Artigo de método

Injeção de sub-retiniana de Vetores da terapia genética e células-tronco no olho do rato

DOI:

10.3791/4286

⸱

25 de novembro de 2012

 ,  ,  ,  , 
1Bernard and Shirlee Brown Glaucoma Laboratory, Department of Ophthalmology, Columbia University , 2Institute of Human Nutrition, College of Physicians & Surgeons, Columbia University , 3Omics Laboratory, University of Iowa , 4Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Iowa

Neste artigo

Resumo

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Esta técnica cirúrgica ilustra a injecção de vectores de terapia genética e de células estaminais para o espaço sub-retiniano do olho do rato.

Resumo

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A perda de visão afeta cerca de 3,4 milhões de pessoas nos Estados Unidos e deverá aumentar nos próximos anos. 1 Recentemente, a terapia genética e os transplantes de células-tronco tornaram-se importantes ferramentas terapêuticas para o tratamento da cegueira resultante de doenças degenerativas da retina. Várias formas de transplante autólogo de idade degeneração macular relacionada à (AMD), como a íris transplante de células epiteliais pigmentares, têm gerado resultados animadores, e testes clínicos em humanos começaram a outras formas de terapias com células-tronco e genética. 2 Estes incluem a substituição RPE65 gene A terapia em pacientes com amaurose congénita de Leber e um transplante de células RPE humanas utilizando estaminais embrionárias (ES) células na doença de Stargardt. 3-4 Agora que existem vectores de terapia genética e de células estaminais disponíveis para o tratamento de pacientes com doenças da retina, é importante verificar estas terapias potenciais em modelos animais antes de aplicarção deles em estudos humanos. O ratinho tornou-se um modelo importante científica para testar a eficácia terapêutica de vectores de terapia génica e transplante de células estaminais no olho. 5-8 Neste artigo de vídeo, é apresentada uma técnica de injectar vectores de terapia génica ou de células estaminais para o espaço sub-retiniano do o olho do rato, minimizando os danos para o tecido circundante.

Protocolo

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1. Montar dispositivos para a injeção sub-retiniana

  1. Comprar ou fazer uma agulha 100 um de diâmetro a partir de um tubo de vidro capilar. Isto pode ser feito manualmente utilizando um extractor Sutter P-97 da pipeta ou outro equipamento semelhante. A extremidade do tubo capilar irá ser aquecido e puxado até atingir o diâmetro desejado (100 mm). Uma agulha de menor diâmetro podem ser utilizados para vectores de terapia génica, no entanto, isto é o diâmetro recomendado para a injecção das células, sem danificar as células ou o olho. Em comparação com as agulhas de aço, a agulha capilar de vidro tem uma ponta muito fina, mas sem corte, para permitir a visualização do fluido de injecção e de acesso ao espaço sub-retiniano, sem causar a ruptura da retina. Limpe estas agulhas puxado, se necessário usando etanol 70%, e guarde em um recipiente estéril. Uma placa de cultura de 15 centímetros estéril tecido com fita adesiva para segurar as agulhas no lugar é uma forma em que para manter as agulhas de injecção e coberto em um ambiente estéril. Neste ponto, complete o set-up dentro da sala cirúrgica onde o procedimento será realizado. É mais fácil manter todos os equipamentos na sala cirúrgica em todos os momentos para que ele permaneça estéril, especialmente se este procedimento é feito dentro de uma instalação de barreira.
  2. Aspirar silicone para dentro da agulha de injecção e ejetar o silicone para deixar um revestimento ao longo das paredes internas da agulha. O revestimento de silicone maximiza a passagem de células e vírus através do furo da agulha, que, de outro modo aderir às paredes interiores de vidro capilar.
  3. Obter um comprimento de aproximadamente 8 cm de tubagem de plástico estéril, cortando uma colheita de sangue 25 ¾ calibre definido com luer-lock no ponto imediatamente após a agulha (remover a agulha do tubo).
  4. Encher um 1 ml Sub-Q 26 5/8-gauge seringa de ponta de deslizamento com uma solução salina estéril e retire a agulha da seringa.
  5. Fixar a agulha de injecção para a extremidade cortada do tubo de plástico e encaixe a seringa para o luer-lock na outrafim.
  6. Aspirar solução salina estéril para preencher o espaço morto na agulha e tubo capilar, uma solução salina de ejecção através da agulha para assegurar que ele está correctamente ligado sem qualquer fuga. Em seguida, aspirar uma pequena quantidade de cerca de 1 ul de ar, para dentro da ponta da agulha de injecção. Isto vai separar o soro fisiológico do fluido de injecção e proporcionar uma indicação visual que indica o fim do fluido de injecção, durante o procedimento cirúrgico. O aparelho de injeção deve ser mantido em uma superfície limpa limpo com etanol 70% durante o procedimento cirúrgico. Além disso, todo o equipamento utilizado durante o procedimento cirúrgico deve ser limpo, tanto antes como depois com etanol a 70%, com excepção de que as agulhas de injecção deve ser mantido já esterilizado e pronto para ser utilizado. Estas agulhas devem ser eliminados após a cirurgia e não reutilizado.
  7. Finalmente, aspirar solução injectável que contém o vector de terapia desejado embalados gene viral ou células estaminais. Isto pode ser feito pelatendo-se a solução de injecção uma ponta de pipeta estéril, em seguida pipetando a solução sobre a superfície de um prato de cultura de células estéril. A solução pode agora ser facilmente aspirada para dentro da agulha de injecção com a seringa. A quantidade necessária irá variar, dependendo da idade do rato. Para os nossos propósitos, usamos pós-natais dia 5 ratos, que podem ser injectados com 0,5-0,8 uL de fluido de injecção. Quantidades menores, 0,5 ul ou menos, podem ser utilizadas para os ratos mais jovens e maiores quantidades, tais como 1 uL, pode ser utilizado para ratinhos adultos. O título virai ou o número de células tem de ser determinado com base nos vírus / células serem injectados e seus tecidos-alvo desejado, como muitas partículas virais ou células num pequeno volume pode levar à toxicidade para as células da retina. No vídeo, para efeitos de visualização, utilizou 1,5 ul, uma maior quantidade de corante que é necessário para injectar no olho.

2. Acessando o espaço sub-retiniana

  1. Dentro do ambiente estéril cirúrgico,estabilizar ou anestesiar o rato de acordo com o protocolo aprovado localmente manuseamento dos animais, a qual irá variar de acordo com a idade do rato. Anestesia comum para ratinhos adultos inclui o uso de gás isoflurano ou de uma injecção intra-peritoneal de 0,1 mL/10 g de peso corporal de cetamina (100 mg / ml) e xilazina (20 mg / ml) em solução salina estéril. Para ratinhos perinatais, as técnicas de anestesia comuns incluem o uso de gás ou isoflurano Crioanestesia (hipotermia). Todas as técnicas de anestesia deve ser aprovado pelo seu comitê local IACUC antes do uso. Normalmente usamos dia pós-natal (P) 5 murganhos, embora as técnicas similares podem ser aplicadas a ratinhos jovens como P0 ou camundongos adultos. O procedimento cirúrgico não pode começar até que o mouse deixou mover os membros e não responde mais aos pés pitadas. Para ratos perinatais, eles vão tornar-se visivelmente mais leve na cor já que o fluxo de sangue irá desacelerar, outra chave para saber que eles são totalmente sob anestesia.
  2. Em camundongos perinatais, use Vannas tesouras retas para make uma incisão milímetros aproximado 1,5 ao longo da fissura a tampa fechada. Tenha o cuidado de cortar no recuo, onde o olho vai abrir naturalmente no futuro. Isso garante que as tampas se curar e abrir adequadamente durante o desenvolvimento do ratinho. A lâmina cirúrgica pode ser utilizada para esta finalidade, apesar de preferirmos Vannas tesoura, uma vez que reduzem o risco de perfurar o olho durante este procedimento. No vídeo, a tesoura foram usados ​​diretamente punção e corte ao longo da margem palpebral. Quando esta técnica de aprendizagem, uma pinça deve ser usada para levantar a pálpebra antes do corte, e reduzir o risco de danificar o olho.
  3. Separar as pálpebras com uma pinça de vestir curvas para proptose do olho e beliscar as pálpebras ligeiramente debaixo do olho para mantê-lo proptose injectável. Se a incisão tampa feita em duas etapas é muito grande, o olho irá deslizar para trás sob as pálpebras e evitar a exposição adequada durante o processo de injecção. Para camundongos adultos, aplicando uma leve pressão ao redor dos olhos com o Dr.essing fórceps pode manter o olho proptose injectável.
  4. Fazer uma pequena incisão escleral no ou posterior ao equador do globo arranhando a superfície com uma lâmina de microcirurgia de 15 graus. Esta incisão deve ser apenas suficientemente grande para passar a ponta da agulha de injecção, mas não maior do que isso. Se preferido, uma agulha de pequeno e afiado tal como uma agulha de acupuntura pode ser usada para fazer essa incisão para o espaço sub-retiniano, em vez da lâmina de microcirurgia. Em animais pigmentadas, um tecido de cor castanha-escura pigmentada (a coróide-retinal do epitélio pigmentar) irá tornar-se visível no ponto de incisão. Em mais leves ratos pigmentados ou albinos, uma caneta de marcação cirúrgica pode ser aplicada à ponta da lâmina da microcirurgia para deixar uma mancha de tinta que indica o local da incisão. Se claros refluxos (vítreo) de fluido a partir do local da incisão, a lâmina foi colocada demasiado profunda e entrou na cavidade vítrea e o vírus terapêutico ou células podem entrar no espaço durante a injecção intravítrea. Para visualizatiem fins, fizemos a incisão para este ponto do vídeo. É ainda possível realizar uma injecção sub-retiniana, neste caso, no entanto, o descolamento da retina causada pela presença do líquido de injecção não pode curar completamente neste rato. Por conseguinte, deve ser tomado cuidado para cortar apenas a superfície exterior do olho, e não através da retina, antes da injecção.
  5. Cuidadosamente insira a agulha de injecção no local da incisão e fazê-la avançar paralelamente à parede exterior do olho para entrar no espaço sub-retiniano. Avançando muito perto da parede exterior ou demasiado profunda no interior do olho vai dirigir a injecção no local errado. O melhor método para compreender se a agulha está no local correto é praticar a técnica. Praticar em ratos levemente pigmentadas ou albino pode ajudar a fazer injeções precisos e exatos para o espaço sub-retiniano. Isto é porque o fluido de injecção da agulha e é visível dentro destes olhos.
  6. Aplicar uma leve pressão sobre o êmbolo da seringa e havergin injecção do fluido desejado. Se a agulha é colocada corretamente dentro do espaço sub-retiniana, contrapressão moderada será sentida. Se a agulha se encontra dentro do corpo vítreo, haverá contrapressão significativamente menor e, potencialmente, um pouco de fluido de refluxo durante a injecção. Se houver contrapressão significativa, segure a agulha no lugar para, pelo menos, um período adicional de 15 segundos antes de remover a agulha lentamente. Isto irá permitir que a pressão intra-ocular elevada para igualar a refluxo em vez de vírus ou as células injectadas para trás para fora do local da incisão. Parte do ar e solução salina pode ser injectada no espaço sub-retiniano devido ao aumento da pressão necessária durante o processo de injecção. Cuidados devem ser tomados para não sobre-injetar ar ou salina, uma vez que pode expulsar o vírus injetado ou células do olho. É também possível provocar o descolamento da retina permanente da presença de muito líquido injectado no espaço sub-retiniano. Para efeitos de visualização, o excesso de corante e ar foi injectado into o espaço sub-retiniano do vídeo. Pode ser claramente visto como parte do corante será liberado de volta para fora do espaço sub-retiniano se muito é injectado, mas também como a bolha de ar permanece no interior do espaço sub-retinal e não desaparece para dentro do vítreo. Este foi usado para enfatizar que estas injecções estavam todos dentro do local correto do olho, para que se possa visualizar como a agulha deve entrar no local da incisão. Todas as injecções no espaço sub-retiniano provocar um descolamento da retina temporária devido à presença do fluido de injecção. Se o procedimento de injecção está terminada correctamente, este descolamento da retina temporária curará dentro de 24 horas e ratos podem ser utilizados para todas as experiências adicionais. O olho pode permanecer macio durante aproximadamente uma semana em função do procedimento cirúrgico, para uma segunda injecção deve ser evitado durante este período de tempo.
  7. Para ratos neonatos, use a pinça de vestir curvas para empurrar cuidadosamente o olho para trás das pálpebras e na órbita. Pode ser útilde esperar por um minuto, a fim de permitir que o vírus se estabelecer no interior do espaço sub-retinal e não fazer com que seja empurrado para fora do local da incisão quando suavemente empurrando o olho de volta para a sua órbita. Após a cirurgia, uma gota de 0,5% de bupivacaína (marcaína) diluída a 0,25% em solução salina estéril a partir de uma agulha de calibre 25 pode ser colocado no local da injecção. Ratos não mostram sinais evidentes de desconforto após a cirurgia sub-retiniana e do uso de bupivacaína como um analgésico de longa ação tópica tem sido suficiente para os três anos anteriores. Ratos deve ser sempre monitorado após o procedimento cirúrgico para procurar por sinais de angústia, como infecção, inchaço, ou uma diminuição nas atividades habituais diárias do mouse. Se isso ocorrer, o veterinário deve ser notificado e medicamentos para a dor mais como a buprenorfina (0,05 mg / kg) pode ser administrado como uma injecção intraperitoneal.
  8. Acordar o mouse da anestesia acordo com o protocolo aprovado localmente animais manuseio. O rato deve ser mantido em um p aquecimentoad para manter a temperatura corporal normal, uma vez que acorda da anestesia. O procedimento cirúrgico deve levar menos de cinco minutos para completar, não contando o tempo para o mouse se submeter a anestesia. Assim, uma almofada de aquecimento não é necessário durante o procedimento real, mas podem ser necessários quando se está a aprender a técnica como o processo pode demorar um longo período de tempo. O mouse não deve ser colocado de volta em uma gaiola limpa, até que começou a se mover por conta própria. Para recém-nascidos, pitadas toe suaves vai ajudar para que eles se recuperar totalmente da anestesia, e eles devem recuperar a sua cor-de-rosa e movimento antes de serem colocados de volta com a mãe. Ratos deve ser monitorado ao longo do tempo por quaisquer sinais de angústia como listado anteriormente.

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Resultados

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Um desenho do olho do rato é mostrado com grandes estruturas marcadas para referência, com setas que indicam os locais para os procedimentos de injeção intravítrea e sub-retiniana, tanto cirúrgicos (pontas de seta, Figura 1). Vectores de terapia génica, tais como a lentiviral vector lacZ (Figura 2), pode ser injectada usando estes locais. Além disso, as células estaminais, como células estaminais embrionárias de rato (Figura 3), podem também ser transplantadas ...

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Discussão

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Esta técnica de vídeo fornece instruções sobre a conclusão do procedimento de injecção sub-retiniana cirúrgica com sucesso, e de assegurar que o vector de terapia de gene ou células estaminais são colocados no local necessário para tratar eficientemente a doença oftálmica. Esta técnica permite o direccionamento de células da retina, tais como o RPE ou fotorreceptores, uma vez que coloca os vectores de terapia genética e de células-tronco derivadas de tecidos na vizinhança destas células. Métodos anteriores envolvido inj...

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Divulgações

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Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

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Pesquisar para prevenir a cegueira, assistência Experimental de Takayuki Nagasaki; Esta pesquisa está em conformidade com a Declaração de ARVO para o Uso de Animais em Oftalmologia e Pesquisa Visual. KJW é suportado pelo NIH e 5T32EY013933 5T32DK007647-20. VBM é suportado pelo NIH concessão K08EY020530.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Nome Companhia Catálogo Comentários
0,8-1,10 x 100 mm Tubo Capilar (de vidro) Kimble Glass, Inc. 34502 99
Flaming / Brown Micropipeta Puller Instrumento Sutter P-97 Narishige microforge podem ser usados ​​em seu lugar. Catalog # MF-900
Sigmacote Sigma Aldrich SL2-25ML Silicone
Fosfato de Dubecco salina tamponada com cloreto de cálcio e cloreto de magnésio Gibco-Invitrogen 14040-133
Safety-Lok 25 3/4G x 12 "; Conjunto de coleta de sangue BD Vacutainer 367298
1 ml Sub-Q 26Seringa deslizamento Tip-5/8G Becton-Dickinson 309597
0,5-10 ul Finnpipette II pipeta ajustável-Volume Fisherbrand 21-377-815
1-200 uL Naturais Dicas chanfradas EUA Scientific, Inc. 1111-1700
Discovery.V8 microscópio estéreo Zeiss MC1500
60 mm x 15 mm Estilo Tratada poliestireno placa de cultura celular Corning Incorporated 430166
Tesoura Vannas retas Storz Ophthalmics E3383 S
Fórceps curvas de vestir com serrilhas delicadas Storz Ophthalmics E1408
15 Faca Microcirurgia Grau Wilsem Oftalmologia Corp 091204
Cetamina Ketaset III NADA # 45-290
Xilazina Lloyd Laboratories NADA # 139-236
Bupivacaína (Marcaine) AstraZeneca N / A
Buprenorfina Sigma Aldrich B9275

Referências

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