Quantificar os níveis de HIV-1 RNA no plasma e seqüenciamento única HIV-1 genomas de indivíduos com carga viral abaixo do limite de detecção (50-75 cópias / ml) é difícil. Aqui nós descrevemos como extrair e quantificar RNA viral no plasma usando um ensaio de PCR em tempo real, que de forma confiável medidas HIV-1 RNA até 0,3 cópias / ml e como amplificar genomas virais por seqüenciamento do genoma único, a partir de amostras com cargas virais muito baixas.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Amplificar e Quantificação do HIV-1 RNA no indivíduos infectados pelo HIV com carga viral abaixo do limite de detecção pela Standard Ensaios Clínicos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Amplificar genes virais e quantificar HIV-1 RNA do HIV-1 indivíduos infectados com cargas virais abaixo do limite de detecção por ensaios padrão (abaixo de 50-75 cópias / ml) é necessário ter uma visão para a dinâmica viral e interações hospedeiro do vírus em pacientes que naturalmente controlar a infecção e aqueles que estão em terapia anti-retroviral combinada (TARC).
Aqui nós descrevemos como para amplificar genomas virais por uma única seqüenciamento do genoma (o protocolo SGS) 13, 19 e como quantificar com precisão HIV-1 RNA em pacientes com baixa carga viral (a cópia de um único ensaio (SCA) protocolo) 12, 20.
O ensaio de um único exemplar é um real-time PCR com sensibilidade, dependendo do volume de plasma sendo ensaiadas. Se um genoma único vírus é detectado em 7 ml de plasma, então o número de cópias de RNA é de 0,3 cópias / ml. O ensaio tem um teste de controlo interno para a eficiência de extração de RNA, e controles para a amplificação de DNA ou possível contaminação. Amostras de pacientes são medidos em triplicata.
O seqüenciamento do genoma de um único ensaio (SGS), hoje amplamente utilizado e considerado como não-trabalho intensivo 3, 7, 12, 14, 15, é um ensaio por diluição limitante, em qual ponto de extremidade produto diluído cDNA é espalhada sobre uma de 96 poços prato. De acordo com uma distribuição de Poisson, quando menos de 1 / 3 dos poços dão produto, há uma chance de 80% resultante do produto de PCR de amplificação sendo a partir de uma única molécula de cDNA. SGS tem a vantagem sobre a clonagem de não ser submetido a reamostragem e não ser influenciada por PCR-introduzido recombinação 19. No entanto, o sucesso de amplificação da SCA e SGS dependem desenho de primers. Ambos os ensaios foram desenvolvidos para HIV-1 subtipo B, mas pode ser adaptado para outros subtipos e em outras regiões do genoma de primers mudando, sondas, e padrões.
Protocolo
1. Extração de RNA a partir de grandes volumes de plasma
Uma visão geral do ensaio de cópia única (SCA) eo único seqüenciamento do genoma (SGS) protocolo são fornecidos nas Figuras 1 e 2.
- Para obter 7 ml de plasma, spin aproximadamente 14 ml de sangue foram coletadas em 15 ml de EDTA (não heparina) tubos de coleta a 2.600 xg por 15 minutos sem travões. Pipeta plasma (certificando-se de evitar a camada de revestimento buffy) em tubos de 15 ml.
- Se RNA está sendo extraído para o ensaio de cópia única (SCA), pico do plasma com 30 mil cópias do vírus Rous Sarcoma controle virion interna (ACR). O vírus RCAs é preparado antes de realizar SCA, conforme descrito anteriormente (20). Resumidamente, RCAs vírus de sobrenadante de cultura celular é quantificada pela atividade RT, diluído para uma concentração final de 30.000 virions por 200 ul, diluída em meio de cultura RPMI tecido com FBS 5%, e armazenadas a -80 ° C em alíquotas de uso único. O vírus RCAs não devem ser congelados / descongelados antes da sua utilização no ensaio. RCAs é cravado no plasma do paciente para controlar a eficiência da extração de RNA e para a precisão da quantificação do PCR. Mais informações sobre RCAs pode ser encontrado no seguinte link: http://home.ncifcrf.gov/hivdrp/RCAS/ .
- "Spin-Pre" plasma, em 15 ml tubos de centrífuga cônico, a 2.600 xg por 15 minutos para separar as lipídeos e restos celulares, que podem interferir com a quantificação do RNA precisas.
- Rótulo Seton Easy-Seal tubos de centrífuga com um marcador permanente para identificar o número da amostra e o local onde o pellet formarão no tubo. Após o giro pré-, transferência de plasma para um tubo Seton Seal Easy-centrífuga por pipetagem do plasma e evitando quaisquer detritos celulares e / ou lipídios na superfície. Registrar o volume de entrada de plasma.
- Adicionar Tris-buffered saline (TBS) para preencher o volume restante do tubo Seal Seton-Fácil para o fundo da garganta threaded. Certifique-se que nenhuma bolha estão presentes no tubo ou o tubo entrará em colapso na ultracentrífuga. Certifique-se que a marca nos tubos é virada para fora quando colocar os tubos no rotor.
- Seal com re-utilizáveis bonés e amostras em um lugar pré-resfriado T1270 rotor Sorval e centrifugar na ultracentrífuga Sorval 90SE em 170.000 xg (50.000 rpm) a 4 ° C por 30 min.
- Após a centrifugação remover o sobrenadante e adicionar 90 ul de água de grau molecular e 10 ul-proteinase K (20 mg / ml) para o pellet viral (este não será visível).
- Colocar os tubos no banho-maria a 55 ° C e incubar por 30 minutos. Certifique-se que os tubos são fixados em um ângulo de modo que o lado com o pellet está imerso na mistura de proteinase K e água.
- Após a incubação, logo girar o tubo em uma centrífuga de mesa para recolher todo o líquido na parte inferior do tubo (cerca de 5 segundos) e adicionar 315 ul da solução de tiocianato guanidinium 6M e 10 ul de 20 de glicogênio mg / ml (Nota: Siga apropriado diretrizes disposição para este material perigoso, não se misturam com lixívia ou ácidos e dispor em recipiente separado).
- Vortex levemente e gire em breve (de cerca de 5 segundos). Incubar por 10 minutos em temperatura ambiente e depois transferir o conteúdo de cada tubo para um recém-rotulados 1,5 ml RNAse tubos de centrífuga grátis.
- Adicionar 495 ul de álcool isopropílico grau molecular a cada tubo vortex, por 10 segundos e centrifugar a 21.000 xg por 30 minutos em temperatura ambiente.
- Elimine o sobrenadante e adicionar 500 ul de etanol 70%.
- Vortex por 10 segundos e centrifugar a 21.000 xg por 15 minutos em temperatura ambiente. Remover etanol com uma pipeta. Girar novamente e remover quaisquer etanol residual com uma pipeta. Ar seco por 10 minutos. (Para o protocolo SGS dissolver RNA em 40 ul de 5 mM Tris-HCl pH 8,0, e continuar com o protocolo SGS).
- Dissolver pellet em 55 ul de RNA-buffer. RNA-tampão é obtida pela adição de 10 ul de 100 mM DTT e 25 ul de 40 Rnasin U / ul para 965 ul Tris-HCl (pH 8,0, 5 mM). Colocar no gelo.
2. O ensaio de cópia única
A placa de 96 poços detém 8 amostras de pacientes incluindo HIV e padrões RCAs e controles. Este protocolo irá descrever o set-up de uma única chapa.
- Comece por preparar duas alíquotas de 1 ml de RNA-buffer no qual o RNA HIV-1 RNA e transcrições RCAs será diluído para as curvas de RNA padrão. RNA-buffer é descrito em 1.13.
- Preparar diluições no gelo em dois tubos de centrífuga ml. Faça log-meia diluições de transcrições HIV-1 RNA no RNA-buffer adicionando 25 ul do HIV-1 RNA de ações (1x10 6 cópias / ul) a 54 ul RNA-buffer dando 3x10 5 cópias / ul.
- Continue fazendo consecutivos meia log-diluições (25 + 54 ul ul) até 0,3 cópias por 10 ul (Nota: 0,3, 1 e 3 diluições não será uma parte da curva padrão durante a análise para estes são usados como valores de extrapolação e deve ser definido como dur incógnitasing análise). Transcrições RCAs são estocados em 1x10 6 cópias / ul. Da mesma forma, prepare meia log-diluições de transcrições RCAs no RNA-buffer, mas até 100 cópias por 10 ul.
- Prepare o coquetel RT para a síntese de cDNA, conforme listado na Tabela 1. Prepare RT e reações NRT conforme listado na Tabela 1 tendo em mente para tornar-se um pouco mais para dar conta por qualquer perda que possa ocorrer durante a transferência. Nota: para o cocktail NRT, a enzima RT é substituída por água para controlar a amplificação de DNA.
Nota: Esta etapa foi recentemente automatizados, além de placa configurada em um robô Qiagen (originalmente Corbett). - Configure a placa de 96 poços ópticos (como mostrado na Figura 3), pela adição de 20 ul da RT mistura de reação a cada poço. Na 8 poços chamado "NRT," adicione o cocktail sem a transcriptase reversa (NRT mistura de reação). Depois de adicionar os coquetéis à placa, adicionar 10 ul de água para poços rotulados como "Sem controles de modelo (NTC)". Adicionar 10 ul de transcrições HIV aos poços rotulados como "HIV" em concentrações mostrado na Figura 3. Adicionar 10 ul de transcrições RCAs de poços chamado "RCAs" em concentrações de acordo. Adicionar 10 ul da amostra do paciente no 3 poços adjacentes rotulados como "amostra" no diagrama da placa. Adicionar 10 ul da amostra eluída aos poços chamado "NRT." Adicionar 5 ul de uma mesma amostra e 5 ul de água aos poços chamado "controle interno".
- Selar a placa e executado em termociclador em: 25 ° C por 15 minutos, 42 ° C por 40 minutos, 85 ° C por 10 minutos, 25 ° C por 30 minutos, e 5 ° C espera.
- Prepare mestre PCR mistura de acordo com a Tabela 2.
- Quando a síntese de cDNA é concluída, se deslocar para uma área designada para a utilização de cDNA. Nesta área designada, adicionar 20 ul da master mix de PCR para cada poço da placa de cDNA para ambos HIV e RCAs. É importante realizar essa etapa em uma área designada para evitar qualquer possível contaminação.
- Placa de giro, com selo ABI ou Roche capa Optical e cobrir com cobertor óptico (cobertor necessário apenas para ABI 7700). Executado em Roche 480 ou ABI 7700. PCR Condições: 95 ° C por 10 minutos, em seguida, 45 ciclos de 95 ° C por 15 segundos, 60 ° C por 1 min. Análise separada é necessária para RCAs e HIV. Exemplos de resultados são mostrados na Figura 4. A inclinação da curva padrão será afetado por uma distribuição de Poisson normal de transcrições baixo número de cópias. A fim de garantir a inclinação mais precisa para a curva padrão, estas normas baixo número de cópia (0,3, 1 e 3 cópias) são definidas como "incógnitas" 17.
3. Único Genome Sequencing
- síntese de cDNA. Adicionar 5 ul de 10 mM dNTPs e 5 ul do 2 mM gene específico primer (pol ou env) para um bem em uma placa de PCR 96 poços (BioRad). Adicionar 40 ul do RNA extraído. Placa de vedação.
- Desnaturar a RNA-mistura em termociclador a 65 ° C por 10 min.
- Misturar os reagentes para a síntese de cDNA, listadas na Tabela 3. Após a etapa de desnaturação, coloque a placa PCR em gelo, adicione o ul 50 da mistura de cDNA para cada amostra.
- Executar PCR placa no termociclador: 45 ° C por 50 min, 85 ° C por 10 min e 4 ° C segurar.
- Primeira PCR, 10 reações ul. Prepare a mistura de reação de PCR em uma bandeja de reagentes usando os primers para amplificação primeira rodada de p6-rt ou env (reagentes listados na Tabela 3, primers listados na Tabela 5).
- Com uma pipeta multi-canal de dispensar 8,0 ul de mistura para PCR 73 poços na PCR de 96 poços da placa (70 amostras e 3 controles negativos).
- Após a síntese de cDNA é completado mover a placa de cDNA e PCR PCR contendo mistura de reacção a uma área designada para a utilização de cDNA. Na área designada, adicionar 40 ul de Tris-HCl pH 8,0 a cada amostra de cDNA elevando o volume final de 140 ul. Adicionar 2,0 ul de cDNA para cada um dos poços 70 e 2,0 ul de água para cada um dos controles negativos. Seal placa PCR. Executado em termociclador, programa na Tabela 4.
- Nested PCR - Reacções 20ul. Misturar os reagentes para a PCR nested na bandeja de reagentes (reagentes listados na Tabela 3, primers listados na Tabela 5).
- Adicionar 18 ul da mistura de PCR nested para 73 poços em uma placa PCR de 96 poços, com uma pipeta multicanal
- Diluir primeira PCR 1:5 e adicionar 2 ul da primeira rodada de PCR para a PCR nested. Executar PCR reação no termociclador, sob as condições listadas na Tabela 4.
- Executar amostras em um gel de agarose 1%. Para garantir que a maioria dos produtos de PCR são o resultado de uma única molécula de cDNA, não mais que 30% dos poços devem ser positivas. O processo foi automatizado usando o Beckman Coulter Biomek FM robô para carregar o conteúdo das placas PCR de 1%, 96 poços de E-gel (Invitrogen). E-gel são executados por 7 minutos na E-base. Produtos seqüência usando primers listados na Tabela 5.
4. Resultados representativos:
SCA:
Todos os controles devem passar a fim de considerar o HIV-1 RNA medição correta. Se um controle negativo é positive, a corrida deve ser desconsiderada por causa da contaminação possível. A fim de controlar as perdas de RNA durante a etapa de extração, pelo menos, 50% dos RCAs cravado no plasma deve ser recuperado. Se a média é de RCAs <15.000 cópias, a amostra falha e deve ser desconsiderada, pois uma quantidade significativa de RNA poderia ter sido perdidas durante a extração ou outras etapas do protocolo. Isso ocorre em cerca de 10% de todas as amostras de pacientes testados provavelmente devido a elevadas concentrações de gordura no plasma 6. A recuperação do vírus RCAs serve para controlar a qualidade da extração e da eficiência da síntese de cDNA e amplificação por PCR. Ela não é usada para corrigir HIV recuperação desde o HIV é provavelmente ligados às imunoglobulinas e outras proteínas humanas tornando-o um pouco diferente do vírus isolado de cultura de tecidos. A recuperação da RCA em nosso laboratório foi, em média, 25.716 + / - 4.057 cópias / mistura de reação, ou cerca de 95% + / -15% do RNA RCAs adicionou 17. A NRT controle (sem transcriptase reversa) é executado em paralelo a fim de testar para a amplificação de DNA. O valor é subtraído do NRT cada um dos três valores HIV-1 RNA, a média é calculada e se este número é inferior a zero (a amplificação do DNA excede a amplificação de RNA), o resultado seria um fracasso e deve ser desconsiderado, pois de risco de amplificação de DNA, em vez de RNA. Se o HIV-1 RNA é apenas amplificado a partir de 1 / 3 poços, re-teste da amostra é recomendado para garantir que a amplificação é verdadeira para a amostra real que está sendo analisada e não devido a um contaminante possível.
Se todos os controles de passagem, a média HIV-1 no número de cópias de RNA no plasma pode ser calculada.
Exemplo 1: Se a média HIV-1 no número de cópias é zero, o limite de detecção é calculado com base no volume de plasma ensaiadas. Como exemplo, digamos 7 ml de plasma foi ensaiada. A menor quantidade de RNA que poderiam ter sido detectados com este ensaio teria sido uma cópia em um dos poços e 0 cópias nos dois outros poços que dá uma média de 0,33 exemplares por bem. O número de cópias média, então tem de ser multiplicada por um fator de 5,5 para chegar ao número total de cópias na eluição RNA (há 10 ul de cada bem, mas o volume de eluição total foi de 55 ul). O limite inferior de detecção é então: 5,5 x 0,33 dividido por cópias 7ml = 1,83 / 7 = 0,3 cópias / ml. A concentração de HIV-1 RNA no plasma neste exemplo foi <0,3 cópias / ml.
Exemplo 2: HIV-1 RNA é detectável. RNA foi extraído de 7 ml de plasma. O número de cópias média de HIV-1 RNA por poço é calculado para ser 2.0 cópias por bem. Em seguida, o número de cópias médio por ml de plasma é de 5,5 x 2,0 cópias / 7 ml = 1,6 HIV-1 RNA / ml de plasma.
Um modelo de folha de Excel usado para calcular números cópia pode ser baixado do site.
SGS:
Se um dos controles negativos é positivo a longo deve ser desconsiderada devido à possível contaminação. O número de produto de cada execução vai depender da carga viral em cada amostra e as condições da amostra. Em nossa experiência um monte de lipídios no plasma ou células irá reduzir a chance de obtenção do produto. Armazenar e condições de congelamento e descongelamento anterior da amostra também influencia a recuperação de RNA muito. Em geral, quando se trabalha com amostras com carga viral abaixo das 50 cópias / ml, produto (bandas em gel) é esperado em cerca de 1 / 3 -1 / 2 das amostras processadas. Dependendo dos fatores acima mencionados, 1-5 bandas por placa deve ser considerado um bom resultado, devido à baixa carga viral nestes pacientes.
| síntese de cDNA (RT Cocktail / reação cDNA) | Uma reação | Não transcriptase reversa (NRT) cocktail / reação de cDNA (1 reação) |
| Molecular Grau H 2 O | 8,1 ul | 8,2 ul |
| 25 mM MgCl 2 | 6 ul | 6 ul |
| 25 mM dNTPs | 0,6 ul | 0,6 ul |
| 100 mM DTT | 0,2 ul | 0,2 ul |
| Hexâmeros aleatória (0,1 ug / ul) | 1,5 ul | 1,5 ul |
| Tampão 10X TaqMan A | 3,0 ul | 3,0 ul |
| Rnasin (40 U / uL) | 0,5 ul | 0,5 ul |
| Strategene RT (200 U / ul) | 0,1 ul | Não adicione |
| Total | 20 ul | 20 ul |
| Amostra de RNA | 10 ul | 10 ul |
| Volume total | 30 ul | 30 ul |
Tabela mixt Reação 1.mentos para a síntese de cDNA em Ensaio de cópia única.
| PCR Master Mix | Uma reação | Primers |
| H 2 O | 15,1 ul | HIV Primer Encaminhar 5'-CATGTTTTCAGCATTATCAGAAGGA-3 ' |
| Tampão de Ouro 10X PCR | 2,0 ul | HIV Primer reverso 5'-TGCTTGATGTCCCCCCACT-3 ' |
| 25 mM MgCl 2 | 2,0 ul | HIV Probe5'FAM-CCACCCCACAAGATTTAAACACCATGCTAA TAMRA-3 ' |
| * Primer Forward (100 um) | 0,3 ul | |
| * Primer Reversa (100 um) | 0,3 ul | RCAs Encaminhar Primer5'-GTCAATAGAGAGAGGGATGGACAAA-3 ' |
| * Probe (100 um) | 0,05 ul | RCAs reverssa Primer5'-TCCACAAGTGTAGCAGAGCCC-3 ' |
| TaqGold (5 U / ul) | 0,25 ul | RCAs Probe 5'FAM-TGGGTCGGGTGGTCGTGCC TAMRA-3 ' |
| Total | 20,0 ul |
Tabela 2. PCR master mix e primers para Ensaio de cópia única.
| cDNA cocktail / cDNA reações | Uma amostra de RNA | Cocktail primeira PCR | 1 prato (75 reações) | Cocktail PCR Nested | 1 prato (75 reações) |
| 10X tampão RT (Invitrogen) | 10 ul | 10X tampão de PCR (Invitrogen) | 75 ul | Tampão PCR 10X | 150 ul |
| 25 mM MgCl 2 | 20 ul | 50 mM MgSO 4 | 30 ul | 50 mM MgSO 4 | 60 ul |
| 0,1 M DTT | 1 ul | 10 mM dNTPs | 15 ul | 10 mM dNTPs | 30 ul |
| RNase água | 17,5 ul | 50 primers uM (bis) | 3 ul | 50 primers uM (bis) | 6 ul |
| Rnase-Out (Invitrogen) | 1 ul | Platinum Taq Hi Fi Enzyme (Invitrogen) | 6 ul | Platinum Taq Hi Fi Enzyme (Invitrogen) | 12 ul |
| Sobrescrito III (200 U / ul) (Invitrogen) | 0,5 ul | Molecular-grade água | 468 ul | Molecular-grade água | 1086 ul |
Tabela 1. CDNA e misturas de PCR para seqüenciamento do genoma único.
| P6-RT 1 programa PCR | Env um programa de PCR |
| 1. 94 ° C por 2 minutos | 1. 94 ° C por 2 minutos |
| 2. 94 ° C por 30 segundos | 2 0,94 ° C por 30 segundos |
| 2 0,94 ° C por 30 segundos | 3. 52 ° C por 30 segundos |
| 4. 72 ° C por 1 minuto e 30 segundos | 4. 72 ° C por 1 minuto |
| 5. Ir para n º 2, 44 ciclos | 5. Ir para n º 2, 44 ciclos |
| 6. 72 ° C por 3 minutos | 6. 72 ° C por 3 minutos |
| 7. 4 ° C segurar | 7. 4 ° C segurar |
| P6-RT 2 programa de PCR | Env 2 PCR programa |
| 1. 94 ° C por 2 minutos | 1. 94 ° C por 2 minutos |
| 2. 94 ° C por 30 segundos | 2. 94 ° C por 30 segundos |
| 3. 55 ° C por 30 segundos | 3. 56 ° C por 30 segundos |
| 4. 72 ° C por 1 minuto | 4. 72 ° C por 45 segundos |
| 5. Ir para # 1, 40 (41 ciclos no total) | 5. Ir para # 1, 40 (41 ciclos no total) |
| 6. 72 ° C por 3 minutos | 6. 72 ° C por 3 minutos |
| 7. 4 ° C segurar | 7. 4 ° C segurar |
Tabela 4. Condições Termociclador para o ensaio único Genome Sequencing.
| Reação | Cartilha | Seqüência |
| P6-RT cDNA | 3500 - | "CTATTAAGTATTTTGATGGGTCATAA 3 '5 |
| env cDNA | E115- | 5'AGAAAAATTCCCCTCCACAATTAA 3 ' |
| P6-RT 1. PCR | 3500 - | "CTATTAAGTATTTTGATGGGTCATAA 3 '5 |
| P6-RT 1. PCR | 1849 + | 5 'GATGACAGCATGTCAGGGAG 3' |
| P6-RT2.PCR | 1870 + | 5 'GAGTTTTGGCTGAGGCAATGAG 3' |
| P6-RT 2.PCR | 3410 - | "CAGTTAGTGGTATTACTTCTGTTAGTGCTT 3 '5 |
| env 1. PCR | E115- | 5'AGAAAAATTCCCCTCCACAATTAA 3 ' |
| env 1. PCR | E20 + | 5'GGGCCACACATGCCTGTGTACCCACAG 3 ' |
| env 2. PCR | E30 + | 5'GTGTACCCACAGACCCCAGCCCACAAG3 ' |
| env 2. PCR | E125- | 5'CAATTTCTGGGTCCCCTCCTGAGG 3 ' |
| P6-RT seqüenciamento | 2030 + | 5'TGTTGGAAATGTGGAAAGGAAGGAC 3 ' |
| P6-RT seqüenciamento | 2600 + | 5'ATGGCCCAAAAGTTAAACAATGGC3 ' |
| P6-RT seqüenciamento | 2610 - | 5'TTCTTCTGTCAATGGCCATTGTTTAAC3 ' |
| P6-RT seqüenciamento | 3330 - | 5'TTGCCCAATTCAATTTTCCCACTAA 3 ' |
| env seqüenciamento | E30 + | 5'GTGTACCCACAGACCCCAGCCCACAAG3 ' |
| env seqüenciamento | E125- | 5'CAATTTCTGGGTCCCCTCCTGAGG 3 ' |
Tabela 5. Primers para o ensaio único Genome Sequencing.
Figura 1. Visão geral do Ensaio Singe Genome Sequencing (SGS).
Figura 2. Visão geral do Ensaio de cópia única (SCA).
Figura 3. Placa de set-up para o ensaio de cópia única.
Figura 4. Captura de tela da ABI 7700. A. mostrando o HIV-1 RNA curva padrão com as amostras dos doentes e B. mostrando RCAs curva padrão com as amostras do paciente spiked.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
HIV-1 indivíduos infectados em tratamento antiretroviral combinada (TARC) ou que naturalmente controlar a infecção têm cargas virais muito baixas, normalmente cerca de 1 cópia por ml de plasma 4, 11, 12, 17, 18. Carga viral em pacientes com controle natural, muitas vezes oscilam em torno de um conjunto individual ponto 1, 2, 17. A sensibilidade dos ensaios aqui descritos é altamente dependente do volume de entrada de plasma. Geralmente, temos vindo a trabalhar com 7 ml de plasma, mas os resultados ...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Os autores gostariam de reconhecer os pacientes que participaram nos estudos de muitos de HIV-1.
JMC era um professor da pesquisa da Sociedade Americana de Câncer com o apoio da FM Kirby Foundation.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comentários |
| Hexâmeros aleatório (500 ug / ml) | Promega | C118A | |
| Taqman Um buffer | Applied Biosystems | 4304441 | |
| RNAsin (40 U / ul) | Promega | N211B | |
| RT enzima (200 U / ul) | Strategene | 600107-51 | |
| AmpliTaq DNA polimerase Ouro | Applied Biosystems | 4311814 | 6-pack |
| AmpliTaq 10XGold tampão de PCR II | Applied Biosystems | 4311814 | vem com a enzima |
| Magnesiumcloride 25 mM | Applied Biosystems | 4311814 | vem com a enzima |
| 1M Tris-HCl, pH 8,0, 5 mM | Invitrogen | AM9855G | |
| Sobrescrito III enzima transcriptase reversa, 200 U / ul | Invitrogen | 18080-044 | |
| Sobrescrito III tampão 10X | Invitrogen | vem com a enzima | |
| DTT 100 mM | Invitrogen | vem com a enzima | |
| Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity 5 U / ul | Invitrogen | 11304-102 | |
| 10X High Fidelity PCR buffer | Invitrogen | 11304-102 | vem com a enzima |
| Proteinase-K 20 mg / ml | Ambion | 2546 | |
| Guanidinium solução de tiocianato de 6M | FlukaBiochemica | 50983 | |
| Glicogênio 20 mg / ml | Roche | 10901393001 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 19516 | |
| Etanol 70% | Sigma-Aldrich | E702-3 | |
| Água de grau molecular | Gibco / Invitrogen | 10977-015 | |
| dNTPs (25 mmol cada) | Bioline | BIO-39025 |
| Nome do euipment | Companhia | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubos Seal fácil Centrífuga (16x73mm) | Seaton Scientific | 6041 | |
| Delrin branco coroas | Seaton Scientific | 4020 | Tampões para os tubos de Seal Fácil |
| Rack de tubos para Optiseal Bell-Top Tubos, 8,9 ml | Beckman | 361642 | |
| Motorista Hex ½ abertura inc | Seaton Scientific | 4013 | |
| cap tupe remoção | Seaton Scientific | 4014 | |
| 5 ml pipetas sorológicas | Costar | 4051 | |
| Pipetboy | qualquer | ||
| 15 pipetas de transferência ml | ISC Bioexpress | P-5005-7 | |
| 5,8 ml Dispossable pipetas de transferência, de ponta fina | VWR | 14670-329 | |
| 15 ml tubos de centrífuga | Falcão | ||
| Uma centrífuga de tubos de ml | qualquer | ||
| Tampão Tris comprimidos Saline | Sigma-Aldrich | T5030-100TAB | |
| Ultracentrífuga e rotor | Sorval | 90SE e T-1270 | |
| Placas de 96 poços PCR | Biorad | HSS-9601 | |
| 50 ml de reservatório de reagente | Costar | 4870 | |
| Microamp óptico de 96 poços da placa de reacção | Applied Biosystems | N801-0560 | |
| Placa óptica cobre | Applied Biosystems | 4333183 | |
| MicroAmp Pad Compression Optical | Applied Biosystems | 4312639 | |
| MicrosealUm filme | Biorad | MSA-5001 | |
| Dois tubos de centrífuga ml | Qualquer | ||
| Géis de agarose 1% (E-gel, invitrogen) | Invitrogen | G-7008-01 | |
| E-base (Invitrogen) | Invitrogen | EB-M03 |
Tubos EDTA Colecção qualquer marca
Referências
- Amara, R. R., Villinger, F., Altman, J. D., Lydy, S. L., O'Neil, S. P., Staprans, S. I., Montefiori, D. C., Xu, Y., Herndon, J. G., Wyatt, L. S. Control of a mucosal challenge and prevention of AIDS by a multiprotein DNA/MVA vaccine. Vaccine. 20, 1949-1955 (2002).
- Dinoso, J., Kim, S., Blankson, J., Siliciano, R. F. Viral Dynamics of Elite Suppressors in HIV-1 Infection. Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. , (2008).
- Dinoso, J. B., Kim, S. Y., Wiegand, A. M., Palmer, S. E., Gange, S. J., Cranmer, L., O'Shea, A., Callender, M., Spivak, A., Brennan, T., Kearney, Treatment intensification does not reduce residual HIV-1 viremia in patients on highly active antiretroviral therapy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9403-9408 (2009).
- Doria-Rose, N. A., Klein, R. M., Manion, M. M., O'Dell, S., Phogat, A., Chakrabarti, B., Hallahan, C. W., Migueles, S. A., Wrammert, J., Ahmed, R., Nason, M., Wyatt, R. T., Mascola, J. R., Connors, M. Frequency and phenotype of human immunodeficiency virus envelope-specific B cells from patients with broadly cross-neutralizing antibodies. J. Virol. 83, 188-199 (2009).
- Dornadula, G., Zhang, H., Uitert, B. V. an, Stern, J., Livornese, L., Ingerman, M. J., Witek, J., Kedanis, R. J., Natkin, J., DeSimone, J., Pomerantz, R. J. Residual HIV-1 RNA in blood plasma of patients taking suppressive highly active antiretroviral therapy. JAMA. 282, 1627-1632 (1999).
- Gandhi, R. T., Zheng, L., Bosch, R. J., Chan, E. S., Margolis, D. M., Read, S., Kallungal, B., Palmer, S., Medvik, K., Lederman, M. M., Alatrakchi, N., Jacobson, J. M., Wiegand, A., Kearney, M., Coffin, J. M., Mellors, J. W., Eron, J. J. The effect of raltegravir intensification on low-level residual viremia in HIV-infected patients on antiretroviral therapy: a randomized controlled trial. PLoS medicine. 7, (2010).
- Gay, C., Dibben, O., Anderson, J. A., Stacey, A., Mayo, A. J., Norris, P. J., Kuruc, J. D., Salazar-Gonzalez, J. F., Li, H., Keele, B. F., Hicks, C., Margolis, D., Ferrari, G., Haynes, B., Swanstrom, R. Cross-sectional detection of acute HIV infection: timing of transmission, inflammation and antiretroviral therapy. PLoS One. 6, 19617-19617 (2011).
- Hatano, H., Delwart, E. L., Norris, P. J., Lee, T. H., Dunn-Williams, J., Hunt, P. W., Hoh, R., Stramer, S. L., Linnen, J. M., McCune, J. M., Martin, J. N., Busch, M. P., Deeks, S. G. Evidence for persistent low-level viremia in individuals who control human immunodeficiency virus in the absence of antiretroviral therapy. J. Virol. 83, 329-335 (2009).
- Havlir, D. V., Bassett, R., Levitan, D., Gilbert, P., Tebas, P., Collier, A. C., Hirsch, M. S., Ignacio, C., Condra, J., Gunthard, H. F., Richman, D. D., Wong, J. K. Prevalence and predictive value of intermittent viremia with combination hiv therapy. JAMA. 286, 171-179 (2001).
- Jordan, M. R., Kearney, M., Palmer, S., Shao, W., Maldarelli, F., Coakley, E. P., Chappey, C., Wanke, C., Coffin, J. M. Comparison of standard PCR/cloning to single genome sequencing for analysis of HIV-1 populations. J Virol Methods. 168, 114-120 (2010).
- Kaufmann, D. E., Kavanagh, D. G., Pereyra, F., Zaunders, J. J., Mackey, E. W., Miura, T., Palmer, S., Brockman, M., Rathod, A., Piechocka-Trocha, A., Baker, B., Zhu, B., Gall, S. L. e, Waring, M. T., Ahern, R., Moss, K., Kelleher, A. D. Upregulation of CTLA-4 by HIV-specific CD4+ T cells correlates with disease progression and defines a reversible immune dysfunction. Nat Immunol. 8, 1246-1254 (2007).
- Kearney, M., Maldarelli, F., Shao, W., Margolick, J. B., Daar, E. S., Mellors, J. W., Rao, V., Coffin, J. M., Palmer, S. HIV-1 Population Genetics and Adaptation in Newly Infected Individuals. J. Virol. 83, 2715-2727 (2008).
- Kearney, M., Palmer, S., Maldarelli, F., Shao, W., Polis, M. A., Mican, J., Rock-Kress, D., Margolick, J. B., Coffin, J. M., Mellors, J. W. Frequent polymorphism at drug resistance sites in HIV-1 protease and reverse transcriptase. AIDS. 22, 497-501 (2008).
- Kearney, M., Spindler, J., Shao, W., Maldarelli, F., Palmer, S., Hu, S. L., Lifson, J. D., Kewal Ramani, V. N., Mellors, J. W., Coffin, J. M., Ambrose, Z. Genetic diversity of simian immunodeficiency virus encoding HIV-1 reverse transcriptase persists in macaques despite antiretroviral therapy. Journal of Virology. 85, 1067-1076 (2011).
- Keele, B. F., Giorgi, E. E., Salazar-Gonzalez, J. F., Decker, J. M., Pham, K. T., Salazar, M. G., Sun, C., Grayson, T., Wang, S., Li, H., Wei, X., Jiang, C., Kirchherr, J. L., Gao, F., Anderson, J. A., Ping, L. H., Swanstrom, R. Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , 105-7552 (2008).
- Liu, S. L., Rodrigo, A. G., Shankarappa, R. G., Learn, H., Hsu, L., Davidov, O., Zhao, L. P., Mullins, J. I. HIV quasispecies and resampling. Science. 273, 415-416 (1996).
- Mahalanabis, M., Jayaraman, P., Miura, T., Pereyra, F., Chester, E. M., Richardson, B., Walker, B., Haigwood, N. L. Continuous viral escape and selection by autologous neutralizing antibodies in drug-naive human immunodeficiency virus controllers. J. Virol. 83, 662-672 (2009).
- Migueles, S. A., Connors, M. The Role of CD4(+) and CD8(+) T Cells in Controlling HIV Infection. Curr. Infect. Dis. Rep. 4, 461-467 (2002).
- Palmer, S., Kearney, M., Maldarelli, F., Halvas, E. K., Bixby, C. J., Bazmi, H., Rock, D., Falloon, J., Davey, R. T., Dewar, R. L., Metcalf, J. A., Hammer, S., Mellors, J. W., Coffin, J. M. Multiple, linked human immunodeficiency virus type 1 drug resistance mutations in treatment-experienced patients are missed by standard genotype analysis. J. Clin. Microbiol. 43, 406-413 (2005).
- Palmer, S., Wiegand, A. P., Maldarelli, F., Bazmi, H., Mican, J. M., Polis, M., Dewar, R. L., Planta, A., Liu, S., Metcalf, J. A., Mellors, J. W., Coffin, J. M. New real-time reverse transcriptase-initiated PCR assay with single-copy sensitivity for human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma. J. Clin. Microbiol. 41, 4531-4536 (2003).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
