Summary
В этом видео статье мы опишем использование нового
Abstract
Герпетический кератит является одним из самых тяжелых патологий, связанных с вирусом простого герпеса типа 1 (HSV-1). Герпетический кератит настоящее время является ведущей причиной как роговица-инфекции получены и связанных слепоты в развитых странах мира. Типичные презентации кератит герпеса включает в себя инфекцию эпителия роговицы, а иногда и более глубокие стромы роговицы и эндотелия, что приводит к такому постоянному роговицы патологий, как рубцы, истончения и прозрачность 1.
Роговицы HSV-1 инфекции традиционно изучается в двух типах экспериментальных моделей. В пробирке модель, в которой культурная монослоев эпителиальные клетки роговицы инфицированных в чашке Петри, предлагает простоту, высокую воспроизводимость, быстрый экспериментов, и относительно низких затратах. С другой стороны, в естественных условиях модель, в которой животные, такие как кролики или мыши прививку прямо в роговицу, предлагает весьма сложные физиологическиесистеме, но имеет более высокую стоимость, больше экспериментов, необходимых ухода за животными, и в большей степени изменчивости.
В этом видео статье, мы предоставляем подробную демонстрацию новых моделей естественных бывший роговичного эпителиального HSV-1 инфекции, которая сочетает в себе сильные стороны обоих в пробирке и в естественных условиях модели. Экс модели естественных использует нетронутой роговицы organotypically поддерживаться в культуре и инфицированных ВПГ-1. Использование бывшей моделью естественных условиях позволяет высоко физиологически обоснованные выводы, но это сравнительно недорогой и требует времени приверженность сравнима с моделью в пробирке.
Protocol
Все реагенты и оборудование были приобретены стерильные или были стерилизованы до процедуры. В данной статье описываются шаги создания экс модели естественных условиях, начиная с предварительного энуклеированных глаз. В наших экспериментах мы используем свежие целые глазные яблоки из молодых (8-12 недель) кроликов-альбиносов (Pel-Freez биологические препараты, Rogers, AR). Кроме того, мы используем человеческие роговицы получить в местном банке глаз. При выполнении энуклеации себя, заботиться, чтобы избежать повреждения роговицы или лимба во время процедуры. Протоколы Кролик энуклеации может быть найден в другом месте 2.
Часть 1: Удаление корнеосклеральных Button
- Намочите узкую полоску марли с PBS и оберните его вокруг глазного яблока для облегчения держа его во время процедуры.
- Используйте острый скальпель, чтобы сделать тангенциальный разрез в склере, около 0,5 см от лимба.
- Используйте острые ножницы, чтобы расширить разрез и полностью акциз сorneoscleral кнопку.
- После того, корнеосклеральных кнопки изолированы, дразнить от радужной оболочки, удерживая склеры обода щипцами. Избегайте повреждения эндотелия или оказывают чрезмерную нагрузку на роговице.
Часть 2: Введение роговицы в органотипической культуре
- Эксплантированных роговицы культивируют в минимальную поддерживающую среду (MEM) с добавлением Номера для незаменимых аминокислот (1X), L-глютамин (2 мМ), пенициллина (200 ЕД / мл) и стрептомицин (200 мкг / мл). Противогрибковые средства, такие как амфотерицин, также могут быть добавлены в случае необходимости.
- Подготовьте 1% агарозном решение в культуральной среде и храните его при температуре 55 ° C.
- Тщательно промойте роговицы в стерильном PBS, содержащих пенициллин (200 ед / мл) и стрептомицин (200 мкг / мл).
- Поместите роговицы эпителиальная стороной вниз в колодец, из стерильную чашку месте.
- Добавить в агарозном среде, содержащей в эндотелиальных вогнутость роговицы достаточно, чтобызаполнить его полностью. Разрешить ~ 1 мин для агарозы, чтобы затвердеть.
- Поместите роговицы с поддержкой гель эшафот эпителиальных стороной в 35 мм блюдо культуры ткани и добавить культуральной среды для покрытия поверхности эпителия.
- Роговицы можно культивировать таким образом в течение недели, со средним меняется каждые 48 часов.
Часть 3: инфекции ВПГ-1 и лечение экспериментальных препаратов
- Добавить 1 мл среды, содержащей необходимое количество вируса в 35 мм блюдо культуры ткани. Мы обычно заразить 1x10 4 PFU штамма KOS ВПГ-1 в роговице. Наши титры акции определяется путем проведения анализов налет на CV-1 монослоев.
- Поместите роговицы вместе с агарозном эшафот эпителиальных стороной вниз в вирус-содержащую среду.
- Поместите роговицы в культуре ткани инкубатора, чтобы заразить в течение 1 часа с периодическим качалки каждые 10-15 мин.
- Через 1 час, аспирации вируса ContaiНин среднего и промыть 2-3 раза с PBS, чтобы удалить остатки вирусных частиц.
- Поместите роговицы обратно в свои прежние позиции и добавьте свежую питательную среду для покрытия поверхности эпителия.
- Экспериментальное лечение может быть начато до или после инфекции, в зависимости от характера эксперимента.
- Культура среду меняли каждые 48 часов.
Часть 4: сбора проб
- Средний налет на анализе анализа. Смешать среду хорошо, и использовать его непосредственно для анализа бляшки или хранить при -80 ° C для дальнейшего использования при сборе образцов в различные моменты времени.
- ДНК, РНК, белков или клеток из эпителия роговицы
- Снимите агарозном леса и промойте роговицы хорошо с PBS.
- Акцизный кольцо склеры ткани роговицы, чтобы гарантировать, что только эпителия роговицы материал собран.
- Uпеть скальпель, соскрести эпителиальные клетки роговицы в соответствующий буфер, в зависимости от типа материала, который будет изолирован. Для выделения ДНК и РНК, мы используем DNeasy Kit крови и тканей и RNeasy Mini Kit, соответственно (QIAGEN, Hilden, Германия). Для сбора белка лизатов, мы используем Laemmli буфера. Для проточной цитометрии анализа эпителиальные клетки роговицы, мы предварительно инкубировать роговицы в небольшое количество трипсина, чтобы ослабить клетки, а затем выбить их в трипсин с помощью скальпеля. С соскоб эпителия роговицы не дает равное количество ткани, важно включить соответствующие управления при анализе образцов. Мы используем 18S рРНК в качестве ссылки в стенограмме QRT-ПЦР, GAPDH как ссылку гена в qPCRs, и нуклеолина в качестве контроля загрузки для западных помарки.
- Образцы тканей для иммуногистохимии или иммунофлюоресценции
- Снимите агарозном леса и промойте кукурузуеа, а с PBS.
- В зависимости от вашего экспериментальные цели, использовать роговицы, чтобы сделать блок парафин ткани или замороженных блоков ткани, как показано на видео. Мы будем следовать стандартным процедурам при подготовке роговицы срезов.
Представитель Результаты
Большинство методов, доступных для изучения клеток в культуре ткани могут быть легко адаптированы для использования в роговицу инфицированных ВПГ-1, бывший естественных условиях. Показанный здесь представитель результаты для некоторых из наиболее распространенных методов, применимых к изучению HSV-1 инфекции - КПЦР (рис. 1D), QRT-PCR (рис. 1б), Вестерн-блоттинга (рис. 1F), бляшек (рис. 1С), и ткани иммунофлюоресценции (рис. 1E).
Рисунок 1. Анализ роговицы инфицированных ВПГ-1, бывший VИво. (А) Схематическое изображение экс модели естественных условиях острого эпителия роговицы HSV-1 инфекции. (BF) анализ роговицы инфицированных помощью метода, описанного в этой статье видео. Эксплантированных роговицы кроликов были заражены 1x10 4 PFU / роговицу штамм KOS ВПГ-1 и культивировали в присутствии (ЧУК) или отсутствия (макет) из phosphonoacetic кислота (400 мкг / мл), известный ингибитор репликации HSV. (B) Тотальная РНК была собрана в указанных точках времени, и вирусные транскрипции была оценена QRT-PCR с праймерами для HSV-1-полимеразы. Грунтовки против 18S рРНК были использованы в качестве ссылки. п = 3. Ошибка полоски показывают ± SEM. (C) Культура среде было собрано на 48 HPI, производство и инфекционных частиц оценивали по бляшек на CV-1 монослоев. (D) Всего ДНК были собраны в 48 HPI, и репликации вирусного генома была оценена в КПЦР анализа с праймерами для HSV-1 генома. Primers против GAPDH были использованы в качестве ссылки. п = 3. Ошибка полоски показывают ± SEM. (E) Макет обработанной роговицы флэш-заморожено на 48 HPI, срезы и проанализированы непрямой иммунофлюоресценции на наличие вирусных рано белка (ICP8) в инфицированных эпителия. Ядра контрастно Хехст 33258. (F) Белки лизатов были собраны в 48 HPI, и экспрессия вирусных белков (ICP0) оценивалась с помощью Вестерн-блоттинга. BCA анализа была использована для обеспечения равного загрузки образцов. HPI = часов после инфицирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом видео статье мы опишем метод изучения острых эпителия роговицы HSV-1 инфекции в бывшей моделью естественных условиях. Эта модель является полезной ступенью между в пробирке и в естественных условиях модели, поскольку она позволяет физиологически точную проверку результатов культуре клеток и, тем самым, ограничивает количество экспериментов на животных, которые должны быть выполнены. Кроме того, бывшая модель естественных условиях представляет собой уникальную и бесценную возможность учиться эпителиальных герпетической инфекции в интактной роговицы человека. Ниже перечисляются некоторые соображения, которые должны быть приняты во внимание при использовании этой модели:
- Важно подчеркнуть, что подход, изложенный в этой статье видео не предназначено, чтобы быть моделью кератит герпеса, но это скорее модель острого эпителия роговицы HSV-1 инфекции. Герпетический кератит является результатом нескольких смешанные процессы, включая инфекции, воспаления, и хозяин имиммунного ответа на вирус. Антиген-специфические CD4 + и CD8 + Т-клеточного ответа являются важным компонентом патогенеза герпетический кератит, который не может быть воспроизведен в эту модель, потому что эксплантированных роговица не подлежат инфильтрацией клетками иммунной системы. По этой причине, они не развиваются типичные дендритные эпителиальные язвы и отсутствие стромальных участии классически наблюдается в герпеса стромальных кератитах 3. Таким образом, забив тяжести заболевания и флуоресцеина изображений язвы роговицы не представляется возможным в бывшей моделью естественных условиях. Кроме того, в большинстве случаев кератит герпеса вызваны вирусной реактивации с задержкой. Поскольку наш подход основан на прямом инфекции эксплантированных роговицы с экзогенным вирусом, он моделирует острой ВПГ-1 инфекции роговицы, а не реактивации заболевания. По этим причинам, модель, представленная здесь, не подходит для понимания общей патологии заболевания, а шульд быть использованы для изучения репликации вируса и вирус-хозяин взаимодействий строго в эпителии роговицы.
- Экс естественных герпетический кератит модель дает результаты с большей изменчивостью, чем в экспериментах пробирке культуре ткани. Вероятно, это связано с тем, что каждый роговицы собрана из различных кролика и могут быть обработаны несколько иначе. Роговица человека показать еще большей изменчивостью результатов, чем кролик роговицы, потому что они исходят от доноров переменная возраст, раса, и состояние здоровья, и сохраняются для разного количества времени после смерти. Тем не менее, с использованием по меньшей мере пять роговицы на экспериментальное лечение, мы были способны генерировать статистически достоверных данных.
- Традиционный метод культивирования эксплантированных роговицы 4-5 предлагается использовать достаточно питательной среде для покрытия лимба роговицы. Мы обнаружили, что увеличение количества средних, чтобы полностью покрыть эпителия дает более надежные результаты,вероятно, за счет минимизации различий между отдельными доступа роговицы к среде и экспериментальные препараты, содержащиеся в нем.
- При использовании роговицы кролика для любого приложения, используя антитела, важно иметь в виду, что традиционные антител с особенностями для человека, мыши, крысы и т.д., скорее всего, не перекрестно реагируют с антигенами кролика. Кроме того, вторичные анти-антител кролика, конечно, не может быть использована в этих приложениях. По этим причинам, мы используем человеческие роговицы в экспериментах с антителами окрашивания клеточных мишеней.
- При сборе эпителиальных клеток для анализа потока цитометрии, экспериментатор должен быть осторожным о воздействии трипсина на мембраносвязанных белков. Таким образом, для выявления поверхностных белков, это может быть выгодно использовать другие средства выбить клеток, таких как коллагеназы или не трипсином протеаз.
- Животные модели кератит герпеса полагаться на роговице скарификации до инокуляциивирус. Мы смогли добиться согласованных уровней инфекции без фрезерования эксплантированных роговицы. Скорее всего, это связано с отсутствием слезной пленки и моргая, которые быстро избавиться от вируса поверхности роговицы в живых животных.
Потенциальные модификации экс модели естественных кератит герпеса не исследовал в этом видео статье:
- Генетическая модификация эпителиальные клетки роговицы до HSV-1 инфекции с помощью доставки ДНК методы, используемые в культуре клеток и генной терапии исследований, таких как трансфекции, вирусные доставки, и ген торкрет-6.
- Использование GFP-экспрессирующих HSV-1 или 7-8 FITC-сопряженных анти-HSV антител 9-10 визуально оценить степень заражения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Поддержке Банка Lions глаз Delaware Valley был бесценен для этой работы. Первичные мышиные моноклональные антитела против ICP8 был своего рода подарок от доктора Дэвида Knipe (Harvard Medical School). Мы также благодарим д-р Стивен Дженнингс (Drexel University медицинский колледж) и д-р Питер Laibson (завещания Eye Institute) за полезные обсуждения и экспертизы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Mediatech, Inc. | 10-010-CV | |
| Non-Essential Amino Acids (100x solution) | Mediatech, Inc. | 25-025-CI | |
| L-Glutamine | Mediatech, Inc. | 25-005-CI | |
| Penicillin G Sodium Salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Streptomycin Sulfate Salt | Sigma-Aldrich | S9137 | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Prepared in Lab | N/A | |
| Trypsin EDTA (1x) | Mediatech, Inc. | 25-053-CI | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Laemmli Buffer | Prepared in Lab | N/A | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Whole Rabbit Eyes (Young) | Pel-Freez Biologicals | 41211-2 | |
| Human Corneas and Whole Eyes | Local Supplier | N/A | |
| 12 Well Porcelain Spot Plate | Avogadro’s Lab Supply | 1877 | |
| 35 mm Tissue Culture Dish | Falcon BD | 353001 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Cryomold Intermediate | Tissue-Tek | 4566 |
References
- Kaye, S., Choudhary, A.
- Holmberg, B. J.
- Remeijer, L., Osterhaus, A., Verjans, G. Human herpes simplex virus keratitis: the pathogenesis revisited. Ocul. Immunol. Inflamm. 12, 255-285 (2004).
- Foreman, D. M., Pancholi, S., Jarvis-Evans, J., McLeod, D., Boulton, M. E. A simple organ culture model for assessing the effects of growth factors on corneal re-epithelialization. Exp. Eye Res. 62, 555-564 (1996).
- Xu, K. P., Li, X. F., Yu, F. S. Corneal organ culture model for assessing epithelial responses to surfactants. Toxicol. Sci. 58, 306-314 (2000).
- Klausner, E. A., Peer, D., Chapman, R. L., Multack, R. F., Andurkar, S. V.
- Halford, W. P. ICP0 antagonizes Stat 1-dependent repression of herpes simplex virus: implications for the regulation of viral latency. Virol. J. 3, 44 (2006).
- Bhattacharjee, P. S. Effective treatment of ocular HSK with a human apolipoprotein E mimetic peptide in a mouse eye model. Invest Ophthalmol Vis. Sci. 49, 4263-4268 (2008).
- Novitskaya, E. S. Difficulties imaging herpes simplex keratitis with fluorescein isothiocynate-labeled anti-HSV-1 antibodies in an ex vivo model. Cornea. 28, 421-425 (2009).
- Sharma, A., Shimeld, C. In vivo immunofluorescence to diagnose herpes simplex virus keratitis in mice. Br. J. Ophthalmol. 81, 785-788 (1997).
