Protocolo melhorado para microdissecção a laser de ilhotas pancreáticas humanas a partir de espécimes cirúrgicos

Dorothée Sturm; Lorella Marselli; Florian Ehehalt; Daniela Richter; Marius Distler; Stephan Kersting; Robert Grützmann; Krister Bokvist; Philippe Froguel; Robin Liechti; Anne Jörns; Paolo Meda; Gustavo Bruno Baretton; Hans-Detlev Saeger; Anke M. Schulte; Piero Marchetti; Michele Solimena

doi:10.3791/50231

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Artigo de método

Protocolo melhorado para microdissecção a laser de ilhotas pancreáticas humanas a partir de espécimes cirúrgicos

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DOI:

10.3791/50231

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6 de janeiro de 2013

Dorothée Sturm¹^,² , Lorella Marselli³ , Florian Ehehalt¹^,² , Daniela Richter¹ , Marius Distler² , Stephan Kersting¹^,² , Robert Grützmann² , Krister Bokvist⁴ , Philippe Froguel⁵ , Robin Liechti⁶ , Anne Jörns⁷ , Paolo Meda⁸ , Gustavo Bruno Baretton⁹ , Hans-Detlev Saeger² , Anke M. Schulte¹⁰ , Piero Marchetti³ , Michele Solimena¹

¹Molecular Diabetology, Paul Langerhans Institute Dresden, ²Department of GI-, Thoracic- and Vascular Surgery, University Hospital Carl Gustav Carus, University of Technology Dresden, ³Department of Endocrinology and Metabolism, Metabolic Unit University of Pisa, ⁴Labs DC0522, Lilly Corporate Center, ⁵Genomics, Faculty of Medicine Imperial College London, ⁶Vital-IT, SIB Swiss Institute of Bioinformatics, ⁷Clinical Biochemistry, Hannover Medical School, ⁸Cell Physiology and Metabolism, Medical School, University of Geneva, ⁹Department of Pathology, University Hospital Carl Gustav Carus, University of Technology Dresden, ¹⁰R&D DIAB Division / Translational Medicine, Sanofi-Aventis

Neste artigo

Resumo

Microdissecção a laser é uma técnica que permite a recuperação de células selecionadas a partir de pequenas quantidades de parênquima. Aqui descrevemos um protocolo de aquisição ilhotas pancreáticas humanas a partir de espécimes cirúrgicos para serem utilizados para estudos de transcriptomic. Nosso protocolo melhora a autofluorescência intrínseca das células beta humanas, facilitando assim a sua coleção.

Resumo

Microdissecção a laser (LMD) é uma técnica que permite a recuperação de células e tecidos seleccionados a partir de quantidades diminutas de parênquima ^1,2. As células dissecadas pode ser usado para uma variedade de investigações, como estudos transcriptomic ou proteômica, avaliação ou análise de ADN cromossómico ^2,3. Uma aplicação especialmente difícil de LMD é a análise de transcriptoma, o qual, devido à instabilidade do ARN ^4, pode ser particularmente importante quando as células são dissecados a partir de tecidos que são ricos de RNases, tais como o pâncreas. Um protocolo de microdissecção que permite a identificação rápida e recolha de células-alvo é essencial nesta configuração, a fim de encurtar o tempo de tratamento do tecido e, consequentemente, para assegurar a preservação do RNA.

Aqui descrevemos um protocolo para a obtenção de células beta pancreáticas humanas a partir de espécimes cirúrgicos para serem utilizados para estudos de transcriptomic ^5. Pequenos pedaços de pâncreas de cerca de 0,5-1 cm ³ foram cortados a partir das margens saudáveis constantes de espécimes pâncreas extirpado, embebidos em composto Tissue-Tek OCT, imediatamente congelados em 2-metilbutano, refrigerada e armazenado a -80 ° C até que o corte. Quarenta secções seriadas de 10 um de espessura foram cortadas num criostato com uma configuração de -20 ° C, transferidas individualmente para lâminas de vidro, secou-se no interior do criostato durante 1-2 min e armazenado a -80 ° C.

Imediatamente antes do procedimento de microdissecção a laser, as secções foram fixadas em frio de gelo, preparada de fresco de etanol a 70% durante 30 segundos, lavou-se por 5-6 depressões em gelo água tratada com DEPC a frio, e desidratado por duas incubações de um minuto em gelo 100% frio etanol seguido de xileno (que é utilizado para a desidratação do tecido) durante 4 min; secções de tecido foram então secos ao ar depois de 3-5 min. Mais importante ainda, todos os passos, excepto a incubação em xileno, foram realizadas utilizando geladas reagentes - uma modificação ao longo de um protocolo previamente descrito ^6. Utilization de reagentes geladas resultou num aumento acentuado da autofluorescência intrínseca das células beta, e facilitado o seu reconhecimento. Por microdissecção, quatro secções foram desidratadas de cada vez: dois foram colocados em um tubo de ml embrulhado em papel alumínio 50, para proteger o tecido da humidade e de branqueamento, os dois restantes foram imediatamente microdissecados. Este procedimento foi realizado utilizando um instrumento PALM MicroBeam (Zeiss) empregando a pressão Laser Auto Catapulting (AutoLPC) de modo. A conclusão da célula beta / dissecção ilhota a partir de quatro criocortes necessários não mais do que 40-60 min. As células foram recolhidas para um AdhesiveCap e lisadas com 10 ul de tampão de lise. Cada amostra de RNA simples para análise transcriptomic foi obtida através da combinação de 10 amostras de células microdissecadas, seguido por extracção de ARN usando o Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). Este protocolo melhora a autofluorescência intrínseca das células beta humanas, facilitando assim o seu reconhecimento rápido e preciso e collection. Melhorar ainda mais este procedimento poderia permitir que a dissecção das células beta fenotipicamente diferentes, com possíveis implicações para uma melhor compreensão das mudanças associadas com o diabetes tipo 2.

Protocolo

1. Congelamento de tecido pancreático humano

Remover o tecido adiposo, vasos sanguíneos, nervos e não-parenquimatosa tecido com um bisturi e pinças, e cortar o tecido pancreático em pedaços (cubos de ~ 0,5-1 cm).
Coloque um pedaço de tecido pancreático, no centro de uma Cryomold e cobri-lo completamente com frio Composto outubro Tissue-Tek. Coloque a Cryomold em um frasco cujo fundo está coberto com pré-arrefecida 2-metilbutano e de encaixe por congelação em azoto líquido. Armazenar a amostra congelada a -80 ° C.

2. Preparação de cortes congelados

Usar luvas durante todo todas as medidas para evitar a....