Summary
本論文では、ダイナミック造影蛍光ビデオ顕微鏡を用いてインビボで腫瘍の微小血管を分析する手法を提案する。二つの定量的なパラメータを取得した：機能性腫瘍の血管分布を反映した毛細血管密度、および内皮の壁の漏出インデクス反映漏れ。
Abstract
光ファイバ束と繊維質共焦点蛍光in vivoイメージング、蛍光共焦点顕微鏡と同じ原理を使用しています。それは、光ファイバを介してその場要素で蛍光を励起し、同じ光ファイバを介して 、放出された光子のいくつかを記録することができます。光源は、ファイバ束内の要素を介して励起光を送信し、それが試料上を走査するように、画素によって画像画素を再現レーザである。このスキャンは、専用の画像処理ソフトウェアと組み合わせることにより、非常に高速であるように、12フレーム/秒の周波数にリアルタイムで画像を得ることができる。
我々は、共焦点蛍光ビデオ顕微鏡装置を用いて、定量的にキャピラリーの形態及び機能を特徴付けるための技術を開発した。我々の実験の最初のステップは、毛細血管網を視覚化するために、腫瘍の4象限に5秒の動画を撮影することでした。すべての映画は、ソフトウェア（Iを用いて処理したmageCell、選ばれた直径（ここでは10ミクロン）の周囲に血管の自動化されたセグメント化を行い、マウナ·ケア·テクノロジー、パリフランス）。したがって、我々は、総血管面積画像の総面積との比である「機能毛細血管密度を '、定量化できた。このパラメータは、通常、病理学ツールを使用して測定し、微小血管密度の代理マーカーであった。
第二段階は、間質への毛細血管壁を介して高分子造影剤の漏出を定量化するために20分間かけて腫瘍の映画を記録することであった。血管におけるその上間質におけるシグナル強度の比を測定することによって、「インデックスリーク 'が毛細血管の透過性のための代理マーカーとして働く得た。
Introduction
血管新生は、既存の血管からの新たな血管の形成を含む複雑なプロセス1である。細動脈、毛細血管、および細静脈からなる組織の微小循環における病理学的変化は、例えば、癌、炎症、または糖尿病などの疾患の広い範囲に関与している。これは、定量的に微小血管の構造および機能を評価するための方法を開発することが不可欠である。画像化は、リアルタイムでおよびインビボで 、又は非マイクロ侵襲的に微小血管の研究を可能にし、同じ動物において2時間にわたって反復測定。
現在、ダイナミック造影（DCE）イメージング3は、一般的に、組織の微小循環を評価するために使用される。ダイナミック造影画像化を経時的に静脈内注射したトレーサーの生体内分布を、以下の技術である。この買収により、定量的なパラメータは、組織の血管新生を反映して抽出することができる。 DCEイメージング最も頻繁にCT、MRIまたは超音波で使用されている。しかし、これらのイメージング技術は、特定の実験装置を用いた以外、その解像度は、ほとんどの場合、巨視的なままであるため、微小血管の直接観察することはできません。
本論文では、繊維質共焦点ビデオ顕微鏡で、ダイナミック造影光学イメージングを用いて微細なスケールでそして生体内で腫瘍血管系を研究することを提案する。我々は、その分子量および組織の内皮細胞の特性を研究し4によれば、間質への内皮バリアを介して血管又は漏れ内で排他的に残る高分子造影剤（FITC-デキストラン）を使用した。これが漏れて間質に蓄積することにより、正確に血管を描出することにより、両方の微小血管構造の研究、および毛細血管の透過性を可能にした。
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Protocol
1。造影剤の調製
- FITC-デキストラン70kDaのために、注射用量は500 mg / kgの（FITC-デキストラン10mgを体重20gのマウスについての生理食塩水を0.1mlに希釈した）である。
- エージェントは、光に長すぎるさらしてはならない。漂白を回避するために、アルミホイルでチューブを覆うことが推奨される。
2。麻酔
- マウスをキシラジンの1:4の混合物の腹腔内注射により麻酔した（ロンプン2％、バイエル、ピュトー、フランス）とケタミン（ケタミン500、Virbacの、カロス、フランス）、それぞれ66 mg / kgで264 mg / kgの20グラムのマウス用。
3。関心のある器官の調製
- 私たちは、（例えば、皮下腫瘍の上）興味のある場所でマウスを剃毛。動物の毛は、多くの場合、白の自動蛍光性である。ときは黒、それが光を吸収する。
- 画像化される器官に面する皮膚を切開した。それはbleedinまで待つことが重要ですGは、それ以外の場合は、血液中に漏出し、画像を汚染する、造影剤を注入する前に停止しました。
4。買収
- 造影剤は、頚静脈又は尾静脈のいずれかを介して注射した。蛍光造影剤の非存在下で観察される器官でないか、またはほとんどバックグラウンド信号が存在しない。
- プローブは、画像化される器官の前方に配置した。我々の研究では、これは腫瘍であった。
- レーザーは、腫瘍を照射し、毛細血管の蛍光を見るためにスイッチを入れた。
- 腫瘍は毛細血管網を可視化するために記録しながら非常にゆっくり移動プローブを移動させることにより手動で調査した。これは、着実に手を維持することが重要であり、この技術はほとんど経験が必要です。我々の研究では、この最初のステップは、機能的な毛細管密度の定量化を可能にした。
- 第二段階は、時間の経過とともにダイナミックな買収だった。この研究のために、我々は70kDaのFITC-デキストランを使用。ほとんどの正常臓器には間質漏れはありませんが、腫瘍であります。 （我々の場合のように）時間をかけて同じ場所の画像を取得するためには、関心領域にプローブを維持するためにシステムを設定することが重要です。これは、プローブを保持するために手作りのサポートを使用することにより、前記プローブの先端に超音波ゲルのビットを配置することによって行った。記録する前に、時間は、腫瘍と接触して配置されているプローブを安定化するために費やされた。位置を固定した後、マウスの呼吸のために最小限の動きがありました。レーザは毛細血管漏出の存在を検出するために20分間3画像30秒毎に記録するためにスイッチを入れた。これは、造影剤の退色を低減するために、各記録の間にオフにされた。
- 我々の実験において、マウスを腫瘍の組織学的分析のための手順の終了時に屠殺した。
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Representative Results
収集したデータを用いて、定量的に微小循環を反射異なるパラメータを分析することができる。
我々は、（高分子蛍光造影剤フルオレセインイソチオシアネート-デキストランの注射後、 インビボ繊維質共焦点蛍光ビデオ顕微鏡システム（Cellvizio、マウナケア技術、パリ、フランス2）を用いてのbalb-cマウスに移植された結腸腫瘍の末梢血管ネットワーク内を研究70kDaの（シグマアルドリッチ、サンカンタンFallavier、フランス）は、それぞれ488 nmおよび520 nmの励起波長と発光波長との（私たちのイメージングシステムとの互換性のため）の分子量を有するFITC-デキストラン）。
我々の実験の最初のステップは、毛細血管網を視覚化するために、腫瘍の4象限のそれぞれに5秒の動画を撮影することでした。これは、腫瘍の血管新生の代表サンプリングを可能にした。すべての映画は、ソフトウェア（はImageCell、マウナを用いて処理したケアテクノロジー、パリフランス）は、直径5〜20μmの範囲の血管を含め選択した直径（ここでは10ミクロン、周りの画像内の血管の自動化された区分化を実行する）。したがって、我々は、総血管面積画像の総面積との比である「機能毛細血管密度 '（FCD）を、定量化することができる。このパラメータは、通常、病理学ツールを使用して測定し、微小血管密度の代理マーカーであった。 図1は、得られた画像の種類及び血管分割の結果の一例を示す。この例では、FCDは36％と測定された。
そして、3枚の画像を毛細血管漏出の存在を検出するために20分間30秒毎に記録した。画像の視覚的検査は、第1のコントラスト剤間質への漏出、ならびにその空間分布（均一または不均一）の有無を評価するために行った。
私たちは、int型の3つの領域を描きました毛細管および3つの時点における間質におけるROI 0、5、10および20分でerest（ROI）。三つの異なる毛細管および連続した格子間領域内の信号強度（SI）は、各時点で平均化した。 =ΣのIpが血管周囲（または間）強度であり、Iiは血管内強度5である[（Ip1/Ii1）+（Ip2/Ii2）+（Ip3/Ii3）]×100/3は、次のようにランキング漏れ（％）を算出した-7。 図2は、間質における造影剤の漏れの一例を示す。この例では、インデックス漏れを1.47として測定した。
このダイナミック造影光イメージング技術は、腫瘍の微小循環の生体内測定で可能にする。これは、毛細血管透過性を定量化することによって毛細血管密度、およびそれらの機能性を定量化することによって腫瘍血管の構造を反映している。
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図1。左：腫瘍の表層における微小血管の画像右：血管検出モジュールの適用を自動的に範囲の直径を持つセグメント容器5から20ミクロン（関心の径10μm）。セグメント化された血管は、紫色で強調表示されます。
図2。 図10（c）とt 20の（d）のtはそれぞれ異なる時点での間質への毛細血管からの漏出、t 0の（a）は、t 5の （b）は、船舶（V）は、高信号線状構造体と見られている。注射（T 0）の前に、シグナルは間質（I）で見られない。徐々に、増強は、異常な腫瘍内皮障壁を介して蛍光造影剤の漏れに起因する間質に見られる。
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Discussion
腫瘍微小循環の研究は、腫瘍成長、播種および治療1への応答の病態生理学を理解する上で必要不可欠となっている。光学イメージングは、蛍光造影剤を用いて毛細血管を観察し、形態学的（機能的毛細血管密度）および機能（インデックス漏れ）のパラメータを定量化するために使用することができる技術の一つである。
我々は本研究で使用した蛍光顕微鏡イメージングは、利点および限界の両方を有する。一つの利点は、使用される造影剤のサイズを選択することができることである。ここでは、70kDaのFITC-デキストランと、実験開始時内皮障壁を通る漏れは、私たちは初期形態観察を可能にした、最小限であった（くねり、アナーキーネットワーク、等 。）との間に良好なコントラストが血管の血管および間質8、及び遅延の後、観察した20分かけて造影剤の漏出。面内（xY）の解像度は、私たちの代わりに、他のほとんどのイメージング技術（MRI、CT、超音波、PET ...）と同様に、巨視的レベルで、顕微鏡レベルで血管や間質を可視化するために可能にした、（3.5μm）で高かった。最後に、これは、発生した変化を観察することができることを意味し、リアルタイム画像である。
しかし、この技術には欠点がある。この装置は、動作するように繊細です。実際に、プローブは、非常に小さく（1.8 mm）で滑りであり、それは、長期間にわたって腫瘍上の同じ場所に滞在することは困難である。動物の呼吸の動きにも安定を損なう。これを改善するために、我々の位置にプローブを維持するために、プローブと手作りのサポートを固定化するために、超音波ゲルを使用した。さらに、我々は懸念を結果が得られたことを、腫瘍の唯一の最も表層を意味し、（100ミクロンから170ミクロンまで）は、腫瘍のうわべだけの領域を探索することができます。
主な制限、howeveR、光学イメージングを用いて絶対定量に達することが困難である。インデックス漏洩比、従って、唯一の半定量的なパラメータである。まず、ROIの中の部分volumingによるアーティファクトがあります。面内の分解能は高いが実際、z平面の解像度は、血管および間質の両方を含むことを意味する、（70μmのスライス厚）が低い。 10μmの直径を有する容器内の信号強度を測定する場合、したがって、それは、スライスに含まれる周囲の間質に平均化される。また、光学イメージングにおいて、信号強度および造影剤濃度との間の複合体の関係がある。組織が光子によって照射されると、多くのイベントが同時に発生し、収集された信号に影響を及ぼし得る。例えば、ヘモグロビンまたはコラーゲンのような励起または発光の光子を吸収することができる組織中の天然の発色団が存在する。いくつかの方向にある光子を分散させるいくつかの拡散もあります。最後に、漂白はおそらく1ですそれは濃度の信号の独立の損失を誘発するため、FITCを使用した最も重要な問題の。いくつかの研究グループは、光信号を定量化することに取り組んでいるが、これは複雑なモデル化9,10を意味する 。
最後に、長期的な研究が容易に実行されません。我々は、画像を取得するために、腫瘍を明らかにするために、皮膚を切開しなければならなかった、それが観察された臓器、体腔（ 例えば 、肝臓または腎臓）の深い場合は特に、切開をクローズアップすることは困難で証明することができる。
全体として、我々は、定量的共焦点蛍光ビデオ顕微鏡装置を用いて、毛細管の解剖学的構造および機能を特徴づけるためにダイナミック造影蛍光光学イメージング技術を開発した。この技術は、さらに検証を必要とするが、治療の前と後、又は腫瘍モデルとの間の腫瘍血管新生を比較するのに有用であり得る。
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Disclosures
我々は、開示することは何もありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Insulin serynge Myjector 1ml 29G |
Terumo Europe | BS-05M2913 | |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kDa | Sigma-Aldrich | 01619HH | 100 mg/mL diluted in saline |
| Fibered confocal videomicroscopy | Cellvizio - MaunaKea Technologies | ||
| Calibration and Cleaning Kit for LEICAFCM1000 | Leica Microsystems | LSU-488 | Store at 4 °C |
| Probe ProFlexTM Z | MaunaKea Technologies | ||
| Mosaicing software | MaunaKea Technologies | ||
| Vessel detection software | MaunaKea Technologies |
References
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