Summary
En este artículo de vídeo se describe el uso de un nuevo
Abstract
La queratitis herpética es una de las patologías más graves asociadas con el virus del herpes simple de tipo 1 (HSV-1). La queratitis herpética es actualmente la principal causa de ceguera tanto córnea-derivado y las infecciones asociadas-en el mundo desarrollado. Presentación típica de la queratitis por herpes incluye la infección del epitelio corneal y el estroma a veces córnea más profunda y el endotelio, lo que conduce a patologías corneales tales como cicatrices permanentes, adelgazamiento, y la opacidad 1.
Corneal infección HSV-1 es tradicionalmente estudiado en dos tipos de modelos experimentales. El modelo in vitro, en el que las monocapas de cultivo de células epiteliales corneales infectadas en una placa de Petri, ofrece simplicidad, alto nivel de replicabilidad, experimentos rápidos y los costos relativamente bajos. Por otro lado, el modelo in vivo, en el que los animales tales como conejos o ratones se inoculan directamente en la córnea, ofrece una fisiológica altamente sofisticadosistema, pero tiene costos más altos, más largos experimentos, cuidado de animales necesario, y un mayor grado de variabilidad.
En este artículo de vídeo, se proporciona una demostración detallada de un modelo ex vivo de nuevo corneal epitelial infección HSV-1, que combina las ventajas tanto de la vitro y en modelos in vivo en el. El modelo ex vivo utiliza córneas intactas organotypically mantenidas en cultivo e infectadas con HSV-1. El uso del modelo ex vivo permite conclusiones altamente fisiológicamente basadas, sin embargo, es bastante barato y requiere dedicación de tiempo comparable a la del modelo in vitro.
Protocol
Todos los reactivos y equipos se compraron estéril o se esterilizaron antes del procedimiento. En este artículo se describen los pasos para la implantación del modelo ex vivo a partir de la vista pre-enucleado. En nuestros experimentos, utilizamos ojos frescos enteros de jóvenes (8-12 semanas) conejos albinos (Pel-Freez Biologicals, Rogers, AR). Además, utilizamos córneas humanas obtenidas a partir del banco de ojos local. Si se realiza enucleación usted mismo, tenga cuidado de no dañar la córnea o el limbo durante el procedimiento. Protocolos de conejo enucleación se puede encontrar en otra parte 2.
Parte 1: La escisión del botón Corneoscleral
- Moje una estrecha franja de gasa con PBS y se envuelve alrededor del globo ocular para facilitar la celebración durante el procedimiento.
- Utilice un bisturí afilado para hacer una incisión en la esclerótica tangencial, de aproximadamente 0,5 cm de distancia del limbo.
- Use tijeras afiladas para extender la incisión y completamente cortar el corneoscleral botón.
- Una vez que el botón corneoescleral se aísla, se burlan de lejos el iris mientras sostiene el borde escleral con fórceps. Evite dañar el endotelio o ejercer una tensión excesiva en la córnea.
Parte 2: Introducción de la córnea en cultivo organotípico
- Córneas explantados se cultivaron en medio esencial mínimo (MEM) suplementado con no aminoácidos esenciales (1X), L-glutamina (2 mM), penicilina (200 U / ml) y estreptomicina (200 ug / ml). Un agente antifúngico, tal como anfotericina, también se puede añadir si es necesario.
- Preparar una solución al 1% de agarosa en medio de cultivo y mantenerlo listo a 55 ° C.
- Enjuague completamente la córnea en PBS estéril que contiene penicilina (200 U / ml) y estreptomicina (200 ug / ml).
- Coloque el lado epitelial de la córnea hacia abajo en un pocillo de una placa estéril lugar.
- Añadir el medio de agarosa que contiene a la concavidad endotelial de la córnea justo lo suficiente parallenar por completo. Permitir ~ 1 min para que la agarosa se solidifique.
- Coloque la córnea con el medio de cultivo de soporte de gel de andamio lado epitelial hacia arriba en una placa de cultivo tisular de 35 mm y añadir a cubrir la superficie epitelial.
- La córnea puede ser cultivado de este modo por más de una semana, con cambios de medio cada 48 horas.
Parte 3: La infección por HSV-1 y el tratamiento con medicamentos experimentales
- Añadir 1 ml de medio que contiene la cantidad deseada de virus en una placa de cultivo tisular de 35 mm. Por lo general infectan con 1x10 4 PFU de la cepa KOS de HSV-1 por córnea. Los títulos valores se determinan mediante la realización de ensayos de placas en monocapas de CV-1.
- Coloque la córnea, junto con el lado de agarosa andamio epitelial hacia abajo en el medio que contiene virus.
- Coloque la córnea en una incubadora de cultivo de tejido para infectar durante 1 hora con agitación intermitente cada 10-15 minutos.
- Después de 1 hora, aspirar el virus-contaiNing medio y enjuague 2-3 veces con PBS para eliminar cualquier partícula viral residual.
- Coloque la córnea vuelve a su posición anterior y se añade medio de cultivo fresco para cubrir la superficie epitelial.
- Los tratamientos experimentales se puede iniciar antes o después de la infección, dependiendo de la naturaleza del experimento.
- El medio de cultivo se cambió cada 48 horas.
Parte 4: Toma de Muestras
- Medio para el análisis de la placa de ensayo. Mezclar bien el medio y utilizar de inmediato para un ensayo de placa o almacenar a -80 ° C para su uso posterior si la recolección de muestras en diferentes puntos temporales.
- ADN, ARN, proteína o células de epitelio corneal
- Retire el andamio de agarosa y enjuague bien la córnea con PBS.
- Escindir el anillo de tejido de la esclerótica de la córnea para asegurar que el material epitelial corneal sólo se recoge.
- Ucantar un escalpelo, raspar las células epiteliales de la córnea en el tampón apropiado, en función del tipo de material a ser aislado. Para el aislamiento de ADN y ARN, se utiliza el kit DNeasy Blood & Tissue y el kit RNeasy Mini, respectivamente (QIAGEN, Hilden, Alemania). Para la recolección de los lisados de proteínas, se utiliza tampón Laemmli. Para el análisis de citometría de flujo de células epiteliales corneales, se pre-incuban las córneas en una pequeña cantidad de tripsina para desprender las células y, a continuación desalojarlos en tripsina con un escalpelo. Desde raspado el epitelio corneal no produce cantidades iguales de tejido, es importante incluir controles adecuados en el análisis de las muestras. Usamos ARNr 18S como un transcrito de referencia en QRT-PCR, GAPDH como un gen de referencia en qPCRs, y nucleolina como control de carga para las transferencias Western.
- Las muestras de tejidos para inmunohistoquímica o inmunofluorescencia
- Retire el andamio de agarosa y enjuagar el maízea bien con PBS.
- Dependiendo de su objetivo experimental, el uso de la córnea para hacer un bloque de tejido en parafina o un bloque de tejido congelado, como se muestra en el vídeo. Seguimos procedimientos estándar en la preparación de secciones de tejido corneal.
Los resultados representativos
La mayoría de los métodos disponibles para el estudio de células en cultivo de tejidos puede ser fácilmente adaptado para el uso en las córneas infectadas con HSV-1 ex vivo. Aquí se presentan resultados representativos de algunas de las técnicas más comunes aplicables al estudio de la infección por HSV-1 - qPCR (Figura 1 D), QRT-PCR (Figura 1B), Western blot (Figura 1F), la placa de ensayo (Figura 1 C), y tejido de inmunofluorescencia (Figura 1E).
Figura 1. Análisis de las córneas infectadas con HSV-1 v exivo. (A) Representación esquemática del modelo ex vivo de aguda corneal epitelial infección HSV-1. (BF) Análisis de córneas infectadas utilizando el método descrito en este artículo de vídeo. Explantados córneas de conejo fueron infectadas con 1x10 4 PFU / córnea de la cepa KOS de HSV-1 y se cultivaron en presencia (PAA) o ausencia (Mock) de ácido fosfonoacético (400 ug / ml), un inhibidor conocido de la replicación del HSV. (B) El ARN total se recogieron en los puntos de tiempo indicados, y la transcripción viral se evaluó mediante qRT-PCR con cebadores para HSV-1 polimerasa. Primers contra 18S rRNA fueron utilizados como una referencia. n = 3. Las barras de error indican ± SEM. (C) El medio de cultivo se recogió a 48 hpi, y la producción de partículas infecciosas se evaluó mediante ensayo en placa sobre monocapas de CV-1. (D) El ADN total se recogió a 48 hpi, y la replicación del genoma viral se evaluó en un ensayo de qPCR con los cebadores para el HSV-1 del genoma. PrIMers contra GAPDH se utiliza como referencia. n = 3. Las barras de error indican ± SEM. (E) Mock tratados con córneas se flash congelado a 48 hpi, se seccionaron, y se analizaron por inmunofluorescencia indirecta para la presencia de una proteína viral temprana (ICP8) dentro del epitelio infectado. Los núcleos se tiñen con Höchst 33258. (F) Proteína lisados se recogieron a las 48 hpi, y la expresión de una proteína viral (ICP0) se evaluó mediante Western blot. BCA ensayo se utilizó para garantizar la igualdad de carga de muestras. hpi = horas después de la infección.
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Discussion
En este artículo de vídeo se describe un método para el estudio agudo corneal epitelial infección HSV-1 en un modelo ex vivo. Este modelo es un escalón útil entre la in vitro y la modelos in vivo, ya que permite la validación fisiológicamente precisa de los resultados de cultivo de células y, por lo tanto, limita la cantidad de experimentación animal que debe ser realizada. Además, el modelo ex vivo ofrece una oportunidad única y valiosa para estudiar la infección por herpes epitelial intacta en córneas humanas. A continuación se describen algunas consideraciones que deben tenerse en cuenta cuando se utiliza este modelo:
- Es importante enfatizar que el enfoque descrito en este artículo de vídeo no está destinado a ser un modelo de queratitis herpética, pero es más bien un modelo de aguda corneal epitelial infección HSV-1. Queratitis por herpes es el resultado de varios procesos de confusión, como la infección, la inflamación y la im anfitriónMUNE respuesta al virus. Específica de antígeno CD4 + y CD8 + respuestas de células T son un componente importante de la patogénesis de la queratitis por herpes, que no pueden ser reproducidas en este modelo, porque córneas explantados no están sujetos a la infiltración por células del sistema inmune. Por esta razón, no se desarrollan las úlceras dendríticas típicas epiteliales y carecen de la participación del estroma clásica observada en la queratitis herpética estromal 3. Por lo tanto, la puntuación de la gravedad de la enfermedad y de imagen de fluoresceína de úlceras de la córnea no es posible en el modelo ex vivo. Además, la mayoría de los casos de queratitis por herpes son causadas por la reactivación de la latencia viral. Dado que nuestro enfoque se basa en la infección directa de las córneas explantados con virus exógenos, se modela aguda HSV-1 infección de la córnea y no reactivación de la enfermedad. Por estas razones, el modelo presentado aquí no es apropiado para la comprensión de la patología global de la enfermedad, sino más bien SHOuld ser usado para estudiar la replicación viral y la interacción virus-huésped estrictamente en el epitelio corneal.
- Los herpes ex vivo queratitis rendimientos del modelo resultados con una mayor variabilidad que los experimentos in vitro de cultivo de tejidos. Esto es probablemente debido al hecho de que cada córnea se obtiene de un conejo diferente y puede ser procesado ligeramente diferente. Córneas humanas muestran una variabilidad mayor de resultados que las córneas de conejo, ya que proceden de donantes de la variable edad, raza y estado de salud, y se conservan para diferentes cantidades de tiempo después de la muerte. Sin embargo, con el uso de por lo menos cinco córneas por tratamiento experimental, hemos sido capaces de generar datos estadísticamente fiables.
- El método tradicional para el cultivo de explantado córneas 4-5 sugiere el uso de medio de cultivo sólo lo suficiente para cubrir el limbo de la córnea. Se encontró que el aumento de la cantidad de medio para cubrir completamente el epitelio produce resultados más consistentes,probablemente debido a la minimización de las diferencias entre acceso córneas individuales a los fármacos medio y experimental contenidas en el mismo.
- Cuando se utiliza córneas de conejo para cualquier aplicación que utiliza anticuerpos, es importante tener en cuenta que los anticuerpos con especificidades tradicionales a ser humano, ratón, rata, etc es probable que no reaccionan de forma cruzada contra antígenos de conejo. Además, secundario anti-conejo anticuerpos, por supuesto, no se pueden utilizar en estas aplicaciones. Por estas razones, se utiliza córneas humanas en experimentos con tinción de anticuerpos de los objetivos celulares.
- Cuando la recolección de células epiteliales para el análisis de citometría de flujo, el experimentador debe ser cauteloso sobre los efectos de la tripsina en proteínas asociadas a la membrana. Por lo tanto, para la detección de proteínas de superficie, puede ser beneficioso utilizar otros medios de desalojar las células, tales como colagenasas o proteasas no tripsina.
- Los modelos animales de la queratitis herpética dependen de escarificación corneal antes de la inoculación conel virus. Hemos sido capaces de alcanzar niveles constantes de infección sin sacrificar las córneas explantados. Esto es más probable debido a la ausencia de la película de lágrimas y el parpadeo que rápidamente eliminar el virus de la superficie de la córnea en un animal vivo.
Modificaciones potenciales del modelo de queratitis por herpes ex vivo no explorado en este artículo de vídeo:
- La modificación genética de células epiteliales corneales antes de la infección HSV-1 mediante el uso de métodos de ADN de entrega utilizados en el cultivo celular y en investigación en terapia génica, tales como transfección, entrega viral, y disparando gen 6.
- El uso de GFP-expresión de HSV-1 7-8 o FITC-conjugado con anticuerpos anti-HSV 9-10 para evaluar visualmente la extensión de la infección.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
El apoyo del Banco Leonístico de Delaware Valley fue muy valiosa para este trabajo. Anticuerpo monoclonal de ratón contra ICP8 primaria fue una especie de regalo del doctor David Knipe (Harvard Medical School). También agradecemos al Dr. Stephen Jennings (Drexel University College of Medicine) y el Dr. Peter Laibson (Wills Eye Institute) útil para los debates y la experiencia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Mediatech, Inc. | 10-010-CV | |
| Non-Essential Amino Acids (100x solution) | Mediatech, Inc. | 25-025-CI | |
| L-Glutamine | Mediatech, Inc. | 25-005-CI | |
| Penicillin G Sodium Salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Streptomycin Sulfate Salt | Sigma-Aldrich | S9137 | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Prepared in Lab | N/A | |
| Trypsin EDTA (1x) | Mediatech, Inc. | 25-053-CI | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Laemmli Buffer | Prepared in Lab | N/A | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Whole Rabbit Eyes (Young) | Pel-Freez Biologicals | 41211-2 | |
| Human Corneas and Whole Eyes | Local Supplier | N/A | |
| 12 Well Porcelain Spot Plate | Avogadro’s Lab Supply | 1877 | |
| 35 mm Tissue Culture Dish | Falcon BD | 353001 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Cryomold Intermediate | Tissue-Tek | 4566 |
References
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- Holmberg, B. J.
- Remeijer, L., Osterhaus, A., Verjans, G. Human herpes simplex virus keratitis: the pathogenesis revisited. Ocul. Immunol. Inflamm. 12, 255-285 (2004).
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- Xu, K. P., Li, X. F., Yu, F. S. Corneal organ culture model for assessing epithelial responses to surfactants. Toxicol. Sci. 58, 306-314 (2000).
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