Summary
이 동영상 글에서 우리는 새로운의 사용을 설명
Abstract
헤르페스 각막염은 헤르페스 심플 바이러스 타입 1 (HSV-1)과 관련된 가장 심각한 pathologies 중 하나입니다. 헤르페스 각막염은 현재 선진국에서 모두 각막 - 파생 및 감염 관련 실명의 가장 큰 원인입니다. 헤르페스 각막염의 전형적인 프리젠 테이션, 흉터 등 영구적 인 각막 pathologies로 이어지는 시닝, 그리고 불투명도 1, 각막 상피의 감염, 때로는 깊은 각막 기질과 내피가 포함되어 있습니다.
각막 HSV-1 감염은 전통적으로 실험 모델의 두 가지 유형에서 공부하고 있습니다. 각막 상피 세포의 배양 monolayers는 배양 접시에 감염되는 체외 모델에이 간단, replicability의 높은 수준, 빠른 실험, 그리고 상대적으로 낮은 비용을 제공합니다. 한편, 토끼 나 쥐와 같은 동물이 각막에 직접 주사되는 생체 모델에는 매우 복잡한 생리를 제공합니다시스템,하지만 높은 비용, 더 이상 실험 필요한 동물 보호, 그리고 변화의 큰 학위를 취득했습니다.
이 비디오 문서에서는, 우리는 생체 모델의 체외과 모두의 장점을 결합하여 각막 상피 HSV-1 감염의 새로운 전직의 생체 모델에 대한 자세한 데모를 제공합니다. 예 생체 모델은 organotypically 문화에 유지 관리 및 HSV-1에 감염된 그대로 각막을 활용합니다. 예 생체 모델의 사용은 높은 생리 학적 기반의 결론은 가능하지만 그건 오히려 저렴하고 체외 모델에서의 비교 시간 약속을해야합니다.
Protocol
모든 시약 및 장비 무균 구입 또는 이전 절차 살균되었다. 이 문서는 미리 enucleated 눈으로 시작 전 생체 모델을 설정하는 단계를 설명합니다. 우리의 실험에서, 우리는 젊은 (8-12 wks) 흰둥이 토끼 (펠 - Freez 체액, 로저스, AR)에서 신선한 전체 눈알을 사용합니다. 또한, 우리는 지역 안구 은행에서 얻은 인간의 각막을 사용합니다. 핵의 제거를 직접 수행하는 경우, 절차를 수행하는 동안 각막 또는 limbus 손상을 방지하는데주의를 기울여야. 토끼 핵의 제거 절차가 다른 곳이 찾을 수 있습니다.
1 부 : Corneoscleral 버튼의 절단
- PBS와 거즈의 좁은 스트립을 습식 및 절차를 수행하는 동안 잡고 용이하게하기 위해 안구 두르고.
- 약 0.5 cm 떨어진 limbus에서 공막에 접선 절개를하기 위해 날카로운 메스를 사용하십시오.
- 절개를 확장하는 날카로운 가위를 사용하여 C 완전히 소비세orneoscleral 버튼을 클릭합니다.
- corneoscleral 버튼이 분리되면 집게와 scleral 림을 누른 상태, 아이리스 거리 애타게. 내피를 손상하거나 각막에 과도한 스트레스를 발휘하지 마십시오.
2 부 : Organotypic 문화에 각막 소개
- Explanted 각막은 비 필수 아미노산 (1X), L-글루타민 (2 ㎜), 페니실린 (200 U / ML) 및 스트렙토 마이신 (200 μg / ML)로 보충 최소 필수 매체 (가상)에 배양되어 있습니다. 필요한 경우에는 amphotericin 같은 항 곰팡이 요원이도 추가 할 수 있습니다.
- 55 ° C.에서 문화 매체의 1 % 아가로 오스 솔루션을 준비하고 준비를 해 놓도록
- 철저히 멸균 PBS 함유 페니실린 (200 U / ML) 및 스트렙토 마이신 (200 μg / ML)에서 각막을 씻어.
- 멸균 현장 판의 잘으로 각막 상피 편을 배치합니다.
- 에 충분히 각막의 내피 오목에 아가로 오스 함유 미디어를 추가완전히 채우십시오. 아가로 오스를위한 ~ 1 분 더욱 강화 할 수 있습니다.
- 상피 표면을 커버 할 수있는 35mm 조직 배양 접시에 젤 비계 상피 쪽을 지원하고 추가 할 문화 매체로 각막를 놓습니다.
- 각막은 중간 변경 사항을 모든 48 시간으로 일주일 넘게이 방법으로 배양 할 수 있습니다.
HSV-1 감염 및 실험 약물로 치료 : 제 3 부
- 35mm 조직 배양 접시에 바이러스의 원하는 금액을 포함하는 매체 1 ML을 추가합니다. 우리는 보통 부담 KOS 각막 당 HSV-1 1x10 4 PFU로 감염. 우리 주식 titers는 CV-1 monolayers에 플라크의 assays를 수행하여 결정됩니다.
- 바이러스가 포함 된 매체로 다운 아가로 오스 발판 상피 측과 함께 각막를 놓습니다.
- 간헐적 흔들 때마다 10-15 분으로 1 시간에 감염 조직 문화 인큐베이터로 각막를 놓습니다.
- 1 시간 후, 바이러스 contai를 대기음매체 닝 및 잔류 바이러스 입자를 제거하는 PBS로 2 ~ 3 배를 헹굴.
- 다시 이전 위치로 각막을 놓고 상피 표면을 충당하기 위해 새로운 문화 매체를 추가 할 수 있습니다.
- 실험 치료 실험의 특성에 따라, 감염 전이나 후에 시작 할 수 있습니다.
- 문화 매체마다 48 시간으로 변경됩니다.
제 4 부 : 샘플 수집
- 상패 분석 분석을위한 매체가. 잘 매체를 섞어서 -80에서 상패 분석 또는 상점에 대한 즉시 사용 ° C 다른 시간 지점에서 샘플을 수집하면 나중에 사용하기 위해.
- DNA, RNA, 단백질, 또는 각막 상피 세포
- 아가로 오스 비계를 제거하고 PBS로 잘 각막을 씻어.
- 만 각막 상피 자료를 확보 할 수있는 각막에서 scleral 조직의 소비세 반지는 수집됩니다.
- 유메스를 노래 격리 할 재료의 종류에 따라 적절한 버퍼로 각막 상피 세포를 다 쳤어요. DNA와 RNA의 분리를 들어, 우리는 DNeasy 혈액 및 조직 Kit 및 RNeasy 미니 키트, 각각 (QIAGEN, Hilden, 독일)을 사용합니다. 단백질 lysates를 수집, 우리는 Laemmli 버퍼를 사용합니다. 각막 상피 세포의 유동 세포 계측법 분석을 위해, 우리는 세포를 느슨하게하는 트립신의 작은 금액을 각막을 사전에 배양 한 후 메스로 트립신으로를 제거. 조직의 동등한 양을 얻을하지 않습니다 각막 상피를 스크랩 때문에 샘플을 분석 할 때 적절한 컨트롤을 포함하는 것이 중요합니다. 우리는 서양 blots을위한로드 컨트롤로 참조 qPCRs의 유전자, 그리고 nucleolin 등의 qRT-PCRs, GAPDH에서 참조 녹취록 형식으로 18S rRNA의를 사용합니다.
- immunohistochemistry 또는 immunofluorescence을위한 조직 샘플
- 아가로 오스 비계를 제거하고 옥수수를 헹굼PBS과 잘 EA.
- 동영상에서와 같이 실험 목표에 따라, 파라핀 조직 블록 또는 냉동 조직 블록을 만들기 위해 각막을 사용합니다. 각막 조직 섹션을 준비 할 때 우리는 표준 절차를 따르십시오.
대표 결과
조직 문화의 세포를 연구에 사용할 수있는 방법의 대부분은 쉽게 HSV-1 예를 생체에 감염된 각막에 사용하기 위해 적용 할 수 있습니다. 여기에 표시는 HSV-1 감염을 공부에 적용되는 가장 일반적인 기술의 몇 가지에 대한 대표적인 결과입니다 - qPCR (그림 1D), qRT-PCR (그림 1B), 서양 얼룩 (그림 1 층), 상패 분석 (그림 1C) 및 조직 immunofluorescence (그림 1E).
1 그림. HSV-1 예 V에 감염된 각막 분석이보. 급성 각막 상피 HSV-1 감염의 전 생체 모델의 (A) 도식 표현. (BF)이 비디오 문서에서 설명하는 방법을 사용하여 감염된 각막의 분석. Explanted 토끼 각막이 변형 KOS HSV-1 1x10 4 PFU / 각막에 감염의 존재 (PAA) 또는 phosphonoacetic 산 (400 μg / ML), HSV 복제의 알려진 억제제의 부재 (모의)에서 배양 하였다. (B) 총 RNA는 지정된 시간 지점에서 수집되었고, 바이러스 전사는 HSV-1 효소에 대한 프리 머와 qRT-PCR에 의해 평가되었다. 18S rRNA에 대한 프리 머이는 참조로 사용되었습니다. N = 3. 오류 바 ± SEM을 나타냅니다. (C) 문화 매체 48 hpi에서 수집되었고, 전염성 입자 생산 CV-1 monolayers에서 상패 분석에 의해 평가되었다. (D) 총 DNA 48 hpi에서 수집되었고, 바이러스 게놈 복제에 평가 된 HSV-1 게놈에 대한 프리 머와 qPCR 분석. PRGAPDH에 대한 imers은 참조로 사용되었습니다. N = 3. 오류 바 ± SEM을 나타냅니다. (E) 모의 - 처리 각막이 sectioned 48 hpi,에 - 플래시 고정하고 감염된 상피 내에 바이러스 초기 단백질 (ICP8)의 존재에 대한 간접 immunofluorescence에 의해 분석 하였다. 핵은 Höchst 33,258으로 counterstained 있습니다. (F) 단백질 lysates 48 hpi에서 수집되었고, 바이러스 단백질 (ICP0)의 표현은 서양 얼룩에 의해 평가되었다. BCA 분석은 샘플의 동등한 로딩을 보장하기 위해 사용되었다. hpi는 = 시간 후 감염.
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Discussion
이 동영상 글에서 우리는 전직 생체 모델에서 급성 각막 상피 HSV-1 감염을 공부하는 방법을 설명합니다. 이 세포 배양 결과의 생리 학적 정확한 검증 가능하며,이를 통해, 수행해야합니다 동물 실험의 양을 제한하기 때문에이 모델은, 생체 모델의 체외에서와 사이에 유용한 스테핑 돌입니다. 또한, 전 생체 모델은 그대로 인간의 각막 상피에 헤르페스 감염을 연구 할 수있는 독특하고 귀중한 기회를 제공합니다. 이 모델을 사용할 때 고려되어야합니다 몇 가지 고려 사항은 다음과 같습니다 :
- 그것은이 비디오 문서에서 설명하는 접근 방식은 헤르페스 각막염의 모델이되고 의미하지 않는 것을 강조하는 것이 중요합니다, 오히려 급성 각막 상피 HSV-1 감염의 모델입니다. 헤르페스 각막염은 감염, 염증, 그리고 호스트 메신저 등 여러 혼란 프로세스의 결과입니다바이러스에 응답을 mune. 항원 특정 CD4 +와 CD8 + explanted 각막은 면역 시스템의 세포로 침투의 대상이되지 않기 때문에 T 세포 응답이 모델 복제 할 수 없습니다 헤르페스 각막염,의 pathogenesis의 중요한 구성 요소입니다. 이러한 이유로, 그들은 전형적인 상피 수지상의 궤양을 개발하고 고전적인 헤르페스 각막염 stromal 3에서 관찰 stromal 참여 부족하지 않습니다. 따라서 질병 심각도 및 각막 궤양의 fluorescein 영상의 골은 예 생체 모델에서 불가능합니다. 또한, 헤르페스 각막염의 대부분의 경우는 대기에서 바이러스 재 활성화로 인해 발생합니다. 우리의 접근 방식이 외인성 바이러스와 explanted 각막의 직접 감염에 의존하기 때문에, 그것은 심각한 HSV-1 감염 각막이 아닌 재 활성화 질병 모델. 이러한 이유로, 여기에 제시된 모델은 질병의 전반적인 병리를 이해에 적합한 아니라 쉬 없습니다ould은 각막 상피에 엄격 바이러스 성 복제 및 바이러스 호스트 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수.
- 체외 조직 배양 실험에서보다 더 큰 다양성이있는 전직 생체의 헤르페스 각막염 모델 수율 결과이다. 이 아마도 각각의 각막이 다른 토끼에서 수집되어 약간 다르게 처리 할 수 있다는 사실 때문입니다. 인간 각막은 변수 연령, 인종, 건강 상태의 기증자에서 발생한 있기 때문에 토끼 각막보다 결과의 더 큰 변화를 보여, 시간 사후의 다른 양에 대한 보존되어 있습니다. 그러나, 사용과 실험적인 치료 당 적어도 다섯 각막, 우리는 통계적으로 - 신뢰할 수있는 데이터를 생성 할 수있었습니다.
- 배양 explanted 각막 4-5의 전통적인 방법은 각막의 limbus을 충당하기 위해 충분한 문화 매체를 사용하여 제안합니다. 우리는 완전히 상피을 충당 할 매체의 양을 증가하는 것은 더 일관된 결과를 얻을 것을 발견가능성이 그 안에 포함되어있는 매체와 실험 약물에 대한 개인의 각막 '접속의 차이점을 최소화 때문입니다.
- 항체를 이용 모든 응용 프로그램에 대한 토끼 각막을 사용하는 경우, 그것은 인간, 마우스, 쥐 등으로 specificities 전통적인 항체는 토끼 항원에 대한 교차 반응 할 가능성이 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 또한, 코스의 2 차 항 토끼 항체는이 응용 프로그램에서 사용할 수 없습니다. 이러한 이유로, 우리는 세포 타겟 항체 염색법과 관련된 실험에서 인간의 각막을 사용합니다.
- 유동 세포 계측법 분석을위한 상피 세포를 수집 할 때, 실험은 막에 바인딩 단백질의 트립신의 효과에 대해주의해야합니다. 따라서, 표면 단백질의 검출을 위해, 그것은 이러한 collagenases 또는 비 트립신 프로테아제 등의 세포를 dislodging의 다른 방법을 사용하여 도움이 될 수 있습니다.
- 헤르페스 각막염의 동물 모델과 함께 사전에 접종에 각막 혹평에 의존바이러스. 우리는 explanted 각막을 scarifying하지 않고 감염의 일관된 수준을 달성 할 수있었습니다. 이 가능성이 가장 높은 눈물 영화 빠르게 라이브 동물의 각막 표면에서 바이러스를 제거하는 깜박의 부재 때문입니다.
예 생체의 헤르페스 각막염 모델의 잠재적 인 수정이 비디오 문서에 확인하지 :
- 세포 배양과 같은 transfection, 바이러스 전달 및 유전자 총을 겨 누며 6 등의 유전자 치료 연구에 활용 DNA 전달 방법을 사용하여 이전에 HSV-1 감염 각막 상피 세포의 유전자 변형.
- 사용 GFP-표현 HSV-1 감염 시각의 범위를 평가하는 7-8 또는 FITC-복합 항 HSV 항체 9-10.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
델라웨어 밸리의 라이온스 안구 은행의 지원은이 작품을 위해 귀중한했습니다. ICP8에 대한 기본 마우스 단클론 항체 박사 데이비드 Knipe (하버드 의과 대학)에서 일종의 선물이었다. 우리는 또한 도움이 토론과 전문 지식에 대한 박사 스티븐 제닝스 (의학 Drexel 대학 대학) 박사 피터 Laibson (유언장 안구 연구소)을 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Mediatech, Inc. | 10-010-CV | |
| Non-Essential Amino Acids (100x solution) | Mediatech, Inc. | 25-025-CI | |
| L-Glutamine | Mediatech, Inc. | 25-005-CI | |
| Penicillin G Sodium Salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Streptomycin Sulfate Salt | Sigma-Aldrich | S9137 | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Prepared in Lab | N/A | |
| Trypsin EDTA (1x) | Mediatech, Inc. | 25-053-CI | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Laemmli Buffer | Prepared in Lab | N/A | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Whole Rabbit Eyes (Young) | Pel-Freez Biologicals | 41211-2 | |
| Human Corneas and Whole Eyes | Local Supplier | N/A | |
| 12 Well Porcelain Spot Plate | Avogadro’s Lab Supply | 1877 | |
| 35 mm Tissue Culture Dish | Falcon BD | 353001 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Cryomold Intermediate | Tissue-Tek | 4566 |
References
- Kaye, S., Choudhary, A.
- Holmberg, B. J.
- Remeijer, L., Osterhaus, A., Verjans, G. Human herpes simplex virus keratitis: the pathogenesis revisited. Ocul. Immunol. Inflamm. 12, 255-285 (2004).
- Foreman, D. M., Pancholi, S., Jarvis-Evans, J., McLeod, D., Boulton, M. E. A simple organ culture model for assessing the effects of growth factors on corneal re-epithelialization. Exp. Eye Res. 62, 555-564 (1996).
- Xu, K. P., Li, X. F., Yu, F. S. Corneal organ culture model for assessing epithelial responses to surfactants. Toxicol. Sci. 58, 306-314 (2000).
- Klausner, E. A., Peer, D., Chapman, R. L., Multack, R. F., Andurkar, S. V.
- Halford, W. P. ICP0 antagonizes Stat 1-dependent repression of herpes simplex virus: implications for the regulation of viral latency. Virol. J. 3, 44 (2006).
- Bhattacharjee, P. S. Effective treatment of ocular HSK with a human apolipoprotein E mimetic peptide in a mouse eye model. Invest Ophthalmol Vis. Sci. 49, 4263-4268 (2008).
- Novitskaya, E. S. Difficulties imaging herpes simplex keratitis with fluorescein isothiocynate-labeled anti-HSV-1 antibodies in an ex vivo model. Cornea. 28, 421-425 (2009).
- Sharma, A., Shimeld, C. In vivo immunofluorescence to diagnose herpes simplex virus keratitis in mice. Br. J. Ophthalmol. 81, 785-788 (1997).
