A identificação de células de tumor cerebral de iniciação (BTICs), as células raras dentro de uma heterogeneidade de tumores que possuem propriedades de células-tronco, fornece novas pistas sobre patogénese humana de tumor cerebral. Temos refinado condições específicas de cultura para enriquecer para BTICs, e usam rotineiramente citometria de fluxo para enriquecer ainda mais essas populações. A auto-renovação e ensaios de análise por transcrição única célula de RT-PCR pode ser realizada posteriormente nestas células isoladas.
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Artigo de método
Processamento de tecido primário do tumor cerebral para Ensaios de Células Tronco e Fluxo de Classificando
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os tumores cerebrais são tipicamente constituídos por células morfologicamente diferentes que expressam uma variedade de marcadores de linhagem neural. Apenas uma fracção relativamente pequena de células no tumor com propriedades de células estaminais, células cerebrais chamados de tumores de iniciação (BTICs), possuir uma capacidade de se diferenciar ao longo de várias linhagens, de auto-renovação e iniciar tumores in vivo. Aplicou-se as condições de cultura normais, inicialmente utilizadas para as células estaminais neurais (NSC) para uma variedade de tumores cerebrais humanos e verificou que este método de cultura, especificamente selecciona para a haste-como populações. Meio isento de soro (NSC) permite a manutenção de um estado indiferenciado de células estaminais, e a adição de bFGF e EGF permite a proliferação de multi-potentes, de auto-renovação e tumorspheres expansíveis.
Para caracterizar adicionalmente população BTIC cada tumor, avaliamos marcadores de superfície celular por citometria de fluxo. Podemos também classificar as populações de interesse para characteriz mais específicosção. A auto-renovação ensaios são realizados em BTICs individuais ordenadas em placas de 96 poços, a formação de tumorspheres após a incubação a 37 ° C, indica a presença de uma haste ou de células progenitoras. O número de células múltiplas de uma dada população podem ser classificados em diferentes poços para análise de diluição limitante, para analisar a capacidade de auto-renovação. Podemos também estudar a expressão diferencial de genes dentro de uma determinada população celular, utilizando células único de RT-PCR.
Os protocolos que se seguem descrevem os processos para a dissociação e cultura de amostras humanas primárias para enriquecer as populações BTIC, bem como a dissociao de tumorspheres. Também incluídos estão os protocolos para coloração por análise de citometria de fluxo ou triagem, a auto-renovação ensaios e única célula de RT-PCR.
Introdução
Os tumores cerebrais estão entre os cânceres mais agressivos e heterogênea conhecidos em humanos. Embora a sua detecção precoce e diagnóstico ter sido facilitada pela tecnologia neuro-imagem moderna, ainda não temos terapias curativas para muitos tumores cerebrais, particularmente para difusas, as invasoras ou os localizados no fundo do cérebro.
Os tumores cerebrais representam a principal causa de mortalidade por câncer em crianças devido à sua natureza altamente agressiva e muitas vezes incurável. Glioblastoma (GBM), o tumor cerebral primário mais comum em adultos, é um dos cancros mais agressivos humanos, temidos por seu prognóstico un....
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Protocolo
1. Cultura de tecido de tumor cerebral
- Adicionar 200 ul de Liberase descongelado (Roche Applied Science) para 15 ml de CSF artificial (aCSF-ver Tabela 1) e colocar em banho de água a 37 ° C. Liberase TM é uma mistura de enzimas proteolíticos utilizadas para dissociar amostras de tecidos primários, assim como tumorspheres cultivadas. Ao contrário de tripsina-EDTA, o método de Liberase preserva o antigénio de superfície da CD133. Para obter uma amostra de tecido de cerca de 0,5 cm 3, usamos 200 ul de Liberase. Se o tecido for menor, usamos 100 ul.
- Traga solução cloreto de amónio (tecnologias de células-tronco) à temperat....
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Discussão
O cancro da hipótese de células estaminais 10, com base no trabalho em leucemia 21, cancro da mama e cancro do cérebro 11 4,5, sugere que apenas uma fracção relativamente pequena de células do tumor, as células estaminais chamadas cancerosas, possuem a capacidade de proliferar e de auto extensivamente -renovar. A maioria das células tumorais perdem a capacidade de proliferar e de se auto-renovar como se diferenciam em células que se tornam a assinatura fenotípica do tumor. Localizando as.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo Instituto de Pesquisa do Câncer de Ontário (OICR), a Terry Fox Foundation e da American Association of Neurological Surgeons.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | |
| 01:01 DMEM: F12 | Invitrogen | 11320-082 | |
| Suplemento N2 | Invitrogen | 17502-048 | |
| HEPES 1M | Wisent | 330-050 EL- | |
| Glicose | Invitrogen | 15023-021 | |
| N-acetilcisteína | Sigma Aldrich | A9165-25g | |
| Neural sobrevivência fator -1 (NSF-1) | Lonza Clonetics | CC-4323 | |
| Fator de crescimento epidérmico (EGF) | Sigma Aldrich | E9644 | |
| Factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) | Invitrogen | PHG0261 | |
| Factor inibidor de leucemia (LIF) | Millipore | LIF1010 | |
| Antibiótico / micótico | Wisent | 450-115 EL- | |
| Liberase TM | Roche | 05 401 119 001 | |
| Solução de cloreto de amónio | Stem Cell Technologies | 07850 |
Referências
- Ohgaki, H., Kleihues, P. Epidemiology and etiology of gliomas. Acta Neuropathol. 109, 93(2005).
- Huse, J. T., Holland, E. C. Targeting brain cancer: advances in the molecular pathology of malignant glioma. 10, 319(2010).
- Wechsler-Reya, R., Scott, M. P.
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Reimpressões e permissões
