Summary
Dans cet article, nous décrivons vidéo l'utilisation d'une nouvelle
Abstract
Kératite herpétique est une des pathologies les plus sévères associés au virus de l'herpès simplex de type 1 (HSV-1). Kératite herpétique est actuellement la principale cause de cécité cornéenne deux dérivés et associée à l'infection dans le monde développé. Présentation typique de kératite herpétique comprend également l'infection de l'épithélium cornéen et parfois le stroma cornéen profond et l'endothélium, conduisant à de telles pathologies cornéennes permanents comme des cicatrices, l'éclaircissage et l'opacité 1.
Cornée infection HSV-1 est traditionnellement étudiée dans deux types de modèles expérimentaux. Le modèle in vitro, dans lequel monocouches de culture de cellules épithéliales cornéennes sont infectées dans une boîte de Pétri, offre simplicité, niveau élevé de reproductibilité, des expériences rapides et des coûts relativement faibles. D'autre part, le modèle in vivo, dans lesquelles les animaux comme les lapins ou les souris sont inoculés directement dans la cornée, propose un état physiologique hautement sophistiquésystème, mais coûte plus cher, plus les expériences, les soins aux animaux nécessaires, et un plus grand degré de variabilité.
Dans cet article, vidéo, nous fournissons une démonstration détaillée d'un modèle ex vivo nouvelle épithélium cornéen infection HSV-1, qui combine les forces des deux in vitro et la le des modèles in vivo. Le modèle ex vivo utilise des cornées intactes organotypically maintenues en culture et infectées par le HSV-1. L'utilisation du modèle ex vivo permet de tirer des conclusions très base physiologique, mais il est assez peu coûteux et exige un engagement de temps comparable à celle du modèle in vitro.
Protocol
Tous les réactifs et du matériel ont été achetés stérile ou ont été stérilisés avant la procédure. Cet article décrit les étapes de mise en place du modèle ex vivo en commençant par un œil énucléé avant. Dans nos expériences, nous utilisons de nouveaux globes oculaires entières de jeunes (8-12 semaines) lapins albinos (Pel-Freez Biologicals, Rogers, AR). En outre, nous utilisons des cornées humaines obtenues à partir de la banque des yeux locale. Si vous effectuez vous-même l'énucléation, prenez soin de ne pas endommager la cornée ou du limbe lors de la procédure. Protocoles énucléation de lapin peuvent être trouvés ailleurs 2.
Partie 1: excision du bouton cornéosclérale
- Mouiller une étroite bande de gaze avec du PBS et l'enrouler autour du globe oculaire pour faciliter sa préhension lors de la procédure.
- Utiliser un scalpel pour faire une incision dans la sclère tangentielle, environ 0,5 cm du limbe.
- Utiliser des ciseaux bien aiguisés pour prolonger l'incision et complètement exciser la cbouton orneoscleral.
- Une fois sur le bouton cornéosclérale est isolé, loin taquiner l'iris tout en maintenant le bord scléral avec une pince. Éviter d'endommager l'endothélium ou exerçant un stress excessif sur la cornée.
Partie 2: Introduction de la cornée en culture organotypique
- Cornées explantées sont cultivées dans un milieu essentiel minimum (MEM) additionné de non-acides aminés essentiels (1X), L-glutamine (2 mM), la pénicilline (200 U / ml) et de streptomycine (200 ug / ml). Un agent antifongique, tels que l'amphotéricine, peuvent également être ajoutés si nécessaire.
- Préparer une solution à 1% d'agarose dans un milieu de culture et le tenir prêt à 55 ° C.
- Rincer soigneusement la cornée stérile pénicilline PBS contenant (200 U / ml) et de streptomycine (200 ug / ml).
- Placez le côté cornée épithéliale dans un puits d'une plaque à godets stérile.
- Ajouter le support d'agarose contenant de la concavité endothéliale de la cornée juste assez pourle remplir complètement. Permettez ~ 1 min pour le agarose à se solidifier.
- Placez la cornée avec le milieu de culture soutenir gel échafaudage côté épithélial vers le haut dans une boîte de culture tissulaire de 35 mm et d'ajouter à couvrir la surface épithéliale.
- La cornée peut être cultivé de cette manière depuis plus d'une semaine, avec tous les changements de milieu h 48.
Partie 3: L'infection par le HSV-1 et le traitement avec des médicaments expérimentaux
- Ajouter 1 ml de milieu contenant la quantité souhaitée de virus dans une boîte de culture de tissus 35 mm. En général, nous infecter avec 1x10 4 PFU de la souche KOS de HSV-1 par la cornée. Nos titres boursiers sont déterminés par des essais de plaque sur des monocouches de CV-1.
- Placer la cornée avec le côté échafaudage agarose épithéliale vers le bas dans le milieu contenant le virus.
- Placez la cornée dans un incubateur de culture tissulaire pour infecter pendant 1 heure avec balancement intermittent toutes les 10-15 minutes.
- Après 1 heure, aspirer le virus contaiNing moyennes et rincer 2-3 fois avec du PBS pour éliminer les particules résiduelles virales.
- Placer la cornée dans sa position précédente et ajouter un milieu de culture frais pour couvrir la surface de l'épithélium.
- Traitements expérimentaux peuvent être commencée avant ou après l'infection, en fonction de la nature de l'expérience.
- Le milieu de culture est changé tous les 48 h.
Partie 4: Prélèvement des échantillons
- Moyen pour l'analyse dosage de la plaque. Mélangez bien le support et l'utiliser immédiatement pour un essai de plaque ou de conserver à -80 ° C pour une utilisation ultérieure si la collecte d'échantillons à différents moments.
- ADN, ARN, protéines, ou des cellules de l'épithélium cornéen
- Retirer l'échafaud agarose et rincer la cornée et avec du PBS.
- L'excision de la bague de tissu scléral de la cornée afin de faire en sorte que seul matériau épithéliale cornéenne est recueillie.
- Uchanter un scalpel, gratter les cellules épithéliales cornéennes dans le tampon approprié, en fonction du type de matériau devant être isolé. Pour l'isolement de l'ADN et de l'ARN, on utilise le kit DNeasy Blood & Tissue et le kit RNeasy Mini, respectivement (QIAGEN, Hilden, Allemagne). Pour la collecte des lysats protéiques, nous utilisons tampon de Laemmli. Pour l'analyse par cytométrie en flux des cellules épithéliales cornéennes, nous pré-incuber les cornées dans une petite quantité de trypsine pour détacher les cellules, puis les déloger en trypsine avec un scalpel. Depuis racler l'épithélium cornéen ne donne pas des quantités égales de tissu, il est important d'inclure des contrôles appropriés lors de l'analyse des échantillons. Nous utilisons ARNr 18S comme une transcription de référence dans qRT-PCR, GAPDH comme gène de référence dans RCQP et nucléoline comme un contrôle de chargement pour Western blot.
- Des échantillons de tissus pour l'immunohistochimie ou immunofluorescence
- Retirer l'échafaud agarose et rincer le maïseo bien avec du PBS.
- En fonction de votre objectif expérimental, utilisez la cornée afin de faire un bloc de paraffine de tissu ou d'un bloc de tissu congelé, comme le montre la vidéo. Nous suivre les procédures standard lors de la préparation des coupes de tissus cornéens.
Les résultats représentatifs
La plupart des méthodes disponibles pour l'étude des cellules en culture de tissus peut être facilement adapté pour une utilisation dans la cornée in vivo infectées par le HSV-1 ex. On voit ici des résultats représentatifs pour quelques-unes des techniques les plus communes applicables à l'étude de l'infection HSV-1 - qPCR (figure 1D), qRT-PCR (figure 1B), Western blot (figure 1F), dosage de la plaque (figure 1C), et tissus par immunofluorescence (figure 1E).
Figure 1. Analyse des cornées infectées par le HSV-1 v exivo. Représentation schématique (A) du modèle ex vivo de épithéliale cornéenne aiguë infection HSV-1. (BF) Analyse des cornées infectées en utilisant la méthode décrite dans cet article la vidéo. Cornées de lapin explantés ont été infectées par le 1x10 4 UFP / cornée de souche KOS de HSV-1 et cultivées en présence (AAP) ou l'absence (Mock) d'acide phosphonoacétique (400 pg / ml), un inhibiteur connu de la réplication du HSV. (B) L'ARN total ont été recueillies aux points de temps indiqués, et la transcription virale a été évaluée par qRT-PCR avec des amorces pour le HSV-1 polymérase. Primaires contre l'ARNr 18S ont été utilisés comme référence. n = 3. Les barres d'erreur indiquent ± SEM. (C) Le milieu de culture a été recueilli à 48 hpi, et la production de particules infectieuses a été évaluée par dosage de plaque sur des monocouches de CV-1. (D) L'ADN total a été recueilli à 48 hpi, et la réplication du génome viral a été évaluée dans un test PCR quantitative avec des amorces pour le génome de HSV-1. PrIMERS contre GAPDH ont été utilisés comme référence. n = 3. Les barres d'erreur indiquent ± SEM. (E) Maquette cornées ont été traités par flash-gelé à 48 hpi, sectionnées et analysés par immunofluorescence indirecte pour la présence d'une protéine virale précoce (ICP8) dans l'épithélium infecté. Les noyaux sont contre-Höchst 33258. (F) lysats protéiques ont été recueillies à 48 hpi, et l'expression d'une protéine virale (ICP0) a été évaluée par Western blot. BCA a été utilisé pour assurer un chargement égal d'échantillons. hpi = heures après l'infection.
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Discussion
Dans cet article, vidéo, nous décrivons une méthode pour étudier aiguë épithélium cornéen infection HSV-1 dans un modèle ex vivo. Ce modèle est un tremplin utile entre le in vitro et dans des modèles in vivo de l', car elle permet de valider physiologiquement précise des résultats de culture cellulaire et, par conséquent, limite le montant de l'expérimentation animale qui doit être effectuée. En outre, le modèle ex vivo fournit une occasion unique et précieuse pour étudier épithéliale infection d'herpès dans intactes cornées humaines. Ci-dessous sont quelques considérations qui doivent être prises en compte lors de l'utilisation de ce modèle:
- Il est important de souligner que l'approche décrite dans cet article la vidéo n'est pas destiné à être un modèle de kératite herpétique, mais plutôt un modèle d'épithélium cornéen aigu infection HSV-1. Kératite herpétique est le résultat de plusieurs processus de confusion, y compris l'infection, l'inflammation et l'im hôteMUNE réponse au virus. Spécifiques de l'antigène CD4 + et CD8 + réponses des lymphocytes T sont une composante importante de la pathogénie de la kératite herpétique, qui ne peuvent être reproduits dans ce modèle, car des cornées explantées ne sont pas soumis à l'infiltration par des cellules du système immunitaire. Pour cette raison, ils ne développent pas les ulcères dendritiques typiques épithéliales et stromales n'ont pas la participation classiquement observées dans la kératite herpétique stromal 3. Par conséquent, la notation de la sévérité de la maladie et de l'imagerie fluorescéine des ulcères de la cornée n'est pas possible dans le modèle ex vivo. En outre, la plupart des cas de kératite herpétique sont causées par une réactivation du virus de la latence. Depuis notre approche repose sur l'infection directe des cornées explantées par le virus exogène, il modélise aiguë HSV-1 infection de la cornée et de réactivation de la maladie non. Pour ces raisons, le modèle présenté ici n'est pas approprié pour la compréhension de l'ensemble pathologie de la maladie, mais plutôt should être utilisé pour étudier la réplication virale et interactions virus-hôte strictement dans l'épithélium cornéen.
- Les ex vivo herpès kératite modèle donne des résultats avec une plus grande variabilité que les expériences in vitro de culture de tissus. Ceci est probablement dû au fait que chaque cornée sont recueillies à partir d'un lapin différent et peut être traité un peu différemment. Cornées humaines montrent une variabilité encore plus de résultats que les cornées de lapins, car ils proviennent de donneurs d'âge variable, la race et l'état de santé, et sont conservées pour différentes quantités de temps post-mortem. Cependant, avec l'utilisation d'au moins cinq cornées par un traitement expérimental, nous avons été en mesure de produire des données fiables statistiquement.
- La méthode traditionnelle de culture explanté 4-5 cornées suggère d'utiliser un milieu de culture juste assez pour couvrir le limbe de la cornée. Nous avons constaté que l'augmentation de la quantité de milieu pour couvrir complètement l'épithélium donne des résultats plus cohérents,probablement due à minimiser les différences entre l'accès cornées individuels pour les médicaments expérimentaux à moyen et y sont contenues.
- Lors de l'utilisation des cornées de lapin pour toute application utilisant des anticorps, il est important de garder à l'esprit que les anticorps traditionnels avec des spécificités pour l'homme, la souris, le rat, etc sont susceptibles de ne pas de réaction croisée contre les antigènes de lapin. En outre, secondaires anticorps anti-lapin de cours ne peut pas être utilisé dans ces applications. Pour ces raisons, nous utilisons cornées humaines dans des expériences de marquage par anticorps des cibles cellulaires.
- Lors de la collecte des cellules épithéliales de l'analyse par cytométrie de flux, l'expérimentateur doit être prudent sur les effets de la trypsine sur membranaires des protéines. Ainsi, pour la détection des protéines de surface, il peut être avantageux d'utiliser d'autres moyens de déloger les cellules, telles que les collagénases ou non-trypsine protéases.
- Les modèles animaux de kératite herpétique compter sur la scarification cornéenne avant l'inoculation avecle virus. Nous avons été en mesure d'atteindre des niveaux constants de l'infection sans sacrifier les cornées explantées. Ceci est probablement dû à l'absence du film lacrymal et clignote rapidement que d'éliminer le virus de la surface de la cornée chez un animal vivant.
Les modifications possibles du modèle in vivo kératite herpétique ex pas exploré dans cet article la vidéo:
- La modification génétique des cellules épithéliales cornéennes avant l'infection HSV-1 en utilisant des méthodes de délivrance d'ADN utilisés dans la culture cellulaire et dans la recherche en thérapie génique, comme la transfection, la livraison virale, et 6 gunitage gène.
- L'utilisation de la GFP exprimant HSV-1 7-8 ou conjugués au FITC anticorps anti-HSV 9-10 à évaluer visuellement l'étendue de l'infection.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
L'appui de la Banque d'yeux des Lions du Delaware Valley a été inestimable pour ce travail. Anticorps de souris monoclonal primaire contre ICP8 était un gentil cadeau du Dr David Knipe (Harvard Medical School). Nous remercions également le Dr Stephen Jennings (Drexel University College of Medicine) et le Dr Peter Laibson (Wills Eye Institute) pour des discussions utiles et d'expertise.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Mediatech, Inc. | 10-010-CV | |
| Non-Essential Amino Acids (100x solution) | Mediatech, Inc. | 25-025-CI | |
| L-Glutamine | Mediatech, Inc. | 25-005-CI | |
| Penicillin G Sodium Salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Streptomycin Sulfate Salt | Sigma-Aldrich | S9137 | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Prepared in Lab | N/A | |
| Trypsin EDTA (1x) | Mediatech, Inc. | 25-053-CI | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Laemmli Buffer | Prepared in Lab | N/A | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Whole Rabbit Eyes (Young) | Pel-Freez Biologicals | 41211-2 | |
| Human Corneas and Whole Eyes | Local Supplier | N/A | |
| 12 Well Porcelain Spot Plate | Avogadro’s Lab Supply | 1877 | |
| 35 mm Tissue Culture Dish | Falcon BD | 353001 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Cryomold Intermediate | Tissue-Tek | 4566 |
References
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- Holmberg, B. J.
- Remeijer, L., Osterhaus, A., Verjans, G. Human herpes simplex virus keratitis: the pathogenesis revisited. Ocul. Immunol. Inflamm. 12, 255-285 (2004).
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- Xu, K. P., Li, X. F., Yu, F. S. Corneal organ culture model for assessing epithelial responses to surfactants. Toxicol. Sci. 58, 306-314 (2000).
- Klausner, E. A., Peer, D., Chapman, R. L., Multack, R. F., Andurkar, S. V.
- Halford, W. P. ICP0 antagonizes Stat 1-dependent repression of herpes simplex virus: implications for the regulation of viral latency. Virol. J. 3, 44 (2006).
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