Neste artigo, apresentamos um método para analisar microvasos tumorais in vivo utilizando dinâmica com contraste de fluorescência videomicroscopia. Dois parâmetros quantitativos foram adquiridos: densidade capilar funcional refletindo a vascularização do tumor, e perdas de índice que reflete o vazamento de parede endotelial.
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Artigo de método
Imagem in vivo da angiogênese tumoral utilizando fluorescência confocal Videomicroscopia
Neste artigo
Resumo
Resumo
Desfibrado de fluorescência confocal imagiologia in vivo com um feixe de fibras ópticas utiliza o mesmo princípio como microscopia confocal de fluorescência. Ele pode excitar fluorescente in situ elementos através das fibras ópticas, e depois gravar alguns dos fótons emitidos, através das mesmas fibras ópticas. A fonte de luz é um laser que emite luz de excitação através de um elemento no interior do feixe de fibras e como ele varre ao longo da amostra, uma recria a imagem de pixel por pixel. Como este tipo de exame é muito rápido, combinando-a com o software de processamento de imagem dedicada, imagens em tempo real com uma frequência de 12 quadros / s pode ser obtida.
Nós desenvolvemos uma técnica para caracterizar quantitativamente morfologia e função capilar, usando um dispositivo de fluorescência confocal videomicroscopia. O primeiro passo em nosso experimento foi gravar 5 filmes seg nos quatro quadrantes do tumor para visualizar a rede capilar. Todos os filmes foram processados usando o software (ImageCell, Mauna Kea Tecnologia, Paris, França) que realiza uma segmentação automatizado de vasos em torno de um diâmetro escolhido (10 mM em nosso caso). Assim, pode quantificar o 'densidade capilar funcional ", que é a relação entre a área total do vaso, e a área total da imagem. Este parâmetro é um marcador substituto para a densidade microvascular, geralmente mensurados usando ferramentas de patologia.
O segundo passo foi a gravar filmes do tumor ao longo de 20 min para quantificar a fuga do agente de contraste macromolecular através da parede capilar para o interstício. Ao medir a proporção de intensidade de sinal no interstício em relação à dos vasos, um "índice de fuga 'foi obtida, agindo como um marcador substituto para a permeabilidade capilar.
Introdução
A angiogénese é um processo complexo que envolve uma formação de novos vasos sanguíneos a partir de vasos pré-existentes. As alterações patológicas da microcirculação do tecido, composta de arteríolas, capilares, e vénulas, estão implicados numa vasta gama de doenças tais como o cancro, a inflamação, ou a diabetes. Portanto, é essencial para desenvolver métodos para avaliar quantitativamente a estrutura ea função microvascular. Imagem permite o estudo de microvasos em uma não-forma ou micro-invasivo, em tempo real e in vivo, e medidas repetidas ao longo do tempo no mesmo animal 2.
Atualmente, a dinâmica com ....
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Protocolo
1. Preparação do Agente de Contraste
- Para FITC-dextrano 70 kDa, a dose injectada é de 500 mg / kg (10 mg de FITC-dextrano diluído em 0,1 ml de solução salina por um rato pesando 20 g).
- O agente não deve ser demasiado longo exposta à luz. Para evitar o branqueamento, é recomendado para cobrir o tubo com folha de alumínio.
2. Anestesia
- Os ratinhos foram anestesiados por uma injecção intraperitoneal de uma mistura de 1:4 de xilazina (Rompun 2%, Bayer, Puteaux, França) e cetamina (cetamina 500, Virbac, Carros, França), respectivamente, 66 mg / kg e 264 mg / kg para a 20 g mouse.
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Resultados
Com os dados recolhidos, podemos analisar quantitativamente diferentes parâmetros que refletem a microcirculação.
Foram estudados in vivo, a rede vascular periférica de um tumor do cólon implantadas em ratinhos Balb-C utilizando um sistema de fluorescência confocal videomicroscopia desfibrado (Cellvizio, Maunakea Tecnologia, Paris, França 2), após a injecção de um agente de contraste fluorescente macromolecular isotiocianato-dextrano ( FITC-dextrano) com um peso molecular.......
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Discussão
O estudo da microcirculação tumor tornou-se essencial para a compreensão da fisiopatologia do crescimento do tumor, disseminação e resposta à terapia 1. A imagem óptica é uma das técnicas que podem ser utilizadas para observar os vasos capilares, utilizando um agente de contraste fluorescente e para quantificar morfológica (Densidade capilar funcional) e de fuga (índice) parâmetros funcionais.
A microscopia de fluorescência de imagem foram utilizados neste estudo tem vantagens e l.......
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Divulgações
Não temos nada a divulgar.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Insulina seringe Myjector 1ml 29G | Terumo Europe | BS-05M2913 | |
| Isotiocianato de fluoresceína-dextrano 70 kDa | Sigma-Aldrich | 01619HH | 100 mg/mL diluído em solução salina |
| Videomicroscopia confocal em fibra | Cellvizio - MaunaKit | ||
| para LEICAFCM1000 | Leica Microsystems | LSU-488 | Loja em 4 ° Sonda C |
| ProFlexTM Z | MaunaKea Technologies | ||
| Software de mosaico | MaunaKea Technologies | ||
| Software de detecção de vasos | MaunaKea Technologies |
Referências
- Folkman, J. Fundamental concepts of the angiogenic process. Curr Mol Med. 3 (7), 643-651 (2003).
- Laemmel, E., Genet, M., Le Goualher, G., Perchant, A., Le Gargasson, J. F., Vicaut, E. Fibered confocal fluorescence....
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Reimpressões e permissões
