Summary
이 논문에서는 동적 조영 증강 형광 videomicroscopy를 사용하여 생체 내에서 종양의 미세 혈관을 분석하는 방법을 제시한다. 두 정량적 파라미터를 획득 하였다 : 기능성 종양 혈관을 반영 모세관 밀도 및 내피 벽 leakiness 반사 인덱스 누설.
Abstract
광섬유 번들 Fibered 공 초점 형광 생체 촬상 형광 공 초점 현미경과 같은 원리를 사용한다. 이 광섬유를 통해 원위치 요소에 형광을 자극 한 후 동일한 광섬유를 통해 방출 된 광자의 일부를 기록 할 수있다. 광원은 섬유 다발 내의 요소를 통해 여기 광을 전송하고 샘플을 통해 스캔과 같은, 화소에 의해 화상의 화소를 다시 레이저이다. 이것은 스캔이 전용 이미지 프로세싱 소프트웨어와 조합함으로써, 매우 빠르고 같이, 12 프레임 / 초의 주파수 실시간 화상을 얻을 수있다.
우리는 공 초점 형광 videomicroscopy 장치를 이용하여 정량적으로 모세관 형태와 기능을 특성화하는 기술을 개발했다. 우리의 실험에서 첫 번째 단계는 모세관 네트워크를 시각화하는 종양의 사분면에서 5 초 영화를 기록하도록 하였다. 모든 영화는 (소프트웨어를 사용하여 처리 된 ImageCell, 선택 직경 (우리의 경우 10 ㎛)의 주위에 혈관의 자동 분할을 수행 마우나 케아 기술, 파리, 프랑스). 따라서, 우리는 전체 혈관 영역과 화상의 전체 영역 사이의 비율이다 '기능적 모세관 밀도'정량화 있었다. 이 파라미터는 보통 병리 도구를 사용하여 측정 된, 미세 혈관 밀도에 대한 대리 마커이었다.
두 번째 단계는 간질로 모세관 벽을 통해 고분자 조영제의 누출을 정량화하기 20 분에 걸쳐 종양의 영화를 기록하는 것이었다. 혈관 그 이상의 간질에서 신호 강도의 비를 측정함으로써, '인덱스 누설'모세관 투과성에 대한 대리 마커로서 작용 얻었다.
Introduction
혈관 신생은 기존 혈관으로부터 새로운 혈관의 형성을 포함하는 복잡한 과정 일이다. 동맥, 모세 혈관, 세정맥과 구성 조직의 미세 혈관의 병리학 적 변화는,, 암, 염증, 당뇨병과 같은 질병의 넓은 범위에 연루되어있다. 정량적 미세 혈관의 구조와 기능을 평가하는 방법을 개발하는 것이 필수적이다. 영상은 실시간 및 생체 내에서, 비 - 또는 마이크로 - 침습적 방식으로 미세 혈관의 연구를 가능하게하고, 동일 동물이 경시 반복 측정.
현재 동적 조영 증강 (DCE) 영상 (3)은 일반적으로 조직의 미세 혈관을 평가하는 데 사용됩니다. 동적 조영 증강 영상은 시간이 지남에 따라 정맥 주사 추적의 생체 분포를 따르는 기술이다. 이번 인수에서 정량적 매개 변수는 조직의 혈관 신생을 반영 추출 할 수 있습니다. DCE 영상대부분 CT, MRI 또는 초음파로 사용되어왔다. 그러나 이러한 영상 기술은 특정 실험 장치의 사용과 그 이외의 해상도가 가장 자주 거시적 남아 있기 때문에, 미세 혈관의 직접적인 관찰을 허용하지 않는다.
이 논문에서, 우리는 fibered 촛점 videomicroscopy으로, 동적 조영 증강 광학 이미징을 사용하여 미세한 규모 및 생체 내에서 종양 혈관을 연구하기 위해 제안한다. 우리는 그 분자량 및 조직의 내피 세포의 특성을 연구 4에있어서, 간질로 내피 장벽을 통한 혈관 누수 또는 내에서만 남아 고분자 조영제 (FITC-덱스 트란) 사용. 이 누출 및 간질에 축적에 의해, 제대로 혈관을 서술하여 모두 미세 혈관 구조의 연구는, 모세 혈관 투과성을 허용했다.
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Protocol
1. 조영제의 제조
- FITC-덱스 트란 70 kDa의 경우, 주사 투여 량은 500 ㎎ / ㎏ (FITC-덱스 트란 10 ㎎ 20 g의 무게 마우스에 생리 식염수 0.1 ㎖에 희석)입니다.
- 에이전트는 빛에 너무 오래 노출되어서는 안된다. 표백을 방지하기 위해, 그것은 알루미늄 호일로 튜브를 포함하는 것이 좋습니다.
2. 마취
- 마우스는 자일 라진의 1:4 혼합물의 복강 내 주사하여 마취 (Rompun 2 %, 바이엘, 뿌뛰, 프랑스)와 케타민 (ketamine을 500 년 Virbac, 카 로스, 프랑스), 각각 66 ㎎ / ㎏과 264 ㎎ / ㎏ 20g의 마우스.
3. 관심있는 기관의 준비
- 우리는 (피하 종양에 예를 들어,) 그 위치에 마우스를 면도. 동물의 머리는 종종 흰색 자동 형광입니다. 때 블랙, 그것은 빛을 흡수한다.
- 이미지에 표시 할 기관이 직면 한 피부를 절개. 그것은 피 흘리고 때까지 기다리는 것이 중요합니다G 그렇지 않으면 혈액에서 새어 이미지를 오염시킬 것이다, 조영제를 주입하기 전에 중지되었습니다.
4. 획득
- 조영제는 정맥 또는 꼬리 정맥 하나를 통해 주입 하였다. 형광 조영제의 부재하에 관찰 된 장기 또는 더 작은 배경 신호 없다.
- 프로브는 묘화되는 장기의 전방에 배치 하였다. 우리의 연구에서, 이것은 종양이었다.
- 레이저는 종양을 조명하고 모세 혈관의 형광을 볼에가되었습니다.
- 종양은 모세 혈관의 네트워크를 시각화하기 위해 기록하는 동안 매우 느린 운동에 프로브를 이동하여 수동으로 탐구했다. 그것은 꾸준한 손을 유지하는 것이 중요하고,이 기술은 약간의 경험이 필요합니다. 본 연구에서는 첫 번째 단계는 기능 모세 혈관 밀도의 정량화를 허용했다.
- 두 번째 단계는 시간이 지남에 따라 동적 취득했다. 본 연구의 경우, 우리는 70 kDa의 FITC-덱스 트란을 사용. 대부분의 정상 장기에 침입 누설은 없습니다 만, 종양이 있습니다. (우리의 경우에서와 같이) 시간에 따른 동일한 위치의 이미지를 얻기 위해서는, 그 영역에 프로브를 유지하는 시스템을 설정하는 것이 중요하다. 이는 프로브를 보유하는 핸드 지원을 사용하여 수행하고, 프로브의 팁 초음파 겔의 비트 배치 순서 하였다. 기록 전에, 시간은 종양과 접촉하여 배치 프로브 안정화 쓰였다. 위치가 확보되자 인해 마우스의 호흡에 대한 최소한의 움직임이 있었다. 레이저는 모세관 누출의 존재를 검출하기 위해 20 분 동안 3 30 초마다 이미지를 기록하기 위해 설정되었다. 그것은 조영제 표백을 줄이기 위해 각각의 기록에 사이가되었습니다.
- 우리의 실험에서, 마우스는 종양의 조직 학적 분석을위한 절차의 단부에 희생되었다.
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Representative Results
수집 된 데이터를 사용하여, 우리는 양적으로 미세 혈관을 반영하는 다른 매개 변수를 분석 할 수 있습니다.
우리는 공부 생체 fibered 공 초점 형광 videomicroscopy 시스템 (Cellvizio, Maunakea 기술, 파리, 프랑스 2), 고분자 형광 조영제 주입 후 형광 염료 - 덱스 트란 (사용 BALB-c 마우스에 이식 대장 종양의 말초 혈관 네트워크 70 kDa의 (시그마 - 알드리치 (Sigma-Aldrich) 생 캉탱 Fallavier 호텔, 프랑스)와 각각 488 ㎚, 520 ㎚의 여기 및 방출 파장 (우리의 이미징 시스템과의 호환성을 위해)의 분자량 FITC-덱스 트란).
우리의 실험에서 첫 번째 단계는 모세관 네트워크를 시각화하는 종양의 네 사분면 각각에 5 초간의 동영상을 기록했다. 종양의 혈관이 허용 대표적인 샘플링. 모든 영화는 소프트웨어 (ImageCell로, 마우나를 사용하여 처리 하였다케아 기술, 파리, 프랑스)는 직경 5 ~ 20 μm의에 이르기까지 혈관을 포함 선택 직경 (우리의 경우 10 ㎛) 정도 이미지에 혈관의 자동 분할을 수행. 따라서, 우리는 전체 혈관 영역과 화상의 전체 영역 사이의 비율이다 '기능적 모세관 밀도'(FCD)를 정량화 있었다. 이 파라미터는 보통 병리 도구를 사용하여 측정 된, 미세 혈관 밀도의 대리 마커이었다.도 1을 수득하는 이미지의 종류 및 혈관 분할의 결과의 예를 나타낸다. 이 예에서, FCD는 36 %로 측정되었다.
이어서, 세 개의 이미지는 모세관 누출의 존재를 검출하기 위해 20 분 동안 매 30 초를 기록 하였다. 이미지의 시각적 검사는 제 조영제 간질로 누출뿐 아니라 공간적 분포 (동종 또는 이종)의 부재 또는 존재를 평가하기 위해 수행 하였다.
우리는 INT의 세 지역을 끌었다 시점 0, 5, 10, 20 분의 간질에있는 모세 혈관 세 ROI에 erest (ROI). 세 가지 다른 모세관와 연속 격자 간 영역 내의 신호 강도 (SI)는 각 시점에서 평균화 하였다. =의 Σ IP가 혈관 주위 (간질) 강도와 II의 혈관 강도 5입니다 [(Ip1/Ii1) + (Ip2/Ii2) + (Ip3/Ii3)] × 3분의 100을 다음과 같이 인덱스 누설 (%)을 계산 하였다 -7.도 2는 간질의 조영제 누설의 일례를 나타낸다. 이 예에서, 인덱스 누설 1.47로 측정되었다.
이 동적 조영 증강 광학 이미징 기술은 종양의 미세 혈관의 생체 측정에 있습니다. 이는 모세관 투과성을 정량화하여 모세관 밀도, 그리고 그들의 기능을 정량화 의해 종양 혈관의 구조를 반영한다.
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그림 1. 왼쪽 :. 종양의 표면 층에있는 미세 혈관의 사진 오른쪽 : 용기 감지 모듈의 응용 프로그램에 자동으로 배열하는 직경 세그먼트 혈관 5-20 μm의 (그 직경 : 10 ㎛). 분할 된 선박은 보라색으로 표시됩니다.
그림 2. 상이한 시점에서 간질 각각 t 0 (a), t 5 (b), t 10의 (c) 및 t 20의 (d). 용기 (V)에 모세관으로부터 누설 높은 신호 선형 구조를 보인다. 주사 (T 0)하기 전에 신호가 간질 (I)에서 볼 수있다. 점진적 개선 인해 비정상적인 종양 내피 장벽을 통한 형광 조영제의 누출 간질에서 볼 수있다.
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Discussion
종양 미세 혈관의 연구는 종양의 성장, 보급 및 치료 1에 대한 응답의 병태 생리를 이해하는데 필수가되고있다. 광학 영상은 형광 조영제를 이용하여 모세 혈관을 관찰 및 형태학 (기능 모세관 밀도) 및 기능 (인덱스 누설) 파라미터를 정량화하는 데 사용할 수있는 기술 중 하나이다.
우리는이 연구에 사용 된 형광 현미경 영상은 장점과 한계를 모두 가지고 있습니다. 하나의 장점은 사용되는 조영제의 크기를 선택할 수있게되고있다. 여기에, 70-kDa의 FITC-덱스 트란과 실험의 시작 부분에있는 내피 장벽을 통해 누출은 우리가 사이 좋은 대조 혈관의 초기 형태 (비틀림, 무정부 네트워크, 등.) 관찰 할 수있는 최소한의했다 용기 및 간질 08 및 지연 후에, 관측으로 20 분에 걸쳐 조영제의 누설. 평면 (Xy)의 해상도는 우리가 대신 대부분의 다른 영상 기법 (MRI, CT, 초음파, PET ...)와 같은 거시적 인 수준으로, 미세한 수준에서 혈관과 간질을 시각화 할 수있는, (3.5 μM) 높았다. 마지막으로, 이것은 그들이 발생하는 변화가 관찰 될 수 있음을 의미하는, 실시간 영상이다.
그러나,이 기술에 단점이 있습니다. 이 장치는 작동 섬세합니다. 사실, 프로브는 매우 작은 (1.8 mm)와 미끄러운이며 오랜 기간 동안 종양에 같은 장소에서 숙박 어렵다. 동물의 호흡 운동은 끈기를 손상. 이 문제를 개선하기 위해, 우리는 위치에 프로브를 유지하기 위해 프로브와 핸드 메이드의 지원을 무력화하기 위해 초음파 젤을 사용했다. 또한, 우리는 결과를 우려에게 종양은 가장 표면층을 얻을 수 있다는 것을 의미하는 종양만을 피상적 인 영역 (100 μm의 170 μm의에서)를 탐색 할 수 있습니다.
주요 제한, howeveR, 광학 이미징을 사용하여 절대 정량에 도달의 어려움이다. 색인 누설 비율이며, 따라서 단지 반 정량적 파라미터. 첫째, 투자 수익 (ROI)에있는 부분 voluming에 의한 유물이있다. 평면 해상도가 높지만 실제로, Z-평면 해상도는 선박 및 간질을 모두 포함하는 것을 의미한다 (70 ㎛, 슬라이스 두께) 낮다. 10 μm의 직경을 가진 용기 내의 신호 강도를 측정 할 때 그러므로, 그것은 슬라이스에 포함 된 주변 간질로 평균화된다. 또한, 광학 영상에서 신호 강도 및 조영제 농도 사이의 복잡한 관계가있다. 조직이 광자에 의해 조명 될 때, 많은 이벤트가 동시에 발생하고 수집 된 신호에 영향을 미칠 수있다. 헤모글로빈이나 콜라겐 여기 또는 방출 광자를 흡수 할 수있는 조직의 자연 발색단이 있습니다. 여러 방향으로 광자를 분산 일부 확산층도있다. 마지막으로, 표백은 아마 하나입니다이 농도 신호 독립의 손실을 유도하기 때문에, FITC를 사용하는 가장 중요한 문제 중. 여러 연구 그룹은 광 신호를 정량화에 노력하고 있지만, 이것은 복잡한 modelization의 9,10를 의미한다.
마지막으로, 길이 방향의 연구를 쉽게 수행되지 않습니다. 우리는 이미지를 획득하기 위해 종양을 표시하기 위해 피부를 절개했고, 이는 관찰 된 장기가 체강 (예, 간, 신장)에서 깊은 특히, 절개를 폐쇄하기 어려울 수있다.
전반적으로, 우리는 공 초점 형광 videomicroscopy 장치를 이용하여 정량적으로 모세관 해부학 및 기능의 특성을 동적 조영 증강 형광 광학 이미징 기술을 개발했다. 이 기술은 추가적인 검증을 필요로하지만, 치료 전후, 또는 종양 모델 사이의 종양 혈관 신생을 비교하는 데 유용 할 수있다.
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Disclosures
우리는 공개 아무것도 없어.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Insulin serynge Myjector 1ml 29G |
Terumo Europe | BS-05M2913 | |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kDa | Sigma-Aldrich | 01619HH | 100 mg/mL diluted in saline |
| Fibered confocal videomicroscopy | Cellvizio - MaunaKea Technologies | ||
| Calibration and Cleaning Kit for LEICAFCM1000 | Leica Microsystems | LSU-488 | Store at 4 °C |
| Probe ProFlexTM Z | MaunaKea Technologies | ||
| Mosaicing software | MaunaKea Technologies | ||
| Vessel detection software | MaunaKea Technologies |
References
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- Laemmel, E., Genet, M., Le Goualher, G., Perchant, A., Le Gargasson, J. F., Vicaut, E. Fibered confocal fluorescence microscopy (Cell-viZio) facilitates extended imaging in the field of microcirculation. A comparison with intravital microscopy. J Vasc Res. 41 (5), 400-411 (2004).
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