Esta técnica cirúrgica ilustra a injecção de vectores de terapia genética e de células estaminais para o espaço sub-retiniano do olho do rato.
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Artigo de método
Injeção de sub-retiniana de Vetores da terapia genética e células-tronco no olho do rato
Neste artigo
Resumo
Resumo
A perda de visão afeta cerca de 3,4 milhões de pessoas nos Estados Unidos e deverá aumentar nos próximos anos. 1 Recentemente, a terapia genética e os transplantes de células-tronco tornaram-se importantes ferramentas terapêuticas para o tratamento da cegueira resultante de doenças degenerativas da retina. Várias formas de transplante autólogo de idade degeneração macular relacionada à (AMD), como a íris transplante de células epiteliais pigmentares, têm gerado resultados animadores, e testes clínicos em humanos começaram a outras formas de terapias com células-tronco e genética. 2 Estes incluem a substituição RPE65 gene A terapia em pacientes com amaurose congénita de Leber e um transplante de células RPE humanas utilizando estaminais embrionárias (ES) células na doença de Stargardt. 3-4 Agora que existem vectores de terapia genética e de células estaminais disponíveis para o tratamento de pacientes com doenças da retina, é importante verificar estas terapias potenciais em modelos animais antes de aplicarção deles em estudos humanos. O ratinho tornou-se um modelo importante científica para testar a eficácia terapêutica de vectores de terapia génica e transplante de células estaminais no olho. 5-8 Neste artigo de vídeo, é apresentada uma técnica de injectar vectores de terapia génica ou de células estaminais para o espaço sub-retiniano do o olho do rato, minimizando os danos para o tecido circundante.
Protocolo
1. Montar dispositivos para a injeção sub-retiniana
- Comprar ou fazer uma agulha 100 um de diâmetro a partir de um tubo de vidro capilar. Isto pode ser feito manualmente utilizando um extractor Sutter P-97 da pipeta ou outro equipamento semelhante. A extremidade do tubo capilar irá ser aquecido e puxado até atingir o diâmetro desejado (100 mm). Uma agulha de menor diâmetro podem ser utilizados para vectores de terapia génica, no entanto, isto é o diâmetro recomendado para a injecção das células, sem danificar as células ou o olho. Em comparação com as agulhas de aço, a agulha capilar de vidro tem uma ponta muito fina, mas sem corte, para permitir a visualiz....
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Resultados
Um desenho do olho do rato é mostrado com grandes estruturas marcadas para referência, com setas que indicam os locais para os procedimentos de injeção intravítrea e sub-retiniana, tanto cirúrgicos (pontas de seta, Figura 1). Vectores de terapia génica, tais como a lentiviral vector lacZ (Figura 2), pode ser injectada usando estes locais. Além disso, as células estaminais, como células estaminais embrionárias de rato (Figura 3), podem também ser transplantadas .......
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Discussão
Esta técnica de vídeo fornece instruções sobre a conclusão do procedimento de injecção sub-retiniana cirúrgica com sucesso, e de assegurar que o vector de terapia de gene ou células estaminais são colocados no local necessário para tratar eficientemente a doença oftálmica. Esta técnica permite o direccionamento de células da retina, tais como o RPE ou fotorreceptores, uma vez que coloca os vectores de terapia genética e de células-tronco derivadas de tecidos na vizinhança destas células. Métodos anteriores envolvido inj.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Pesquisar para prevenir a cegueira, assistência Experimental de Takayuki Nagasaki; Esta pesquisa está em conformidade com a Declaração de ARVO para o Uso de Animais em Oftalmologia e Pesquisa Visual. KJW é suportado pelo NIH e 5T32EY013933 5T32DK007647-20. VBM é suportado pelo NIH concessão K08EY020530.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome | Companhia | Catálogo | Comentários |
| 0,8-1,10 x 100 mm Tubo Capilar (de vidro) | Kimble Glass, Inc. | 34502 99 | |
| Flaming / Brown Micropipeta Puller | Instrumento Sutter | P-97 | Narishige microforge podem ser usados em seu lugar. Catalog # MF-900 |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2-25ML | Silicone |
| Fosfato de Dubecco salina tamponada com cloreto de cálcio e cloreto de magnésio | Gibco-Invitrogen | 14040-133 | |
| Safety-Lok 25 3/4G x 12 "; Conjunto de coleta de sangue | BD Vacutainer | 367298 | |
| 1 ml Sub-Q 26Seringa deslizamento Tip-5/8G | Becton-Dickinson | 309597 | |
| 0,5-10 ul Finnpipette II pipeta ajustável-Volume | Fisherbrand | 21-377-815 | |
| 1-200 uL Naturais Dicas chanfradas | EUA Scientific, Inc. | 1111-1700 | |
| Discovery.V8 microscópio estéreo | Zeiss | MC1500 | |
| 60 mm x 15 mm Estilo Tratada poliestireno placa de cultura celular | Corning Incorporated | 430166 | |
| Tesoura Vannas retas | Storz Ophthalmics | E3383 S | |
| Fórceps curvas de vestir com serrilhas delicadas | Storz Ophthalmics | E1408 | |
| 15 Faca Microcirurgia Grau | Wilsem Oftalmologia Corp | 091204 | |
| Cetamina | Ketaset III | NADA # 45-290 | |
| Xilazina | Lloyd Laboratories | NADA # 139-236 | |
| Bupivacaína (Marcaine) | AstraZeneca | N / A | |
| Buprenorfina | Sigma Aldrich | B9275 |
Referências
- Prevalence of Blindness Data Tables [NEI Statistics and Data]. , National Eye Insitute. Available from: http://www.nei.nih.gov/eyedata/pbd_tables.asp (2011).
- Abe, T. Regeneration of the retina using pigment epithelial cell transplantation. Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 106, 778-803 (2002).
- Jacobson, S. G., Cideciyan, A. V., Ratnakaram, R., Heon, E.....
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Reimpressões e permissões
