Mapeamento Inibitória Circuitos Neuronal por Laser Scanning fotoestimulação

Resumo

Este artigo apresenta uma abordagem que combina a fotostimulação com varredura a laser e gravações em célula inteira em camundongos transgênicos que expressam GFP em populações limitadas de neurônios inibitórios. A técnica permite o mapeamento extensivo e a análise quantitativa de circuitos sinápticos locais de neurônios corticais inibitórios específicos.

Resumo

Os neurônios inibitórios são fundamentais para a função cortical. Eles compreendem cerca de 20% de toda a população neuronal cortical e podem ser subdivididos ainda mais em diversos subtipos com base em suas propriedades imunoquímicas, morfológicas e fisiológicas^1-4. Embora pesquisas anteriores tenham revelado muito sobre as propriedades intrínsecas de tipos individuais de neurônios inibitórios, o conhecimento sobre suas conexões locais em circuitos ainda é relativamente limitado^3,5,6. Dado que a função de cada neurônio individual é moldada por suas entradas sinápticas excitatórias e inibitórias dentro dos circuitos corticais, temos utilizado a fotostimulação com varredura a laser (LSPS) para mapear as conexões locais de circuito a tipos específicos de células inibitórias. Em comparação com a estimulação elétrica convencional ou a estimulação por pulso de glutamato, a LSPS apresenta vantagens únicas que permitem o mapeamento extensivo e a análise quantitativa das entradas funcionais locais para neurônios individualmente registrados^3,7-9. A fotostimulação a laser por meio do desencapsulamento de glutamato ativa seletivamente os neurônios perissomáticos, sem ativar os axônios de passagem ou as dendrites distais, o que garante uma resolução de mapeamento sublaminar. A sensibilidade e eficiência da LSPS para mapear entradas de diversos locais de estimulação em uma grande região são particularmente adequadas para a análise de circuitos corticais.

Aqui apresentamos a técnica de LSPS combinada com o registro por patch-clamp em célula inteira para o mapeamento de circuitos inibitórios locais. Os registros direcionados a tipos específicos de células inibitórias são facilitados pelo uso de camundongos transgênicos que expressam proteínas verdes fluorescentes (GFP) em populações limitadas de neurônios inibitórios no córtex^3,10, o que permite uma amostragem consistente dos tipos celulares alvo e uma identificação inequívoca dos tipos celulares registrados. No que se refere ao mapeamento por LSPS, descrevemos a instrumentação do sistema, o procedimento experimental e a aquisição de dados, além de apresentar exemplos de mapeamento de circuitos no córtex somatossensorial primário de camundongos. Conforme ilustrado em nossos experimentos, o glutamato "aprisionado" é ativado em uma região espacialmente restrita da fatia cerebral por meio de fotólise com laser UV; registros simultâneos em regime de clamp de tensão permitem detectar respostas sinápticas evocadas pela fotostimulação. Mapas de entradas sinápticas excitatórias ou inibitórias na célula-alvo são gerados por meio da varredura do feixe de laser para estimular centenas de sítios pré-sinápticos potenciais. Assim, a LSPS permite a construção de mapas detalhados das entradas sinápticas que atingem tipos específicos de neurônios inibitórios por meio de experimentos repetidos. Em conjunto, a técnica baseada em fotostimulação oferece aos neurocientistas uma ferramenta poderosa para determinar a organização funcional dos circuitos corticais locais.

Protocolo

1. Preparação fatia do cérebro

1. Camundongos transgênicos estão profundamente anestesiados com pentobarbital sódico (> 100 mg / kg, ip) e rapidamente decapitados, e seus cérebros extraídos para uma solução de corte congelados e oxigenado.
2. Óculos de GFP são usados ​​para visualmente tela se o cérebro de camundongo na verdade expressa GFP.
3. Cortical somatossensorial primário seções de 400 mm de espessura são cortados com uma vibratome em sacarose contendo líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF). Fatias são os primeiros incubados em sacarose contendo ACSF por 30 min a 1 h em 32 ° C, e após o período de incubação inicial, transferido para ....

Discussão

Técnicas de mapeamento baseadas em fotostimulação têm sido aplicadas com sucesso na análise de circuitos corticais. A fotostimulação com varredura a laser combinada com gravação de célula inteira permite o mapeamento com alta resolução das distribuições laminares de fontes de entrada pré-sinápticas para neurônios individuais, pois a gravação simultânea de um neurônio pós-sináptico com a fotostimulação de grupos de neurônios pré-sinápticos em diversas localizações diferentes fornece medidas quantitativas da distribuição e.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
linhagens de camundongos transgênicos	Laboratório Jackson ou outras fontes		Consulte Xu e Callaway (2009)
Óculos GFP	BLS Ltd., Hungria
vibratrótomo	Sistemas Leica	VT1200S
Glutamato preso na gaiola MNI (4-metóxi-7-nitroindolinil-glutamato L preso na gaiola)	Tocris Bioscience, Ellisville, MO	Cat. n.º 1490
biocitina		B4261
puxador de eletrodos	Sutter Instrument, Novato, CA	P-97
tubos de vidro para fabricação de eletrodos		BF150-86-10
Amplificador Multiclamp 700B	Molecular Devices, Sunnyvale, CA	Multiclamp 700B
câmera CCD digital	Q-imaging, Austin, TX	Retiga 2000
Microscópio de pesquisa	Olympus, Tóquio, Japão	BW51X
Unidade de laser UV	DPSS Lasers, Santa Clara, CA	modelo 3501
Outro equipamento para fotostimulação a laser com varredura			Consulte Xu et al. (2010)
Soluções:
Fluido cerebroespinhal artificial (ACSF) contendo sacarose para o corte de fatias (em mM: 85 NaCl, 75 sacarose, 2,5 KCl, 25 glicose, 1,25 NaH₂PO₄, 4 MgSO₄, 0,5 CaCl₂, 24 NaHCO₃)2PO4, 4 MgCl2, 0,5 CaCl2, e 24 NaHCO₃3). Gravação de ACSF (em mM: 126 NaCl, 2,5 KCl, 26 NaHCO₃, 1,25 NaH₂PO₄, 2 CaCl₂, 2 MgCl₂, 10 glicose)3, 2 CaCl2, 2 MgCl₂2, 1,25 NaH2PO4, e 10 de glicose) Solução interna para eletrodo (em mM: 126 gluconato de potássio, 4 KCl, 10 HEPES, 4 ATP-Mg, 0,3 GTP-Na e 10 fosfocreatina; pH 7,2, 300 mOsm).