Quantificar atividade agonista no G receptores acoplados à proteína

Resumo

Um método para estimar a afinidade constante de um agonista para o estado ativo ( K _{B) De um receptor acoplado à proteína G é descrito. A análise prevê medidas absoluta ou relativa de K B Dependendo se a ativação do receptor constitutivo é mensurável. Nosso método aplica-se a jusante várias respostas de ativação do receptor.}

Resumo

Quando um agonista ativa uma população de G receptores acoplados à proteína (GPCRs), ele provoca uma via de sinalização que culmina na resposta da célula ou tecido. Este processo pode ser analisado a nível de um único receptor, uma população de receptores, ou uma resposta a jusante. Aqui nós descrevemos como analisar a resposta a jusante para obter uma estimativa da afinidade agonista constante para o estado ativo de receptores único.

Receptores se comportam como chaves quântica que se alternam entre os estados ativo e inativo (Figura 1). O estado ativo interage com as proteínas G específicas ou outros parceiros de sinalização. Na ausência de ligantes, o estado inativo predomina. A ligação do agonista aumenta a probabilidade de que o receptor muda para o estado ativo porque sua afinidade constante para o estado ativo (K _b) é muito maior do que para o estado inativo (K _a). A soma dossaídas aleatória de todos os receptores da população gera um nível constante de ativação do receptor no tempo. O inverso da concentração de agonista provocando meio máxima ativação do receptor é equivalente ao constante de afinidade observada _(obs K), ea fração de agonista do receptor-complexos no estado ativo é definido como a eficácia (ε) (Figura 2).

Métodos para analisar as respostas a jusante de GPCRs foram desenvolvidos que permitem a estimativa do K _obs e eficácia relativa de um agonista de ^1,2. Neste relatório, vamos mostrar como modificar essa análise para estimar o valor de K agonista _b em relação à de outro agonista. No caso de ensaios que exibem atividade constitutiva, mostramos como estimar K _b em unidades absolutas de M ^-1.

Nosso método de análise agonista curvas concentração-resposta consiste ^3,4de regressão não-linear global usando o modelo operacional ^5. Nós descrevemos um procedimento usando o aplicativo de software, Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). A análise fornece uma estimativa do produto da K _obs e um parâmetro proporcional à eficácia (τ). A estimativa de τK _obs de um agonista, dividido pelo de outra, é uma medida relativa de K _b (RA _i) ^6. Para qualquer receptor exibindo atividade constitutiva, é possível estimar um parâmetro proporcional à eficácia do complexo receptor livre (τ _sys). Neste caso, o valor de K _b de um agonista é equivalente a τK _obs / τ _sys ^3.

Nosso método é útil para determinar a seletividade de um agonista de subtipos do receptor e para a quantificação agonista do receptor de sinalização através de diferentes proteínas G.

Protocolo

1. Medição de agonista curvas concentração-resposta: sem atividade constitutiva

1. Para a estimativa de valores em relação agonista K _b (RA _i), uma série de pelo menos dois agonista curvas concentração-resposta é necessária. Qualquer ensaio in vitro para a resposta funcional de um GPCR pode ser medida desde que a concentração de agonista pode ser controlada e um único tipo de receptor medeia a resposta. Adequada baseada em células incluem ensaios de medição de AMPc ^4,7 e acumulação inositolphosphate ^8,9 em uma linha de células expressando um receptor recombinante. Exemplos de ensaios de te....

Discussão

Porque o nosso método para estimar RA _i (em relação K valor _b) só exige a medição de agonista curvas concentração-resposta, a nossa análise pode ser feito a qualquer hora dessas curvas são medidos.

Se o dia-a-dia variação na resposta da preparação experimental (por exemplo, células ou tecidos) é grande, as medidas de resposta de cada curva de concentração-resposta pode ser normalizada em relação à estimativa de "Top" do agonista padrão para c.......