Neste vídeo podemos demonstrar a técnica da litografia macia com polydimethyl siloxano (PDMS) que usamos para farbricate um dispositivo micro para os neurônios cultura.
Artigo de método
Fabricação de um dispositivo micro para a compartimentação de Neuron Soma e axônios
Neste artigo
Resumo
Resumo
Neste vídeo, demonstramos a técnica da litografia macia com polydimethyl siloxano (PDMS) que usamos para fabricar um dispositivo micro para os neurônios cultura. Anteriormente, uma bolacha de silício foi modelado com o projeto para o dispositivo neurônio microfluídicos usando SU-8 e fotolitografia para criar um molde mestre, ou o que nós simplesmente nos referimos como "mestre". Em seguida, despeje o polímero de silicone PDMS em cima do mestre que é então curado pelo aquecimento do PDMS a 80 ° C por 1 hora. O PDMS forma um molde negativo do dispositivo. O PDMS é, então, cuidadosamente cortadas e levantou longe do mestre. Buracos são perfurados em que os reservatórios serão PDMS eo excesso aparadas longe do dispositivo. O nitrogênio é usado para afastar qualquer excesso de detritos a partir do dispositivo. Neste ponto os dispositivos estão prontos para usar e pode tanto ligado a Corning Glass cobrir No. 1 com um plasma esterilizador / limpador ou podem ser reversivelmente ligado à tampa de vidro, basta colocar o dispositivo na parte superior da tampa de vidro. A ligação reversível de que o dispositivo de vidro é coberto por um vídeo em separado e exige, primeiro, que o dispositivo seja esterilizado ou com álcool 70% ou em autoclave. Plasma tratar esteriliza os dispositivos de forma que nenhum tratamento adicional é necessário. É, no entanto, importante, quando plasma-tratamento dos dispositivos, para adicionar líquido para os dispositivos dentro de 10 minutos do tratamento de plasma, enquanto as superfícies são ainda hidrofílico. Esperando mais de 10 minutos para adicionar líquido para o dispositivo torna difícil para o líquido para entrar no dispositivo. Os dispositivos são tipicamente neurônio plasma obrigado a tampa de vidro e 0,5 mg / ml poli-L-lisina (PLL) em tampão borato pH 8,5 é imediatamente adicionado ao dispositivo. Após um mínimo de três horas de incubação com o PLL, os dispositivos são lavados com água dH2O um mínimo de 3 vezes, com pelo menos 15 minutos entre cada lavagem. Em seguida, a água é removida e novas mídias é adicionado ao dispositivo. Neste ponto, o dispositivo está pronto para uso. É importante lembrar, neste ponto, nunca remover toda a mídia do dispositivo. Sempre deixe a mídia no canal principal.
Protocolo
Parte 1: Preparando o dispositivo neurônio microfluídicos
- A 3 "wafer de silício com um padrão feito de SU-8 por fotolitografia é usado para lançar o Polidimetilsiloxano molde (PDMS) microfluídicos. Referimo-nos à SU-8 padrão wafer de silício como moldes mestre, ou" mestres ".
- PDMS é misturado com agente de cura em aw / w proporção de 10:1, ou seja, para 10 gramas de PDMS, 1 grama de agente de cura é adicionado a ele.
- O PDMS é então misturado bem e derramou sobre o wafer de silício. O wafer de silício é contido dentro de um prato de poliestireno de 10 centímetros de Petri. Demora cerca de 12 g a 15 g de PDMS para cobrir o mestre com uma espessura de cerca de 4 mm.
- O mestre com o PDMS é então colocada em um dessecador a vácuo com a tampa da placa de Petri, e de vácuo é aplicado. Isto é feito para ajudar a remover bolhas de ar do PDMS que foram introduzidas durante a mexer no do agente de cura. Demora cerca de 15 minutos para as bolhas de ar a ser removido.
- O mestre com PDMS é removido do dessecador. Uma pistola de ar com um filtro de 0,45 hm é usado para remover as bolhas restantes.
- O mestre é então colocado em uma placa de 80 ° C quente por uma hora para a cura.
Nota: Se um dessecador a vácuo não estiver disponível, o mestre pode ser deixado em temperatura ambiente por várias horas. As bolhas de ar eventualmente se dissipar por conta própria. Se um prato quente não está disponível, o PDMS cura à temperatura ambiente após 24 horas.
Nota: Também é importante certificar-se que o mestre é o nível durante o processo de cura.
Parte 2: Cortar o neurônio dispositivo micro
- Uma vez que o PDMS é curado no mestre, ele é levado para uma capa limpa.
- Usando uma lâmina cirúrgica, um círculo é cortado em todo o perímetro dos dispositivos. Quando alguém insere a lâmina para o PDMS, é importante fazer contato com o wafer de silício, mas para não colocar demasiada pressão sobre a bolacha, senão o mestre crack.
- Com um círculo cortado a toda a volta os dispositivos (existem 4 dispositivos por cada 3 Mestre do Silício "), o PDMS é cuidadosamente levantado do mestre. Isto pode ser iniciado por gentilmente torcendo a lâmina cirúrgica, uma vez que é inserido no corte antes .
- Em seguida, os reservatórios são perfurados para o dispositivo usando um 8 milímetros de tecido da biópsia do perfurador.
- Os dispositivos são, então, esquartejado e PDMS excesso aparado para que o dispositivo vai caber perfeitamente na tampa do Vidro de Corning (No. 1) 24 mm x 40 mm. Nitrogênio do ar é usado para afastar qualquer excesso de detritos. Os restos teimosos também pode ser removido usando 3M Scotch Marca fita de vinil 471.
Parte 3: Plasma ligação a dispositivos para lamínulas de vidro.
- Cleaner plasma é usado para colar A Harrick os dispositivos neurônio para o lamínulas. Resumidamente, os dispositivos são colocados no limpador de plasma e uma bomba de vácuo é usada para evacuar o ar da câmara.
- Após a pressão de vácuo atingiu 300 milliTorr, o poder está ligado à bobina elétrica e ajustada para alta.
- A bobina elétrica cria um plasma ", um gás parcialmente ionizado constituído de elétrons, íons e átomos ou moléculas neutras" - http://www.harrickplasma.com/plasma_physics.php , fora das moléculas de ar remanescente na câmara. O plasma gera espécies reativas na superfície do vidro e do dispositivo, que quando colocados juntos formam uma ligação permanente. O plasma também torna as superfícies hidrofílicas, o que ajuda a facilitar a adição de líquidos. Além disso, o aspirador de plasma esteriliza os dispositivos.
A superfície do PDMS dispositivo que contém o dispositivo micro é colocado virado para cima no limpador de plasma, juntamente com as lâminas de vidro.
Superfícies a plasma tratado do vidro e dispositivo micro são montados em contato uns com os outros em uma bancada limpa e, em seguida colocado em pratos estéril 60 mm. As superfícies tratadas formar uma ligação apertada irreversível. - Dentro de 10 minutos de plasma de ligação a dispositivos de vidro, Poly-L-lisina (PLL) é adicionado para o dispositivo. Após 10 minutos, a hidrofilicidade do dispositivo irá diminuir o que torna difícil para o PLL para entrar no dispositivo.
Nota: É importante verificar se há bolhas de ar no dispositivo após a adição de PLL. Bolhas de ar no canal principal são indesejáveis, como eles oxidam as células. Um método fácil de remover quaisquer bolhas de ar existentes é a utilização de uma pipeta P200 cheio com 150 ul de líquido (neste caso PLL), coloque a ponta diretamente na abertura do canal principal, e pressione o P200 com força. Este pode ter de ser repetido várias vezes, mas acabou a força da pipeta irá conduzir as bolhas para fora. - Dispositivos que contêm PLL estão autorizados a incubar durante a noite em um padrão de cultura de tecidos incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2.
- No dia seguinte, o devícios são lavadas duas vezes rapidamente com dH2O autoclavado. Durante este processo, o líquido nunca é totalmente removido os canais principais, apenas a partir dos reservatórios. Remover líquido de os principais canais irá introduzir bolhas. Após 2 lavagens rápidas, os dispositivos são preenchidos com dH2O autoclavados e colocados de volta na incubadora por um período mínimo de 3 horas, ou durante a noite.
- No dia seguinte, os dispositivos são novamente lavados duas vezes rapidamente com dH2O autoclavado. Então, media neural basal, contendo os suplementos necessários B27 e Glutamax para os neurônios de cultura primária de ratos, é adicionado aos dispositivos. Os dispositivos são colocados de volta na incubadora para uso futuro. Os dispositivos estão prontos para a semeadura de neurônios.
Discussão
Neste vídeo demonstramos como fazer e preparar um PDMS dispositivo micro que usamos para os neurônios cultura pol O dispositivo permite a obtenção de uma fração pura axonal separados por microgrooves do compartimento contendo uma mistura de corpos celulares, dendritos e axônios . Estes dispositivos permitem ao pesquisador estudar os efeitos de vários tratamentos, bem como fornecer uma plataforma para realizar dano físico no axônios e observar os efeitos que estes tratamentos têm sobre os neurônios. O dispositivo também fornece um nível de cultura a fim de neurônios que ajuda a facilitar os estudos de transportes. Além disso, o microgrooves, que separam o compartimento de cultura de células do compartimento do axônio, permite o isolamento do fluídica entre os dois compartimentos tornando possível tratar uma parte lateral do dispositivo sem afetar o outro lado do dispositivo diretamente com o tratamento. Esta propriedade permite ao pesquisador estudar os efeitos, como transdução de sinal e transporte que resultam do tratamento.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários | |
|---|---|---|---|---|
| PDMS | Reagente | Dow Corning | Sylgard 184 com agente de cura. Consulte a Dow Corning para encontrar um fornecedor próximo a você | |
| Limpeza por Plasma | Ferramenta | Harrick Scientific Products, Inc. | http://www.harrickplasma.com/ | |
| Meio Neural Básico | Reagente | Invitrogen | 21103-049 | O Meio Neural Básico é obtido pela Invitrogen em sua linha Gibco de reagentes para cultura celular. |
| B27 | Reagente | Invitrogen | 17504-044 | O B27 é um suplemento proprietário disponível pela Invitrogen em sua linha Gibco de reagentes para cultura celular. |
| Glutamax | Reagente | Invitrogen | 35050-061 | O Glutamax está disponível pela Invitrogen em sua linha Gibco de reagentes para cultura celular. |
| Vidro de Cobertura Corning No. 1 | vidro de cobertura | Corning | Corning No. X2935 244 | Disponível pela Fisher Scientific, número do catálogo Fish 12-531D |
| Placa de Petri de 60 mm | Ferramenta | Fisher Scientific | 08-757-13A | Placas de Petri estéreis de poliestireno de 60 mm são usadas para acomodar o dispositivo ligado ao vidro. |
| Tubo BD Falcon de 50 ml | Ferramenta | BD Biosciences | Falcon No. 352098 | Disponível pelo catálogo da Fisher Scientific número 14-959-49A |
| Tubo BD Falcon de 15 ml | Ferramenta | BD Biosciences | Falcon No. 352097 | Disponível pelo catálogo da Fisher Scientific número 14-959-70C |
| Poli-L-Lisina | Reagente | Sigma-Aldrich | P-1274 | |
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Referências
- Park, J. W., Vahidi, B., , A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 1, 2128-2136 (2006).
- Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, 599-605 (2005).
Reimpressões e permissões
