Este artigo apresenta uma abordagem que combina a fotostimulação com varredura a laser e gravações em célula inteira em camundongos transgênicos que expressam GFP em populações limitadas de neurônios inibitórios. A técnica permite o mapeamento extensivo e a análise quantitativa de circuitos sinápticos locais de neurônios corticais inibitórios específicos.
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Artigo de método
Mapeamento Inibitória Circuitos Neuronal por Laser Scanning fotoestimulação
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os neurônios inibitórios são fundamentais para a função cortical. Eles compreendem cerca de 20% de toda a população neuronal cortical e podem ser subdivididos ainda mais em diversos subtipos com base em suas propriedades imunoquímicas, morfológicas e fisiológicas1-4. Embora pesquisas anteriores tenham revelado muito sobre as propriedades intrínsecas de tipos individuais de neurônios inibitórios, o conhecimento sobre suas conexões locais em circuitos ainda é relativamente limitado3,5,6. Dado que a função de cada neurônio individual é moldada por suas entradas sinápticas excitatórias e inibitórias dentro dos circuitos corticais, temos utilizado a fotostimulação com varredura a laser (LSPS) para mapear as conexões locais de circuito a tipos específicos de células inibitórias. Em comparação com a estimulação elétrica convencional ou a estimulação por pulso de glutamato, a LSPS apresenta vantagens únicas que permitem o mapeamento extensivo e a análise quantitativa das entradas funcionais locais para neurônios individualmente registrados3,7-9. A fotostimulação a laser por meio do desencapsulamento de glutamato ativa seletivamente os neurônios perissomáticos, sem ativar os axônios de passagem ou as dendrites distais, o que garante uma resolução de mapeamento sublaminar. A sensibilidade e eficiência da LSPS para mapear entradas de diversos locais de estimulação em uma grande região são particularmente adequadas para a análise de circuitos corticais.
Aqui apresentamos a técnica de LSPS combinada com o registro por patch-clamp em célula inteira para o mapeamento de circuitos inibitórios locais. Os registros direcionados a tipos específicos de células inibitórias são facilitados pelo uso de camundongos transgênicos que expressam proteínas verdes fluorescentes (GFP) em populações limitadas de neurônios inibitórios no córtex3,10, o que permite uma amostragem consistente dos tipos celulares alvo e uma identificação inequívoca dos tipos celulares registrados. No que se refere ao mapeamento por LSPS, descrevemos a instrumentação do sistema, o procedimento experimental e a aquisição de dados, além de apresentar exemplos de mapeamento de circuitos no córtex somatossensorial primário de camundongos. Conforme ilustrado em nossos experimentos, o glutamato "aprisionado" é ativado em uma região espacialmente restrita da fatia cerebral por meio de fotólise com laser UV; registros simultâneos em regime de clamp de tensão permitem detectar respostas sinápticas evocadas pela fotostimulação. Mapas de entradas sinápticas excitatórias ou inibitórias na célula-alvo são gerados por meio da varredura do feixe de laser para estimular centenas de sítios pré-sinápticos potenciais. Assim, a LSPS permite a construção de mapas detalhados das entradas sinápticas que atingem tipos específicos de neurônios inibitórios por meio de experimentos repetidos. Em conjunto, a técnica baseada em fotostimulação oferece aos neurocientistas uma ferramenta poderosa para determinar a organização funcional dos circuitos corticais locais.
Protocolo
1. Preparação fatia do cérebro
- Camundongos transgênicos estão profundamente anestesiados com pentobarbital sódico (> 100 mg / kg, ip) e rapidamente decapitados, e seus cérebros extraídos para uma solução de corte congelados e oxigenado.
- Óculos de GFP são usados para visualmente tela se o cérebro de camundongo na verdade expressa GFP.
- Cortical somatossensorial primário seções de 400 mm de espessura são cortados com uma vibratome em sacarose contendo líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF). Fatias são os primeiros incubados em sacarose contendo ACSF por 30 min a 1 h em 32 ° C, e após o período de incubação inicial, transferido para ACSF gravação em temperatura ambiente. Todo o período de incubação e de gravação, as fatias são continuamente aeradas com 95% O 2 -5% CO 2.
2. Equipamentos de inicialização
A implementação total do sistema é ilustrada na Figura 1.
- O sistema de resfriamento a laser e fornecedor de energia é ligada, recebendo o laser pronto.
- Todo o hardware relacionados ao controle fotoestimulação (incluindo o sistema de varredura do espelho, um modulador óptico, um obturador eletrônico e um amplificador de entrada fotodiodo) está ligado.
- O equipamento eletrofisiológicos (incluindo um amplificador Multiclamp 700B e micromanipuladores) é ligado. Gravações eletrofisiológicas, fotoestimulação e imagens dos preparativos fatia é feito em uma câmara de perfusão fatia montada no palco motorizado do microscópio.
- A câmera de imagem (Retiga 2000, Q-imagem, Austin, TX) é ligado. Fatias são visualizados com o microscópio vertical (BW51X, Olympus) com contraste de infravermelho interferência diferencial (DIC) e epi-fluorescente óptica através do sistema de imagem.
- O Matlab baseado em software EPHUS e Q captura de software da câmera são iniciado. A versão personalizada modificada da Ephus software (Ephus, disponível em https://openwiki.janelia.org/ ) é usado para controlar protocolos fotoestimulação e adquirir dados fotoestimulação.
- Depois que o sistema está ligado, deve-se verificar para ver se o sistema de fotoestimulação laser é em um estado de funcionamento. Como a objetiva do microscópio 4x é utilizado para enviar flashes UV para uncaging glutamato, um pedaço de papel branco pode ser colocado sob a observar o padrão de varredura a laser, enquanto o sistema é executado.
3. Criação de perfusão fatia
- Um sistema de perfusão pressurizado é ligada para alimentar a ACSF gravação na câmara de fatia. Cuidado é tomado para garantir um nível de fluido constante de 2,0 mm acima da fatia na câmara.
- Uma alíquota da solução estoque de MNI-enjaulado-glutamato é adicionado a 25 ml de circulação ACSF para uma concentração de 0,2 mM glutamato enjaulado. Por favor note que após 5-6 h de experimentação, a solução de banho e MNI-glutamato será atualizada.
- A fatia do cérebro é movido para dentro da câmara de gravação. Pode-se executar o sistema de imagem para verificar a qualidade fatia e anatomicamente localizar a área somatossensorial primário. Em seguida, a fatia está ancorado com um anel de platina custom-made de cordas. Tenha cuidado para não colocar a âncora sobre a região do cérebro destinada para as gravações.
4. Patch-fixação de células inteiras de gravação
- Eletrodos de vidro (4-6 mohms resistência) são puxados e preenchido com uma solução interna contendo biocytin 0,1% para a rotulagem e identificação de células morfológica.
- Para executar a gravação patch, as células são visualizadas no objetivo 60x. Tipos de células inibitórias são os primeiros identificados e seleccionados com base na visualização de expressão GFP sob um microscópio Olympus DIC / fluorescentes; gravações são posteriormente executados sob controle visual, auxiliada pela monitorização de vídeo infravermelho DIC. Por favor note que algumas vezes de alternar entre os modos de DIC e fluorescentes é necessário para confirmar a localização de células GFP quando se aproxima o eletrodo para a célula-alvo.
- Técnicas convencionais de patch-fixação são aplicadas. O eletrodo é preenchido com pressão positiva, mudou-se perto da superfície da célula para estabelecer uma ondulação perceptível sobre a membrana da célula alvo, e então a pressão negativa é aplicada rapidamente para formar um gigaseal e quebrar em monitorar as respostas ao mesmo tempo de injeção de corrente no monitor de vídeo.
- Ao romper dentro, as imagens da célula em 60x sob os modos de DIC e fluorescentes são levados para a verificação on-line. Antes da coleta de dados fotoestimulação, hiperpolarizante e despolarizante pulsos de corrente são injetados para examinar cada célula básica propriedades eletrofisiológicas.
- Uma vez estável gravações de células inteiras são alcançados com a resistência de bons acessos (geralmente <20 mohms), a objetiva do microscópio é alternado de 60x para 4x para o laser fotoestimulação digitalização. A imagem fatia em 4x é adquirido e será utilizado para orientar e registrar os sites fotoestimulação.
5. Laser scanning fotoestimulação
- Os parâmetros de aquisição fotoestimulação e os dados são definidos pela ativação do módulo de switch de configuração de Ephus. Normalmente, 1 ms laser (20 mW) com um intervalo de estímulo de um segundo é utilizado para o mapeamento fotoestimulação. Dados os traços de um segundo amostrados a 10 kHz são adquiridos.
- A imagem fatia 4x é carregado no módulo de mapeador de Ephus. A localização da soma das células é definido e sites fotoestimulação de um padrão 16x16 (80 mM mM espaçamento x 80) são criados em torno da localização da célula, abrangendo todas as camadas corticais.
- O perfil de excitação do neurônio gravado é mapeado através do exame dos locais spiking em resposta a fotoestimulação no modo de fixação atual. Nosso software user-friendly com os recursos on-line facilita a visualização dos experimentos de mapeamento.
- Ligações locais circuito excitatório são mapeados pela detecção de correntes excitatórias pós-sinápticas (EPSC) a partir da célula gravado durante a varredura a laser em diferentes locais. A célula é mantida a -70 mV no modo braçadeira de tensão para detectar dentro correntes excitatórias. Os mapas são repetidas EPSC 2-3 vezes com o padrão de fotoestimulação girado ou invertido.
- Opcional: Local conexões do circuito inibitório também pode mapeado pela detecção de correntes pós-sináptico inibitório (IPSC) a partir da célula registrado realizada no próximo a 0 mV no modo braçadeira de tensão para detectar as correntes exteriores inibitória. Note-se que o melhor é usar a solução interna do eletrodo com o potássio substituído com césio para o mapeamento de IPSC.
- Depois de todos os ensaios fisiológicos são concluídas, o eletrodo é delicadamente retirado da célula gravada. A fatia do cérebro é retirado e fixado em paraformaldeído a 4% durante a noite. As células gravado é manchada contra biocytin. Morfologia das células é examinada com confocal ou epi-fluorescente de microscopia, o que também confirma que cada célula registrada é de fato o interneurônio expressando GFP-originalmente-alvo.
6. Fotoestimulação análise de dados
Nossa metodologia recentemente desenvolvida e implementação de software 11 é aplicada à detecção e medição de fotoestimulação evocadas eventos sinápticos nos mapas de dados brutos. Como exemplificado na Figura 2, codificados por cores mapas são construídos para ilustrar o padrão de entrada sináptica para o neurônio gravado.
7. Resultados representativos:
Exemplo de resultados de gravação eletrofisiológico e mapeamento fotoestimulação são mostrados na Figura 2. Gravações alvo de tipos específicos de células inibitórias são possíveis usando camundongos transgênicos expressando GFP em conhecidos tipos de células inibitórias. Dada a diversidade de interneurônios inibitórios, análises de expressão GFP, eletrofisiologia intrínseca e características morfológicas (Figura 2A) são combinados para chegar à classificação final célula tipo. Figura 2B-C ilustrar que fotoestimulação de varredura a laser permite mapeamento extensivo de ligações locais circuito cortical a única neurônios inibitórios. O mapa de dados brutos é mostrada na Figura 2C. As respostas uncaging directos são excluídos da análise de dados (Figura 2C). Os mapas de entrada quantitativas são codificados por cores, mostrado na Figura 2D-F. O exemplo fast-spiking interneurônios inibitórios recebeu forte entrada excitatórios sinápticos (EPSCs) de camada 4 e camadas mais profundas. Ao relacionar a organização da célula entradas sinápticas definido vias corticais, somos capazes de inferir o seu papel possível (por exemplo, feedback e inibição feedforward) no processamento da informação cortical.
Figura 1. Instrumentação sistema geral de fotoestimulação laser de varredura. Nosso sistema completo é composto de controle fotoestimulação, imagem, vídeo e sistemas de gravação eletrofisiológico. Adotamos o projeto do sistema de LSPs descrito anteriormente 7,17. A unidade de laser é usado para gerar 355 nm laser UV para uncaging glutamato. O feixe de laser é direcionado através do caminho óptico do nosso sistema. Curta duração das ondas de laser (por exemplo, 1-3 ms) são controlados por meio de um modulador eletro-óptico (isto é, células Pockels) e um obturador mecânico. Laser potência do feixe é modulado por uma roda de densidade neutra gradiente e monitorado por desviar uma pequena fração do feixe de laser com uma lamela de vidro para um fotodiodo. O sistema de varredura a laser inclui um par XY de espelhos scan, a lente de digitalização, a lente do tubo, ea lente objetiva. Os espelhos entregar o feixe de laser através de uma lente de digitalização, em seguida, o feixe entra no microscópio por meio de um espelho dicróico e é focalizado por uma lente do tubo custom-made UV-transmissão. O feixe underfills a abertura parte de trás da objetiva do microscópio para fornecer um colunar mais (em oposição a cônicas) feixe de iluminação, mantendo o mapeamento bidimensional quanto possível, reduzindo a resolução axial. No âmbito do objectivo de 4x, o feixe de laser formas spots uncaging, cada approximating um perfil Gaussiano com uma largura de 153 M lateralmente no plano focal (ver a inserção). Posições diversas estimulação laser pode ser alcançado através de galvanômetros-driven espelhos de varredura XY, como os espelhos ea abertura de trás do objetivo são em planos conjugados, traduzindo posições espelho em diferentes localizações de varredura no plano focal da lente objetiva. Durante uncaging, um número variável de sites padronizados que cobre todo o campo são estimulados em seqüência em um nonraster, seqüência não aleatória para evitar revisitar as proximidades de locais recentemente estimulada. Por favor, consulte Xu et al. (2010) para obter informações mais detalhadas.
Figura 2. Mapeamento local conexões do circuito de excitação a uma expressando GFP-interneurônio fast-spiking na camada 4 do córtex sensorial primário do mouse. A1 e A2 mostram as imagens DIC e GFP fluorescente da célula-alvo no âmbito do objectivo 60x no fatia cérebro vivo, enquanto mostra A3 a morfologia celular revelado pela coloração biocytin no pós-gravação, fatia fixa. A4 mostra os padrões de disparo das células GFP gravado, característica de um fast-interneurônio spiking inibitória, em resposta a intrassomáticas injeções de corrente de forças diferentes. B mostra a imagem sobreposta com a fatia de 16 sites fotoestimulação x16 (*). A localização da célula é indicada por um pequeno círculo vermelho. C mostra uma série de fotoestimulação evocadas traços de resposta dos locais de estimulação mostrado na B, enquanto a célula foi realizada a -70 mV para detectar dentro correntes excitatórias. Diferentes formas de respostas fotoestimulação são ilustrados pelos traços em locais de 1 e 2, que são expandidos e de forma separada na inserção. O traço 1 é um exemplo das respostas diretas (indicado por setas a vermelho) para glutamato uncaging no corpo celular e dendritos promximal. Outros vestígios em 2 são exemplos típicos de respostas excitatórias entrada sináptica (azul). Respostas diretas e entradas sinápticas podem ser distinguidos por suas amplitudes e latências de resposta. D, E e F são os mapas com código de cores (16x16 sites) da média EPSC amplitude, os números EPSC, ea latência detectados primeiro EPSC por site, respectivamente, para os dados brutos mapa mostrado na C. A amplitude média de entrada de cada local de estimulação é a amplitude média de EPSCs na janela de análise, com a resposta inicial espontânea subtraída da resposta fotoestimulação do mesmo site. O número de EPSCs ea hora de chegada ou latência do EPSC detectado pela primeira vez por site também são medidos e plotados. Por favor, consulte (Shi et al., 2010) para obter mais detalhes.
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Discussão
Técnicas de mapeamento baseadas em fotostimulação têm sido aplicadas com sucesso na análise de circuitos corticais. A fotostimulação com varredura a laser combinada com gravação de célula inteira permite o mapeamento com alta resolução das distribuições laminares de fontes de entrada pré-sinápticas para neurônios individuais, pois a gravação simultânea de um neurônio pós-sináptico com a fotostimulação de grupos de neurônios pré-sinápticos em diversas localizações diferentes fornece medidas quantitativas da distribuição e...
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Divulgações
Nenhum conflito de interesses declarado.
Agradecimentos
Agradecemos a Tran Huynh, Andrew San Antonio e Jerry Lin pela assistência técnica. Este trabalho foi financiado pelas bolsas DA023700 e DA023700-04S1 dos National Institutes of Health concedidas a X.X.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| linhagens de camundongos transgênicos | Laboratório Jackson ou outras fontes | Consulte Xu e Callaway (2009) | |
| Óculos GFP | BLS Ltd., Hungria | ||
| vibratrótomo | Sistemas Leica | VT1200S | |
| Glutamato preso na gaiola MNI (4-metóxi-7-nitroindolinil-glutamato L preso na gaiola) | Tocris Bioscience, Ellisville, MO | Cat. n.º 1490 | |
| biocitina | B4261 | ||
| puxador de eletrodos | Sutter Instrument, Novato, CA | P-97 | |
| tubos de vidro para fabricação de eletrodos | BF150-86-10 | ||
| Amplificador Multiclamp 700B | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | Multiclamp 700B | |
| câmera CCD digital | Q-imaging, Austin, TX | Retiga 2000 | |
| Microscópio de pesquisa | Olympus, Tóquio, Japão | BW51X | |
| Unidade de laser UV | DPSS Lasers, Santa Clara, CA | modelo 3501 | |
| Outro equipamento para fotostimulação a laser com varredura | Consulte Xu et al. (2010) | ||
Soluções: | |||
|
Referências
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Reimpressões e permissões
