Summary
In diesem Beitrag stellen wir eine Methode, um Tumormikrogefäßen in vivo Analyse mit dynamischen Kontrastmittel-Fluoreszenz-Videomikroskopie. Zwei quantitative Parameter wurden erworben: funktionelle Kapillardichte was die Durchblutung des Tumors und Leckage Index spiegelt die Undichtigkeit der endothelialen Wand.
Abstract
Fibered konfokalen Fluoreszenz in-vivo-Bildgebung mit einem Faseroptikbündel verwendet das gleiche Prinzip wie Fluoreszenz konfokalen Mikroskopie. Es kann Fluoreszenz-in situ-Elemente durch die optischen Fasern zu erregen, und dann erfassen einige der emittierten Photonen, über den gleichen optischen Fasern. Die Lichtquelle ist ein Laser, der das Anregungslicht durch ein Element innerhalb des Faserbündels sendet und wie es über die Probe scannt, erstellt ein Bild Pixel für Pixel. Da diese Überprüfung ist sehr schnell, indem sie mit speziellen Bildverarbeitungssoftware können die Bilder in Echtzeit mit einer Frequenz von 12 Bildern / sec erhalten werden.
Wir entwickelten eine Technik, um quantitativ zu charakterisieren Kapillare Morphologie und Funktion mit einem konfokalen Fluoreszenz-Videomikroskopie Gerät. Der erste Schritt in unserem Experiment wurde auf 5 sec Filme aufnehmen in den vier Quadranten des Tumors, die kapillare Netzwerk visualisieren. Alle Filme wurden mit einer Software verarbeitet (ImageCell, Mauna Kea Technologie, Paris), die eine automatische Segmentierung von Schiffen zu einem gewählten Durchmesser (10 um in unserem Fall) führt. So konnten wir die funktionalen Kapillardichte ", die das Verhältnis zwischen der gesamten Gefäßfläche und der Gesamtfläche des Bildes zu quantifizieren. Dieser Parameter war ein Surrogatmarker für die mikrovaskuläre Dichte, mit der Pathologie Tools in der Regel gemessen.
Der zweite Schritt war, um Filme des Tumors aufnehmen über 20 Minuten, um ein Auslaufen der makromolekularen Kontrastmittel durch die Kapillarwand in das Interstitium zu quantifizieren. Durch Messung des Verhältnisses der Signalintensität im Interstitium gegenüber der in den Behältern wurde eine Index Leckage "erhalten wird, als Surrogatmarker für die Durchlässigkeit der Kapillaren wirkt.
Introduction
Angiogenese ist ein komplexer Prozess 1, die die Bildung neuer Blutgefäße aus bereits vorhandenen Fahrzeugen beinhaltet. Pathologische Veränderungen im Gewebe Mikrozirkulation, von Arteriolen, Kapillaren und Venen besteht, sind in einer großen Palette von Krankheiten, wie Krebs, Entzündungen oder Diabetes in Verbindung gebracht. Es ist daher wichtig, Methoden zu quantitativ beurteilen Mikrogefäßstruktur und-funktion zu entwickeln. Bildgebung ermöglicht die Untersuchung von Mikrogefäßen in einem nicht-oder mikroinvasive Weise in Echtzeit und in vivo und wiederholten Messungen im Laufe der Zeit in dem gleichen Tier 2.
Derzeit wird die dynamische kontrastverstärkte (DCE) Bild 3 häufig verwendet, um Gewebe-Mikrozirkulation zu beurteilen. Dynamischen kontrastverstärkten Bildgebung ist eine Technik, die im Laufe der Zeit die Bioverteilung eines Tracers intravenös injiziert folgt. Von dieser Übernahme kann quantitative Parameter extrahiert reflektierende Gewebe Gefäß werden. DCE-Bildgebungwurde am häufigsten mit CT, MRT oder Ultraschall verwendet werden. Allerdings sind diese bildgebenden Verfahren nicht zulassen, dass die direkte Betrachtung der Mikrogefäße, da ihre Auflösung, anders als bei der Verwendung von bestimmten experimentelle Geräte bleibt meist makroskopische.
In diesem Papier, schlagen wir vor, das Gefäßsystem des Tumors auf der mikroskopischen Skala und in vivo-Studie mit dynamischen kontrastverstärkten optischen Bildgebung, mit fibered konfokalen Videomikroskopie. Wir verwendeten eine makromolekulare Kontrastmittel (FITC-Dextran), die ausschließlich in Behältern oder Lecks durch die endotheliale Schranke in das Interstitium bleibt, nach seinem Molekulargewicht und die Eigenschaften des Endothels der untersuchten Gewebe 4. Dies ermöglichte die Untersuchung der beiden Mikrogefäßstruktur, durch die korrekte Abgrenzung Gefäße und Durchlässigkeit der Kapillaren, durch auslaufende und der sich in das Interstitium.
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Protocol
1. Herstellung des Kontrastmittels
- Für FITC-Dextran 70 kDa, die injizierten Dosis ist 500 mg / kg (10 mg FITC-Dextran in 0,1 ml Kochsalzlösung für eine Maus mit einem Gewicht von 20 g verdünnt).
- Das Mittel sollte nicht zu lange ausgesetzt werden, um Licht. Bleich zu vermeiden, empfiehlt es sich, das Röhrchen mit Aluminiumfolie abzudecken.
2. Anästhesie
- Mäuse wurden durch eine intraperitoneale Injektion einer Mischung von 1:4 von Xylazin (Rompun 2%, Bayer, Puteaux, Frankreich) und Ketamin (Ketamin 500, Virbac, Carros, Frankreich), die jeweils 66 mg / kg und 264 mg / kg für eine 20 g-Maus.
3. Vorbereitung der Orgel in der Nähe
- Wir rasierte Mäuse am Ort von Interesse (z. B. über einen subkutanen Tumor). Tier Haar ist oft, wenn Autofluoreszenz weiß. Wenn schwarz, absorbiert es Licht.
- Die Haut vor der Orgel, die abgebildet werden wurde eingeschnitten. Es ist wichtig, zu warten, bis die bleeding hat vor der Injektion des Kontrastmittels gestoppt, sonst wird es im Blut austreten und verunreinigen das Bild.
4. Erwerb
- Das Kontrastmittel wurde entweder durch die Halsschlagader oder die Schwanzvene injiziert. Es gibt keine oder nur eine geringe Hintergrundsignal in dem in Abwesenheit eines fluoreszierenden Kontrastmittels beobachtet Organ.
- Die Sonde wurde vor dem abzubildenden Organ platziert. In unserer Studie war der Tumor.
- Der Laser eingeschaltet, um den Tumor zu beleuchten und sehen die Fluoreszenz in den Kapillaren.
- Der Tumor wurde manuell durch Bewegen der Sonde in einem sehr langsamen Bewegung während der Aufnahme, um die Kapillare Netzwerk visualisieren erforscht. Es ist wichtig, eine ruhige Hand zu halten, und diese Technik erfordert ein wenig Erfahrung. In unserer Studie erlaubt dieser erste Schritt Quantifizierung der funktionellen Kapillardichte.
- Der zweite Schritt war die dynamische Erfassung über die Zeit. Für diese Studie verwendeten wir ein 70 kDa-Dextran-FITC. Es gibt keine interstitielle Leckage in den meisten normalen Organen, aber es ist in Tumoren. Um Bilder von der gleichen Stelle über die Zeit (wie in unserem Fall) zu erwerben, ist es wichtig, ein System einzurichten, um die Sonde auf dem Gebiet von Interesse aufrecht zu erhalten. Dies wurde durch eine handgefertigte Unterstützung, um die Sonde zu halten gemacht, und indem man ein bisschen Ultraschall-Gel auf der Spitze der Sonde. Vor der Aufnahme wurde Zeit für die Stabilisierung der Sonde in Kontakt mit dem Tumor platziert. Sobald die Position gesichert war, gab es nur minimale Bewegung aufgrund der Maus die Atmung. Der Laser eingeschaltet, um Bilder 3 alle 30 s für 20 min aufgezeichnet, um die Anwesenheit kapillares Leck zu erfassen. Es wurde zwischen jeder Aufnahme drehte sich um Kontrastmittel Bleich reduzieren.
- In unserem Experiment wurden die Mäuse am Ende des Verfahrens für die histologische Analyse von Tumoren geopfert.
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Representative Results
Verwendung der gesammelten Daten, könnten wir verschiedene Parameter quantitativ zu analysieren reflektierenden Mikrozirkulation.
Wir untersuchten in vivo die periphere Gefäßnetz eines Darmtumors in Balb-c-Mäuse mit einem konfokalen Fluoreszenzvideomikroskopie fibered System (Cellvizio, Maunakea Technologie, Paris, France 2), nach der Injektion eines makromolekularen fluoreszierenden Kontrastmittels Fluoresceinisothiocyanat-Dextran (implantiert FITC-Dextran) mit einem Molekulargewicht von 70 kDa (Sigma-Aldrich, St. Quentin Fallavier, Frankreich) und mit Anregungs-und Emissionswellenlängen von 488 nm und 520 nm jeweils (für Kompatibilität mit den Abbildungssystem).
Der erste Schritt in unserem Experiment wurde auf 5 sec Filme aufzuzeichnen in jedem der vier Quadranten des Tumors, die kapillare Netzwerk visualisieren. Dies ermöglichte repräsentative Probenahme von der Gefäßversorgung von Tumoren. Alle Filme wurden mit einer Software (Imagecell, Mauna verarbeitetKea Technologie, Paris Frankreich) Durchführen einer automatisierten Segmentierung der Gefäße in den Bildern zu einem gewählten Durchmesser (10 um in unserem Fall, die Schiffe von 5-20 um im Durchmesser enthalten). So konnten wir die "funktionelle Kapillardichte" (FCD), die das Verhältnis zwischen der Gesamtgefäßfläche und der Gesamtfläche des Bildes ist zu quantifizieren. Dieser Parameter wurde ein Surrogat-Marker für mikrovaskuläre Dichte mit Pathologie Werkzeuge üblicherweise gemessen. Fig. 1 zeigt ein Beispiel für die Art von Bildern erhalten und das Ergebnis der Gefäßsegmentierung. In diesem Beispiel wurde FCD als 36% gemessen.
Dann wurden drei Bilder alle 30 Sekunden für 20 Minuten aufgezeichnet, um die Anwesenheit von kapillares Leck zu erfassen. Die visuelle Untersuchung der Bilder wurde durchgeführt, um die Abwesenheit oder Anwesenheit des Kontrastmittels Leckage in das Interstitium sowie ihre räumliche Verteilung (homogen oder heterogen) zu bewerten.
Wir zogen drei Regionen int erest (ROI) in den Kapillaren und drei ROI im Interstitium zu den Zeitpunkten 0, 5, 10 und 20 min. Die Signalintensität (SI) in den drei verschiedenen Kapillaren und angrenzend interstitiellen Bereiche wurden für jeden Zeitpunkt gemittelt. Leck Index (%) wurde wie folgt = Σ [(Ip1/Ii1) + (Ip2/Ii2) + (Ip3/Ii3)] x 100/3, wobei Ip perivaskulären (oder interstitielle) Intensität und Ii intravaskulären Intensität 5 berechnet -7. Fig. 2 zeigt ein Beispiel eines Kontrastmittels Leckage im Interstitium. In diesem Beispiel wurde als Leckindex 1,47 gemessen.
Diese dynamische kontrastverstärkte optische Abbildungstechnik ermöglicht in vivo Messungen der Tumormikrozirkulation. Es spiegelt die Architektur von Tumorgefäßen durch Quantifizieren Kapillardichte und ihre Funktionalität durch die Quantifizierung Kapillarpermeabilität.
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Fig. 1 ist. Links:. Bild der Mikrogefäße in der Oberflächenschicht des Tumors Rechts: Anwendung des Schiffes Detektionsmodul automatisch Segment Gefäße mit Durchmessern von 5-20 um (Durchmesser von Interesse: 10 um). Die segmentierten Gefäße sind in lila hervorgehoben.
2. Leckage aus den Kapillaren im Interstitium zu verschiedenen Zeitpunkten t 0 bzw. (a), T 5 (b), t 10 (c) und t 20 (d). Schiffe (V) werden als High-Signal lineare Strukturen gesehen. Vor der Injektion (t 0), wird kein Signal im Interstitium (I) gesehen. Progressiv kann eine Verstärkung im Interstitium aufgrund eines Lecks des fluoreszierenden Kontrastmittels durch die abnorme Tumor Endothelbarriere sehen.
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Discussion
Die Untersuchung der Tumormikrozirkulation unverzichtbar geworden für das Verständnis der Pathophysiologie von Tumorwachstum, Verbreitung und Ansprechen auf die Therapie ein. Optisches Abbildungs ist eine der Techniken, die verwendet werden können, um die Kapillaren zu beobachten unter Verwendung eines fluoreszierenden Kontrastmittels und morphologischen (funktionelle Kapillardichte) und funktionellen (Index Leckage) Parameter zu quantifizieren.
Die Fluoreszenz Mikroskopie wir in dieser Studie verwendet wird, hat sowohl Vorteile und Grenzen. Ein Vorteil ist die Möglichkeit, die Größe des Kontrastmittels zu wählen. Hier mit einer 70-kDa FITC-Dextran, Leckage durch die endothelialen Barriere am Beginn des Experiments war minimal, die uns um die anfängliche Morphologie (Verwindung, anarchische Netzwerk, etc.) Der Gefäße mit einem guten Kontrast zwischen beobachten erlaubt Schiffe und Interstitium 8, und nach einer Verzögerung, ein Austreten des Kontrastmittels über 20 min der Beobachtung. Die in der Ebene (xy) Auflösung war hoch (3,5 Mikrometer), die uns, die Schiffe und das Interstitium auf mikroskopischer Ebene statt einer makroskopischen Ebene wie bei den meisten anderen bildgebenden Verfahren (MRT, CT, Ultraschall, PET ...) sichtbar zu machen, erlaubt. Schließlich ist das Echtzeit-Bildverarbeitung, das heißt, Veränderungen zu beobachten, wie sie auftreten werden.
Es gibt jedoch Nachteile bei diesem Verfahren. Das Gerät ist empfindlich zu bedienen. Tatsächlich ist die Sonde sehr klein (1,8 mm) und schlüpfrig und es schwierig ist, an der gleichen Stelle auf den Tumor über lange Zeiträume bleiben. Atembewegungen des Tieres gefährden auch Beständigkeit. Um dies zu verbessern, haben wir Ultraschall-Gel, um die Sonde und ein handgefertigtes Träger zu immobilisieren, um die Sonde in Position zu halten. Darüber hinaus können wir nur die oberflächlichen Bereich des Tumors (100 &mgr; m bis 170 &mgr; m) zu erforschen, was bedeutet, dass die erhaltenen Ergebnisse betreffen nur die oberflächlichen Schichten des Tumors.
Die Hauptgrenze, however ist die Schwierigkeit beim Erreichen absoluten Quantifizierung mittels digitaler Bildverarbeitung. Leckindex ist ein Verhältnis, und daher nur eine semi-quantitative Parameter. Erstens gibt es Artefakte aufgrund von Teil voluming in der ROI. In der Tat, obwohl die Auflösung in der Ebene ist hoch, ist die z-Ebene Auflösung niedrig (Schichtdicke von 70 um), was bedeutet, dass sie beide Gefäße und Interstitium. Daher wird, wenn die Messung der Signalintensität in einem Behälter mit einem 10 &mgr; m Durchmesser, das mit dem umgebenden Interstitium in der Scheibe enthalten ist, gemittelt. Auch bei der optischen Abbildung, gibt es eine komplexe Beziehung zwischen der Signalintensität und Kontrastmittelkonzentration. Wenn ein Gewebe wird durch Photonen beleuchtet, kann viele Ereignisse gleichzeitig auftreten und beeinflussen die aufgenommenen Signals. Es gibt natürliche Chromophoren in Geweben, die Anregungs-oder Emissions Photonen wie Hämoglobin oder Kollagen aufnehmen kann. Es gibt auch eine gewisse Diffusion der Photonen in verschiedenen Richtungen streut. Schließlich ist wahrscheinlich eines Bleichder wichtigsten Fragen bei der Verwendung von FITC, weil es einen Signalverlust unabhängig von der Konzentration induziert. Mehrere Arbeitsgruppen werden auf die Quantifizierung der optischen Signal arbeiten, aber dies bedeutet eine komplexe modelization 9,10.
Schließlich werden Längsschnittstudien nicht einfach durchgeführt. Wir hatten, um die Haut um den Tumor, um die Bilder zu erwerben offenbaren einzuschneiden, und es kann sich als schwierig erweisen, um hautnah die Inzision, insbesondere, wenn die beobachtete Organ ist tief in der Körperhöhle (z. B. Leber-oder Nieren).
Insgesamt haben wir einen dynamischen Kontrast-verstärkte Fluoreszenz optische Abbildungstechnik quantitativ zu charakterisieren Kapillare Anatomie und Funktion, mit einem konfokalen Fluoreszenz-Videomikroskopie Gerät. Diese Technik erfordert eine weitere Bestätigung, aber nützlich zum Vergleichen Tumorvaskularisation vor und nach Therapie, oder zwischen Tumormodellen sein.
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Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Insulin serynge Myjector 1ml 29G |
Terumo Europe | BS-05M2913 | |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kDa | Sigma-Aldrich | 01619HH | 100 mg/mL diluted in saline |
| Fibered confocal videomicroscopy | Cellvizio - MaunaKea Technologies | ||
| Calibration and Cleaning Kit for LEICAFCM1000 | Leica Microsystems | LSU-488 | Store at 4 °C |
| Probe ProFlexTM Z | MaunaKea Technologies | ||
| Mosaicing software | MaunaKea Technologies | ||
| Vessel detection software | MaunaKea Technologies |
References
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- Laemmel, E., Genet, M., Le Goualher, G., Perchant, A., Le Gargasson, J. F., Vicaut, E. Fibered confocal fluorescence microscopy (Cell-viZio) facilitates extended imaging in the field of microcirculation. A comparison with intravital microscopy. J Vasc Res. 41 (5), 400-411 (2004).
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