Summary
Neste artigo, apresentamos um método para analisar microvasos tumorais in vivo utilizando dinâmica com contraste de fluorescência videomicroscopia. Dois parâmetros quantitativos foram adquiridos: densidade capilar funcional refletindo a vascularização do tumor, e perdas de índice que reflete o vazamento de parede endotelial.
Abstract
Desfibrado de fluorescência confocal imagiologia in vivo com um feixe de fibras ópticas utiliza o mesmo princípio como microscopia confocal de fluorescência. Ele pode excitar fluorescente in situ elementos através das fibras ópticas, e depois gravar alguns dos fótons emitidos, através das mesmas fibras ópticas. A fonte de luz é um laser que emite luz de excitação através de um elemento no interior do feixe de fibras e como ele varre ao longo da amostra, uma recria a imagem de pixel por pixel. Como este tipo de exame é muito rápido, combinando-a com o software de processamento de imagem dedicada, imagens em tempo real com uma frequência de 12 quadros / s pode ser obtida.
Nós desenvolvemos uma técnica para caracterizar quantitativamente morfologia e função capilar, usando um dispositivo de fluorescência confocal videomicroscopia. O primeiro passo em nosso experimento foi gravar 5 filmes seg nos quatro quadrantes do tumor para visualizar a rede capilar. Todos os filmes foram processados usando o software (ImageCell, Mauna Kea Tecnologia, Paris, França) que realiza uma segmentação automatizado de vasos em torno de um diâmetro escolhido (10 mM em nosso caso). Assim, pode quantificar o 'densidade capilar funcional ", que é a relação entre a área total do vaso, e a área total da imagem. Este parâmetro é um marcador substituto para a densidade microvascular, geralmente mensurados usando ferramentas de patologia.
O segundo passo foi a gravar filmes do tumor ao longo de 20 min para quantificar a fuga do agente de contraste macromolecular através da parede capilar para o interstício. Ao medir a proporção de intensidade de sinal no interstício em relação à dos vasos, um "índice de fuga 'foi obtida, agindo como um marcador substituto para a permeabilidade capilar.
Introduction
A angiogénese é um processo complexo que envolve uma formação de novos vasos sanguíneos a partir de vasos pré-existentes. As alterações patológicas da microcirculação do tecido, composta de arteríolas, capilares, e vénulas, estão implicados numa vasta gama de doenças tais como o cancro, a inflamação, ou a diabetes. Portanto, é essencial para desenvolver métodos para avaliar quantitativamente a estrutura ea função microvascular. Imagem permite o estudo de microvasos em uma não-forma ou micro-invasivo, em tempo real e in vivo, e medidas repetidas ao longo do tempo no mesmo animal 2.
Atualmente, a dinâmica com contraste (DCE) de imagem 3 é comumente utilizado para avaliar a microcirculação do tecido. Imagem com contraste dinâmico é uma técnica que segue ao longo do tempo a biodistribuição de um traçador injetado por via intravenosa. A partir desta aquisição, parâmetros quantitativos podem ser extraídos refletindo vascularização do tecido. DCE imagemfoi o mais frequentemente usado com CT, ressonância magnética ou ultra-som. No entanto, essas técnicas de imagem não permitir a visualização directa dos microvasos, uma vez que a sua resolução, a não ser com a utilização de dispositivos experimentais específicas, na maioria das vezes permanece macroscópica.
Neste trabalho, propomos estudar a vasculatura do tumor na escala microscópica e in vivo utilizando imageamento óptico dinâmico com contraste, com fibered videomicroscopia confocal. Utilizou-se um agente de contraste macromolecular (FITC-dextrano) que permanece exclusivamente dentro de navios ou fugas através da barreira endotelial no interstício, de acordo com o seu peso molecular e as características do endotélio do tecido estudado 4. Isso permitiu que o estudo de ambos estrutura microvasos, delineando corretamente vasos e permeabilidade capilar, por vazamento e acumulando no interstício.
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Protocol
1. Preparação do Agente de Contraste
- Para FITC-dextrano 70 kDa, a dose injectada é de 500 mg / kg (10 mg de FITC-dextrano diluído em 0,1 ml de solução salina por um rato pesando 20 g).
- O agente não deve ser demasiado longo exposta à luz. Para evitar o branqueamento, é recomendado para cobrir o tubo com folha de alumínio.
2. Anestesia
- Os ratinhos foram anestesiados por uma injecção intraperitoneal de uma mistura de 1:4 de xilazina (Rompun 2%, Bayer, Puteaux, França) e cetamina (cetamina 500, Virbac, Carros, França), respectivamente, 66 mg / kg e 264 mg / kg para a 20 g mouse.
3. Preparação do órgão de interesse
- Nós rapado dos ratinhos no local de interesse (por exemplo, ao longo de um tumor subcutâneo). Pêlos é muitas vezes auto-fluorescente quando branco. Quando preto, que absorve a luz.
- A pele de frente para o órgão a ser trabalhada foi seccionada. É importante esperar até o bleeding parou antes de injetar o agente de contraste, caso contrário ele vai vazar no sangue e contaminam a imagem.
4. Aquisição
- O agente de contraste foi injectado através da veia jugular ou da veia caudal ou. Há pouca ou nenhuma sinal de fundo está no órgão observados na ausência de um agente de contraste fluorescente.
- A sonda foi colocada em frente do órgão a ser trabalhada. Em nosso estudo, este foi o tumor.
- O laser foi ligado para iluminar o tumor e ver a fluorescência nos vasos capilares.
- O tumor foi explorada manualmente movendo a sonda num movimento muito lento durante a gravação de visualizar a rede capilar. É importante manter uma mão firme, e essa técnica requer um pouco de experiência. Em nosso estudo, esta primeira etapa permitiu a quantificação da densidade capilar funcional.
- O segundo passo foi a aquisição dinâmica ao longo do tempo. Para este estudo, foi utilizado um 70 kDa FITC-dextrano. Não existe nenhuma fuga intersticial na maioria dos órgãos normais, mas existe em tumores. Para adquirir imagens do mesmo local ao longo do tempo (como no nosso caso), é importante a criação de um sistema para manter a sonda na área de interesse. Isto foi feito por meio de um suporte feito à mão para manter a sonda, e colocando um pouco de gel de ultra-som na ponta da sonda. Antes de gravar, foi passado para estabilizar a sonda colocada em contacto com o tumor. Uma vez que a posição foi assegurada, só havia movimento mínima devido a respiração do mouse. O laser foi ligado para gravar as imagens 3 a cada 30 seg durante 20 min para detectar a presença de extravasamento capilar. Ele foi desligado entre cada gravação para reduzir o agente de contraste de branqueamento.
- Na nossa experiência, os ratinhos foram sacrificados no final do procedimento para análise histológica de tumores.
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Representative Results
Com os dados recolhidos, podemos analisar quantitativamente diferentes parâmetros que refletem a microcirculação.
Foram estudados in vivo, a rede vascular periférica de um tumor do cólon implantadas em ratinhos Balb-C utilizando um sistema de fluorescência confocal videomicroscopia desfibrado (Cellvizio, Maunakea Tecnologia, Paris, França 2), após a injecção de um agente de contraste fluorescente macromolecular isotiocianato-dextrano ( FITC-dextrano) com um peso molecular de 70 kDa (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, França) e com excitação e emissão de comprimentos de onda de 488 nm e 520 nm, respectivamente (para compatibilidade com o sistema de imagem).
O primeiro passo na experiência foi o de gravar 5 sec filmes em cada um dos quatro quadrantes do tumor para visualizar a rede capilar. Esta amostragem representativa permitiu da vascularização do tumor. Todos os filmes foram processados usando um software (ImageCell, MaunaKea Tecnologia, Paris, França) que executa uma segmentação automatizado de vasos nas imagens em torno de um diâmetro escolhido (de 10 um, no nosso caso, o que incluiu os navios desde 5-20 um de diâmetro). Assim, pode quantificar o 'densidade capilar funcional' (FCD), que é a relação entre a área total do vaso, e a área total da imagem. Este parâmetro foi de um marcador de densidade microvascular, geralmente medido utilizando ferramentas de patologia. Figura 1 mostra um exemplo do tipo de imagens obtidos e o resultado da segmentação do navio. Neste exemplo, FCD foi medido como 36%.
Em seguida, três imagens foram registadas a cada 30 seg durante 20 min para detectar a presença de extravasamento capilar. O exame visual das imagens foi realizada pela primeira vez, para avaliar a presença ou a ausência de fuga de agente de contraste para dentro do interstício, como também a sua distribuição espacial (homogéneos ou heterogéneos).
Traçamos três regiões do int erest (ROI) nos capilares e três ROI no interstício em pontos de tempo 0, 5, 10 e 20 min. As intensidades de sinais (SI) nas três capilares diferentes e áreas intersticiais contíguos foram calculados em cada ponto de tempo. Vazamento Index (%) foi calculada da seguinte forma = Σ [(Ip1/Ii1) + (Ip2/Ii2) + (Ip3/Ii3)] x 100/3, onde Ip é perivascular (ou intersticial) intensidade e Ii é a intensidade intravascular 5 -7. Figura 2 mostra um exemplo de fuga de agente de contraste no interstício. Neste exemplo, o índice de fuga foi medido como 1,47.
Esta técnica de imagem óptico dinâmico com contraste permite que nas medições in vivo de microcirculação tumor. Ele reflete a arquitetura de vasos tumorais por meio da quantificação da densidade capilar e sua funcionalidade por meio da quantificação da permeabilidade capilar.
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Figura 1. À esquerda:. Imagem de microvasos na camada superficial do tumor direita: aplicação do módulo de detecção de navio para automaticamente vasos segmento com diâmetros que variam 5-20 mM (diâmetro de interesse: 10 mm). Os vasos segmentados são destacadas em roxo.
Figura 2. Fuga dos capilares para o interstício, em diferentes pontos no tempo, respectivamente, t 0 (a), t 5 (b), 10 t (c) e 20 t (d) Os vasos (v). São vistas estruturas lineares de sinal de alta. Antes da injecção (T 0), o sinal não é visto no interstício (I). Progressivamente, um acessório pode ser visto no interstício devido a uma fuga do agente de contraste fluorescente através da barreira do endotélio do tumor anormais.
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Discussion
O estudo da microcirculação tumor tornou-se essencial para a compreensão da fisiopatologia do crescimento do tumor, disseminação e resposta à terapia 1. A imagem óptica é uma das técnicas que podem ser utilizadas para observar os vasos capilares, utilizando um agente de contraste fluorescente e para quantificar morfológica (Densidade capilar funcional) e de fuga (índice) parâmetros funcionais.
A microscopia de fluorescência de imagem foram utilizados neste estudo tem vantagens e limites. Uma vantagem é a possibilidade de escolher o tamanho do agente de contraste utilizado. Aqui, com 70-kDa FITC-dextrano, o vazamento através da barreira endotelial, no início do experimento foi mínima, o que permitiu observar a morfologia inicial (tortuosidade, rede anárquica, etc.) Dos vasos com um bom contraste entre vasos e interstício 8, e depois de um atraso, uma fuga do agente de contraste ao longo de 20 minutos de observação. A in-plane (xy) resolução foi alta (3,5 mm), o que nos permitiu visualizar os vasos e no interstício em um nível microscópico, em vez de um nível macroscópico como a maioria das outras técnicas de imagem (ressonância magnética, tomografia computadorizada, ultra-som, PET ...). Finalmente, esta é a imagem em tempo real, o que significa que as mudanças podem ser observadas à medida que ocorrem.
No entanto, existem desvantagens para esta técnica. O aparelho é delicada para operar. De facto, a sonda é muito pequena (1,8 mm) e escorregadia e é difícil de ficar no mesmo lugar em que o tumor durante longos períodos de tempo. Movimentos de respiração do animal também comprometer estabilidade. Para melhorar isso, foi utilizado gel de ultra-som para imobilizar a sonda e um suporte artesanal para manter a sonda na posição. Além disso, pode explorar apenas a área superficial do tumor (a partir de 100 um a 170 um), o que significa que os resultados obtidos dizem respeito apenas às camadas mais superficiais do tumor.
O limite principal, however, é a dificuldade em chegar a quantificação absoluta usando imagens ópticas. Índice de vazamento é uma relação, e, por conseguinte, apenas um parâmetro semi-quantitativa. Em primeiro lugar, existem artefactos devido a voluming parcial na ROI. Com efeito, embora a resolução no plano é alta, a resolução do plano z é baixo (espessura de fatia de 70 mm), o que significa que inclui ambos os vasos e interstício. Portanto, quando se mede a intensidade do sinal num recipiente com um diâmetro de 10 um, que é feita a média com o interstício circundante incluída na fatia. Além disso, em imagiologia óptica, há uma relação entre a intensidade do sinal complexo e concentração de agente de contraste. Quando um tecido é iluminado por fotões, muitos eventos podem ocorrer simultaneamente, e influenciam o sinal recolhido. Existem cromóforos naturais em tecidos que podem absorver de excitação ou de emissão de fotões, tais como a hemoglobina, ou colagénio. Há também alguma difusão que dispersa fótons em várias direções. Finalmente, o branqueamento é, provavelmente, umdas questões mais importantes quando se utiliza FITC, porque induz uma perda de sinal independente da concentração. Vários grupos de pesquisa estão trabalhando para quantificar o sinal óptico, mas isso implica uma 9,10 modelização complexa.
Finalmente, os estudos longitudinais não são facilmente realizadas. Tivemos que inciso a pele para revelar o tumor, a fim de adquirir as imagens, e pode ser difícil para fechar a incisão, principalmente quando o órgão observado é profundo na cavidade do corpo (por exemplo, fígado ou rins).
No geral, foi desenvolvida uma fluorescência com contraste técnica de imagem óptico dinâmico para caracterizar quantitativamente a anatomia e função capilar, usando um dispositivo de fluorescência confocal videomicroscopia. Esta técnica requer uma validação adicional, mas pode ser útil para a comparação da vascularização do tumor, antes e após a terapia, ou de entre os modelos de tumor.
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Disclosures
Não temos nada a divulgar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Insulin serynge Myjector 1ml 29G |
Terumo Europe | BS-05M2913 | |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kDa | Sigma-Aldrich | 01619HH | 100 mg/mL diluted in saline |
| Fibered confocal videomicroscopy | Cellvizio - MaunaKea Technologies | ||
| Calibration and Cleaning Kit for LEICAFCM1000 | Leica Microsystems | LSU-488 | Store at 4 °C |
| Probe ProFlexTM Z | MaunaKea Technologies | ||
| Mosaicing software | MaunaKea Technologies | ||
| Vessel detection software | MaunaKea Technologies |
References
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- Laemmel, E., Genet, M., Le Goualher, G., Perchant, A., Le Gargasson, J. F., Vicaut, E. Fibered confocal fluorescence microscopy (Cell-viZio) facilitates extended imaging in the field of microcirculation. A comparison with intravital microscopy. J Vasc Res. 41 (5), 400-411 (2004).
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