Summary
在这个视频文章中，我们描述了使用一个新的
Abstract
疱疹性角膜炎是一种与单纯疱疹病毒1型（HSV-1）相关联的最严重的病症。疱疹性角膜炎是目前在发达国家都角膜和来自感染相关性失明的首要原因。典型的表现包括感染疱疹性角膜炎的角膜上皮，有时更深的角膜基质和内皮细胞，导致永久性角膜病理疤痕，变薄，不透明度1。
角膜HSV-1感染的传统研究了两种类型的实验模型。在被感染的培养皿中培养的单层角膜上皮细胞的体外模型，提供简单，高层次的可复制性，快速实验，和相对低廉的成本。在另一方面， 在体内模型，在其中直接进行接种的动物（如兔或小鼠）在角膜上，提供了一个高度复杂的生理系统，但具有较高的成本，更长的实验中，必要的动物护理，和更大程度的可变性。
在这个视频文章中，我们提供了详细演示了一个新的离体角膜上皮HSV-1感染模型，它结合的优势，无论是在体外和体内模型。 体外模型采用完整的角膜organotypically维持在文化和HSV-1感染。使用的体外模型允许高度的生理基础的结论，但它是相当便宜，需要投入的时间可比的体外模型。
Protocol
所有的试剂和设备购买无菌或灭菌前的程序。本文介绍的步骤建立体外模型与一个去核的眼睛开始。在我们的实验中，我们使用新鲜全眼球从年轻的白兔（8-12周）（PEL-FREEZ生物制品，罗杰斯，AR）。此外，我们使用人获得当地眼库的角膜。如果执行剜除自己，照顾，以避免损坏角膜或角膜缘，在操作过程中。兔剜除术协议可以在别处找到2。
第1部分：切除角巩膜按钮
- 与PBS浸湿一个狭长的纱布，并用它周围的眼球，以方便在操作过程中。
- 使用锋利的手术刀，使巩膜切口，切向的角膜缘约0.5厘米的距离。
- 使用锋利的剪刀延长切口，完全切除的corneoscleral按钮。
- 后巩膜按钮是孤立的，逗了虹膜，巩膜缘用钳子。避免损坏对角膜内皮细胞或施加过大的压力。
第2部分：介绍器官培养角膜进入
- 取出的角膜在最小必需培养基（MEM），补充有非必需氨基酸（1X），（2毫摩尔），L-谷氨酰胺，青霉素（200单位/毫升）和链霉素（200微克/毫升）培养。如有必要，也可加入抗真菌剂，例如两性霉素，可能。
- 制备1％的琼脂糖溶液培养基中，在55℃下，并保持准备
- 彻底冲洗角膜在无菌PBS中含有青霉素（200单位/毫升）和链霉素（200微克/毫升）。
- 角膜上皮侧放置下来到井的无菌点板。
- 添加含琼脂糖介质角膜内皮凹部刚够填写完全。允许1分钟的琼脂糖巩固。
- 将凝胶支架上皮面朝上插入一个35毫米组织培养皿，并添加培养基表面覆盖上皮与角膜。
- 可以以这种方式培养的角膜超过一个星期，与介质发生变化，每48小时。
第3部分：感染了HSV-1和实验性药物治疗
- 添加1毫升到35 mm的组织培养皿中含有所需量的病毒的培养基中。我们通常为1×10 4 PFU应变KOS每角膜的HSV-1感染。我们的股票效价是由斑块检测CV-1细胞单层。
- 一起放置在角膜与琼脂糖脚手架上皮侧下降到含有病毒的培养基。
- 将角膜组织培养孵化器，感染1小时间歇性摇摆每10-15分钟。
- 1小时后，吸出病毒含有多种宁培养基并用PBS冲洗2-3次，以除去任何残留的病毒颗粒。
- 将角膜回到它以前的位置，加入新鲜的培养基覆盖的上皮细胞表面。
- 实验性治疗前或感染后，可以开始，根据实验的性质。
- 改变培养基每48小时。
第4部分：样品采集
- 中斑块的检测分析。混合介质，并立即使用的空斑法或存储在-80°C以备后用，如果在不同时间点采集样本。
- DNA，RNA，蛋白质，或从角膜上皮细胞
- 删除的琼脂糖凝胶支架，并用PBS冲洗角膜。
- 海关巩膜组织从角膜环，以确保仅角膜上皮材料被收集。
- ü唱一把手术刀，刮去角膜上皮细胞进入适当的缓冲液中，根据以进行分离的类型的材料。 DNA和RNA的隔离，我们使用的DNeasy血液及组织试剂盒和RNeasy Mini试剂盒（QIAGEN，Hilden，德国）。对于蛋白质的裂解物的集合，我们使用Laemmli缓冲液。对于角膜上皮细胞的流式细胞仪分析，我们预孵化角膜在少量的胰蛋白酶松开细胞，然后赶走他们到胰蛋白酶用解剖刀。由于刮角膜上皮不产生等量的组织，它是重要的，包括分析样品时，适当的控制。我们使用的18S rRNA，GAPDH定量RT-PCR的成绩单参照基因在qPCRs，和核仁素的免疫印迹加载控制作为参考。
- 组织样本进行免疫组化或免疫荧光
- 删除琼脂糖凝胶支架和冲洗玉米EA与PBS。
- 根据实验性的目标上，使用角膜使石蜡组织块或冰冻组织块，在视频中所示。准备角膜组织切片时，我们遵循的标准程序。
代表性的成果
大多数的方法可用于研究细胞在组织培养中，可以很容易地适应用于角膜感染HSV-1 体外 。这里展示的是代表的一些研究HSV-1感染的最常见的技术-定量PCR（ 图1D），定量RT-PCR（ 图1B），Western blot检测（ 图1F），空斑法（ 图1C），组织的免疫荧光（ 图1E）。
图1。分析角膜感染HSV-1 EX v龙腾。 （A）急性角膜上皮HSV-1感染的体外模型示意图。（BF）分析使用视频文章中描述的方法角膜感染。取出的兔角膜与1×10 4 PFU /角膜应变KOS HSV-1感染和培养（PAA）的存在或不存在（模拟）膦酰乙酸（400微克/毫升），一种已知的单纯疱疹病毒复制抑制剂（B）在指定的时间点收集的总RNA，和病毒的转录与HSV-1聚合酶的引物，通过定量RT-PCR进行评估。 18S rRNA基因的引物对被用来作为参考。 n = 3时。误差条表示±扫描电镜（SEM）（C）的培养基，收集在48 HPI，传染性颗粒生产的CV-1单层上的噬斑分析评估，（D）的总DNA，收集在48 HPI，病毒基因组的复制，评估一个定量PCR检测的引物为HSV-1基因组。镨imers对GAPDH用作参考。 n = 3时。误差条表示±扫描电镜（SEM）（E）的模拟处理的角膜闪存冻结在48 HPI，切片，并通过间接免疫荧光法分析的存在下，受感染的上皮细胞内的病毒的早期蛋白质（ICP8）。核复染与Höchst的33258。（F）蛋白裂解液收集在48 HPI，并通过Western blot检测病毒蛋白的表达（ICP0）进行了评估。 BCA法，以确保样品相等的加载。 HPI小时后感染。
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Discussion
在这个视频文章中，我们描述了急性角膜上皮细胞在体外模型中的HSV-1感染的研究方法。之间的在体外和体内模型中，该模型是一个有用的踏脚石，因为它允许对生理精确验证细胞培养的结果，并且由此限制动物实验的量必须执行的。此外，体外模型提供了一种独特而宝贵的机会，学习完整的人角膜上皮细胞单纯疱疹病毒感染。下面列出的是采用这种模式时，必须考虑一些注意事项：
- 重要的是要强调的是，在这个视频文章介绍的方法并不意味着是一个模型的疱疹性角膜炎，相反却是急性角膜上皮 HSV-1感染的典范。疱疹性角膜炎是几个混杂进程的结果，包括感染，炎症，和主机即时病毒的免疫应答。抗原特异性CD4 +和CD8 + T细胞的反应是一个显着的发病机制中的组成部分，疱疹性角膜炎，这是不能在这个模型中，被再现，因为取出的角膜不受由免疫系统的细胞的浸润。出于这个原因，他们不典型的上皮细胞树突状溃疡和缺乏的基质参与经典的观察疱疹性角膜基质炎3。因此，进球是不可能的角膜溃疡疾病的严重程度和荧光成像的体外模型。此外，大多数情况下，疱疹性角膜炎从潜伏期引起的病毒的再活化。由于我们的方法依赖于直接取出的角膜与外源病毒的感染， 急性角膜感染HSV-1，而不是重新启动疾病模型。出于这些原因，这里提出的模型是不适合用于了解整体病理的疾病，而是sh的应严格用于研究病毒的复制和病毒 - 宿主相互作用的角膜上皮。
- 体外疱疹性角膜炎模型得出的结果与较大的变化幅度在体外组织培养实验。这可能是由于这样的事实：每个角膜收集从一个不同的兔子，可以略有不同处理。人类角膜的结果比兔角膜更大的变异，因为他们来自捐助者的变量年龄，种族，健康状况，并保存时间死后不同量的。然而，随着使用至少五个角膜每个实验处理，我们能够产生统计学上可靠的数据。
- 传统的方法培养外植角膜4-5建议使用足够的培养基，覆盖在角膜缘的角膜。我们发现，增加介质的量完全覆盖上皮产生更一致的结果，可能是由于个别眼角膜获得其中所含的中和实验药物之间的差异最小化。
- 当使用的任何应用程序利用抗体的兔角膜，重要的是要记住，传统的对人类，小鼠，大鼠等的特异性的抗体是可能不交叉反应的抗兔抗原。此外，次级抗兔抗体当然不能在这些应用中使用。由于这些原因，我们使用人类角膜的实验，涉及的细胞靶点的抗体染色。
- 当收集上皮细胞，流式细胞仪分析，实验者必须持谨慎态度的影响，胰蛋白酶对膜结合蛋白。因此，用于检测的表面蛋白中，它可能是有益的撞出的细胞，如胶原酶或非胰蛋白酶的蛋白酶可使用其他的装置。
- 疱疹性角膜炎的动物模型依赖于角膜划痕接种前病毒。我们已经能够实现一致的感染水平，而牺牲取出的角膜。这很可能是由于泪膜的情况下，闪烁，迅速消除病毒在活的动物角膜表面。
潜在的体外疱疹性角膜炎模型的修改不探讨这个视频文章：
- 前角膜上皮细胞的HSV-1感染的基因改造，通过使用DNA交付方法中使用的细胞培养和基因治疗研究，如基因转染，病毒载体，基因喷补料6。
- 使用GFP的表达HSV-1的显示7-8，或FITC标记的抗-HSV抗体显示9-10，以目视评估的感染程度。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
特拉华谷狮子会眼库的支持是非常宝贵的，这项工作。鼠标主，单克隆抗体ICP8的是一种礼物博士大卫Knipe（哈佛医学院）。我们也感谢斯蒂芬·詹宁斯（Drexel大学医学院）和彼得·莱布森（Wills眼科研究所）博士的有益讨论和专业知识。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Mediatech, Inc. | 10-010-CV | |
| Non-Essential Amino Acids (100x solution) | Mediatech, Inc. | 25-025-CI | |
| L-Glutamine | Mediatech, Inc. | 25-005-CI | |
| Penicillin G Sodium Salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Streptomycin Sulfate Salt | Sigma-Aldrich | S9137 | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Prepared in Lab | N/A | |
| Trypsin EDTA (1x) | Mediatech, Inc. | 25-053-CI | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Laemmli Buffer | Prepared in Lab | N/A | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Whole Rabbit Eyes (Young) | Pel-Freez Biologicals | 41211-2 | |
| Human Corneas and Whole Eyes | Local Supplier | N/A | |
| 12 Well Porcelain Spot Plate | Avogadro’s Lab Supply | 1877 | |
| 35 mm Tissue Culture Dish | Falcon BD | 353001 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Cryomold Intermediate | Tissue-Tek | 4566 |
References
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