O uso de matrizes de fase reversa Proteínas (RPPA) para explorar variação Protein Expression individuais dentro de câncer de células renais

Resumo

RPPA permite a expressão da proteína de centenas de amostras, impressos em lâminas de nitrocelulose para serem interrogados ao mesmo tempo, utilizando anticorpos marcados com fluorescência. Esta técnica tem sido utilizada para estudar o efeito do tratamento com medicamentos na heterogeneidade claro carcinoma de células renais.

Resumo

Actualmente não existe tratamento curativo para cancro metastático da célula clara de células renais, o mais comum dos variante da doença. Um factor chave neste resistência ao tratamento é considerado a complexidade molecular da doença ^1. Terapia-alvo, tais como o inibidor da tirosina cinase (TKI)-sunitinib têm sido utilizados, mas apenas 40% dos pacientes respondem, com a grande maioria destes pacientes recidivantes dentro de 1 ano ^2. Como tal a questão da resistência intrínseca e adquirida em pacientes com câncer de células renais é altamente relevante ^3.

Para estudar a resistência a inibidores da tirosina quinase, com o objetivo final de desenvolver tratamentos eficazes e personalizados, tecido seqüencial após um período específico de terapia-alvo é necessária, uma abordagem que tinha sido bem sucedida em mielóide crônica ⁴ leucemia. No entanto, a aplicação de uma tal estratégia em carcinoma de células renais é complicada pelo elevado nível de both heterogeneidade inter-e intra-tumoral, o que é uma característica do carcinoma de células renais, ^5,6, assim como outros tumores sólidos ^7. Heterogeneidade Intertumoral devido a diferenças transcriptomic e genética está bem estabelecido, mesmo em pacientes com apresentação semelhante, estágio e grau do tumor. Além disso, é evidente que existe uma grande heterogeneidade (intratumoral) morfológica no RCC, a qual é susceptível de representar ainda maior heterogeneidade molecular. Mapeamento detalhado e classificação de tumores CCR por análise morfológica e classificação combinada Fuhrman permite a seleção de áreas representativas para análise proteômica.

Análise de proteínas baseada em ⁸ RCC é atraente devido a sua ampla disponibilidade em laboratórios de patologia, no entanto, a sua aplicação pode ser problemática devido à disponibilidade limitada de anticorpos específicos ^9. Devido à natureza dot blot dos arrays de proteínas, em fase reversa (RPPA), a especificidade do anticorpo deve be pré-validado, como o controlo de qualidade rigoroso de tais anticorpos utilizados é de importância primordial. Apesar desta limitação, o formato dot blot não permite a miniaturização do ensaio, permitindo a impressão de centenas de amostras para uma lâmina de nitrocelulose único. Slides impressos podem então ser analisadas de uma forma semelhante à análise de Western com o uso de alvos específicos anticorpos primários e anticorpos secundários marcados com fluorescência, permitindo a multiplexagem. A expressão diferencial de proteínas em todas as amostras numa lâmina pode então ser analisados ​​simultaneamente através da comparação do nível relativo de fluorescência de uma forma mais rentável e de alto rendimento.

Protocolo

1. Identificação de morfológica e molecular Heterogeneidade Tumor

1. Os tumores removidos do congelador a -80 ° C e mantido em gelo seco.
2. Dividir os tumores em secções de cerca de 1 cm ^3. Mapear a posição original de cada secção do tumor em relação ao outro e etiqueta com um nome único. Armazenar as amostras em criotubos individuais a -80 ° C até que esteja pronto para uso.
3. Amostras do revestimento em outubro e cortar em um criostato a -22 ° C.
4. Amostras corados com Hematoxilina e Eosina método contracoloração.
5. Análise de microscopia de cortes congelados para garantir que eles são de natureza ccRCC, tumor viáv....

Resultados

Um exemplo de uma lâmina de RPPA digitalizada pode ser visto na Figura 4 (i), com ambos os canais 680 e 800 nm indicadas. Separando as imagens por comprimento de onda, a Figura 4 (ii) permite que cada bloco na corrediça RPPA a ser analisado e a expressão da proteína individual determinada Figura 4 (iii). Como pode ser visto na Figura 4 (iii) a expressão de proteínas individuais através das amostras é o único com gelsolina tendo um elevado nível de expre.......

Discussão

O método aqui apresentado RPPA representa uma alternativa para a produção elevada amplamente utilizada mas comparativamente baixa taxa de transferência western blot técnica de análise de proteínas. O método permite que centenas de amostras para ser semi-quantitativamente analisadas e comparadas simultaneamente permitindo a comparação directa de proteínas-chave através de uma grande variedade de linhas celulares e amostras de tecido. Multiplexagem com espécies diferentes de anticorpos aumenta ainda mais o poder da técnic.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo
aprotinina	Sigma	A6279
cocktail inibidor de fosfatase duas	Sigma	P5726
cocktail de inibidores de fosfatase 3	Sigma	P0044
cocktail inibidor de protease	Roche	11836153001
Triton X-100	Triton-X	T8787
Li-Cor Odyssey tampão de bloqueio	Li-Cor	927-40000
TissueLyser	Qiagen	85600
MicroGrid II robótica spotter	Biorobotics
Quatro FastFrame 'suporte de slides baía	Whatman	10486001
Deslize FAST - 2-Pad	Whatman	10485317
IRDye Cabra 680LT anti-IgG	Licor	926-68020
IRDye Cabra 800CW anti-IgG de coelho	Licor	926-32211