentiation of murine multipotent neural crest stem cells. J Neurobiol. 32, 722-746 (1997).
- Paratore, C., Goerich, D. E., Suter, U., Wegner, M., Sommer, L. Survival and glial fate acquisition of neural crest cells are regulated by an interplay between the transcription factor Sox10 and extrinsic combinatorial signaling. Cell. 128, 3949-3961 (2001).
- Kim, J., Lo, L., Dormand, E., Anderson, D. J. SOX10 maintains multipotency and inhibits neuronal differentiation of neural crest stem cells. Neuron. 38, 17-31 (2003).
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Reimpressões e permissões
