Para cultivar células-tronco da crista neural (NCSC) in vitro, um meio especial (NCSCM) é necessária. Parte essencial da NCSCM é extrair pinto embrião (CEE). Nós aqui descrever as técnicas precisas para produzir uma quantidade maximizada de puro e de alta qualidade CEE, incluindo detalhes como o isolamento, maceração, centrifugação, filtração e processos.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Produção de Extrato de embrião de galinha para o cultivo de células-tronco neurais murino Crest
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A crista neural surge a partir da neuro-ectoderma durante a embriogênese e persiste apenas temporariamente. Os primeiros experimentos já corrigido células progenitoras pluripotentes a ser parte integrante da crista neural 1. Fenotipicamente, as células-tronco da crista neural (NCSC) são definidos por, simultaneamente, expressando p75 (low-affine nervo receptor do fator de crescimento, LNGFR) e SOX10 durante a sua migração da crista neural 2,3,4,5. Estas células progenitoras podem se diferenciar em células musculares lisas, células cromafins, neurônios e células gliais, bem como a cartilagem melanócitos e osso 6,7,8,9. Para cultivar NCSC in vitro, um especial da crista neural meio de células-tronco (NCSCM) é necessária 10. A parte mais complexa do NCSCM é a preparação de extrato de pinto embrião (CEE), que representa uma fonte essencial de fatores de crescimento para o NCSC, bem como para outros tipos de explantes neural. Outros ingredientes NCSCM lado CEE estão disponíveis comercialmente. Produzindo CCE usando equipamentos de laboratório padrão é de grande importância para saber sobre os detalhes desafiador como o isolamento, maceração, centrifugação, filtração e processos. Neste protocolo, descrevemos técnicas precisas para produzir uma quantidade maximizada de puro e de alta qualidade CEE.
Protocolo
Os autores afirmam que experiências em animais foram realizados de acordo com as Comunidades Europeias Directiva do Conselho (86/609/CEE), seguindo as orientações do NIH sobre o cuidado e uso de animais em procedimentos experimentais e os regulamentos estabelecidos pelo animal Institucional Cuidado e Uso Committee (IACUC) da Universidade de Duisburg-Essen (Alemanha).
Parte 1: Configurando (não mostrado no vídeo)
PREPARAÇÃO DE MATERIAIS E SOLUÇÕES (antes de tomar os ovos da incubadora)
- Os ovos devem ser incubados em incubadora umidificada por 11 dias a 37 ° C (100 ° F).
- Spray de etanol 70%,....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Este protocolo é baseado em modificações de procedimentos que têm sido descritas 10,11 no passado. Além de publicações antigas que aqui mostram os passos individuais diferentes do processo mais expandida. Isto suporta o experimentador com detalhes importantes assegurando corretos procedimentos e resultados confiáveis. Além disso, como o processo de dissecção é uma parte essencial de extração CEE descrevemos o procedimento de tomar os embriões fora do saco vitelino em cada detalhe. Há vários pontos importantes.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
O apoio e aconselhamento de Markus Pajtler Bohrer e Robert foram inestimáveis para a visualização deste protocolo.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ovos de galinha incubados por 11 dias | Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH | ||
| Aspersão desinfetante alcoólica | Schülke Mayr GmbH | ||
| DMEMGlutamax | GIBCO, by Life Technologies | ||
| Seringa estéril (60 ml) | BD Biosciences | ||
| Tubos estéreis (50; 15 ml) | Greiner Bio-One | ||
| Pontas de pipeta estéreis | Starlab GmbH | ||
| Hialuronidase tipo IV-S | Sigma-Aldrich | ||
| Milipore stericups estéreis (0.45; 0.22 μl) | Fisher Scientific | ||
| Pipetas estéreis (25; 10; 5 ml) | Greiner Bio-One | ||
| Centrífuga L5-50 | Tipo de rotor Ti-45 |
Referências
- Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. Cell lineage analysis reveals multipotency of some avian neural crest cells. Nature. 335, 161-164 (1988).
- Stemple, D. L., Anderson, D. J. Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest. Cell. 7....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
