Summary
I denne artikkelen presenterer vi en metode for å analysere kreft microvessels in vivo ved hjelp av dynamisk kontrast forbedret fluorescens videomicroscopy. To kvantitative parametre ble kjøpt: funksjonell kapillærtetthet reflekterer vaskulariteten av svulsten, og indeksen lekkasje reflekterer leakiness av endothelial veggen.
Abstract
Fibered konfokal fluorescens in vivo imaging med en fiberoptisk bunt er det samme prinsippet som fluorescerende konfokal mikroskopi. Det kan eksitere fluorescerende in situ elementene gjennom de optiske fibre, og så ta opp noen av de utsendte fotoner, via de samme optiske fiber. Lyskilden er en laser som sender ekssitering av lys gjennom et element inne i fiberbunten, og som skanner over prøven, gjenskaper et bilde piksel for piksel. Som denne skanningen er veldig fort, ved å kombinere den med dedikert programvare for bildebehandling, kan bilder i sanntid med en frekvens på 12 bilder / sek oppnås.
Vi utviklet en teknikk for å kvantitativt karakter kapillær morfologi og funksjon, ved hjelp av en confocal fluorescens videomicroscopy enhet. Det første trinnet i eksperimentet vårt var å spille inn 5 sek filmer i de fire kvadrantene av svulsten for å visualisere kapillær nettverk. Alle filmene ble behandlet ved hjelp av programvare (jegmageCell, Mauna Kea Technology, Paris Frankrike) som utfører en automatisk segmentering av fartøyer rundt en valgt diameter (10 mikrometer i vårt tilfelle). Dermed kan vi kvantifisere "funksjonelle kapillære tetthet", som er forholdet mellom det totale fartøy området og det totale areal av bildet. Denne parameteren var en surrogatmarkør for mikrovaskulær tetthet, vanligvis målt ved hjelp av patologi verktøy.
Det andre trinn var å ta opp film av svulsten løpet av 20 min for å kvantifisere lekkasje av det makromolekylære kontrastmiddel gjennom kapillære vegg inn i interstitium. Ved å måle forholdet mellom signalintensitet i interstitium over det i skipene, ble en 'index lekkasje' innhentet, fungerer som en surrogatmarkør for kapillær permeabilitet.
Introduction
Angiogenese er en kompleks prosess som involverer en dannelse av nye blodkar fra pre-eksisterende fartøyer. Patologiske endringer i mikrosirkulasjon vev, bestående av arterioler, kapillærer og venules, er innblandet i et stort utvalg av sykdommer så som kreft, inflammasjon, eller diabetes. Det er derfor viktig å utvikle metoder for å kvantitativt vurdere microvessel struktur og funksjon. Imaging muliggjør studium av microvessels i et ikke-eller mikro-invasiv måte, i sanntid, og in vivo, og repeterte målinger over tid i samme dyr 2..
Foreløpig er dynamisk kontrastforsterket (DCE) avbildning 3 vanligvis brukes til å vurdere vev mikrosirkulasjonen. Dynamisk kontrastforsterket avbildning er en teknikk som følger over tid på biodistribusjonen av en tracer injiseres intravenøst. Fra dette oppkjøpet, kan kvantitative parametre hentes ut reflekterende vev vascularization. DCE bildebehandlinghar blitt oftest brukes med CT, MR eller ultralyd. Men disse avbildningsteknikker ikke tillater direkte visning av microvessels, siden deres oppløsning, annet enn ved bruk av spesifikke eksperimentelle enheter, forblir oftest makroskopisk.
I denne artikkelen foreslår vi å studere tumor blodkar på mikroskopisk skala og in vivo ved hjelp av dynamisk kontrast forbedret optisk bildebehandling, med fibered confocal videomicroscopy. Vi brukte et makromolekylært kontrastmiddel (FITC-dekstran) som forblir utelukkende innenfor fartøy eller lekkasjer gjennom endoteliale barrierer i interstitium, i henhold til molekylvekten og egenskapene til endotelet av vev undersøkt 4.. Dette tillot studiet av både microvessel struktur, ved riktig opptegning fartøy, og kapillær permeabilitet, ved lekker og akkumuleres i interstitium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Utarbeidelse av kontrastmiddel
- For FITC-dekstran 70 kDa, er dosen injisert 500 mg / kg (10 mg av FITC-dekstran fortynnet i 0,1 ml saltløsning for en mus som veier 20 g).
- Midlet bør ikke utsettes for lenge for lys. For å unngå bleking, er det anbefalt å dekke røret med aluminiumsfolie.
2. Anestesi
- Mus ble bedøvd med en intraperitoneal injeksjon av en blanding av 01:04 av xylazin (Rompun 2%, Bayer, Puteaux, Frankrike) og ketamin (ketamin 500, Virbac, Carros, Frankrike), med henholdsvis 66 mg / kg og 264 mg / kg for en 20 g mus.
Tre. Forberedelse av Organ of Interest
- Vi barberte mus på stedet av interesse (for eksempel over en subkutan tumor). Animal hår er ofte auto-fluorescerende når hvit. Når svart, absorberer det lys.
- Huden som vender mot det organ som skal avbildes ble radert. Det er viktig å vente til bleeding har stoppet før injeksjon av kontrastmidlet, ellers vil det lekke i blodet og forurense bildet.
4. Oppkjøp
- Den kontrastmiddel ble injisert med enten den jugulare vene eller halevenen. Det er ingen eller liten bakgrunn signal i organet observert i fravær av et fluorescerende kontrastmiddel.
- Proben ble plassert i front av det organ som skal avbildes. I vår studie, dette var svulsten.
- Laseren ble slått på for å lyse tumor og se fluorescensen i kapillærene.
- Svulsten ble utforsket manuelt ved å flytte sonden i en svært langsom bevegelse under opptak for å visualisere kapillær nettverk. Det er viktig å opprettholde en stødig hånd, og denne teknikken krever litt erfaring. I vår studie, denne første trinnet tillatt kvantifisering av funksjonelle kapillær tetthet.
- Det andre trinnet var den dynamiske anskaffelse over tid. For denne studien brukte vi en 70 kDa FITC-dekstran. Det er ingen interstitiell lekkasje i de fleste normale organer, men det er i tumorer. For å skaffe bilder av det samme sted over tid (som i vårt tilfelle), er det viktig å etablere et system for å holde sonden i området av interesse. Dette ble gjort ved hjelp av en håndstøtte for å holde sonden, og ved å plassere en bit av en gel på spissen av sonden. Før registrering, ble tiden som brukes for å stabilisere sonden plassert i kontakt med tumoren. Når posisjonen er sikret, var det bare minimal bevegelse på grunn av musens pusting. Laseren ble slått på for å registrere tre bilder hver 30 sek til 20 min for å detektere tilstedeværelsen av kapillær lekkasje. Den ble slått av mellom hvert opptak for å redusere kontrastmiddel bleking.
- I vårt eksperiment ble musene avlivet ved slutten av fremgangsmåten for histologisk analyse av tumorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av data samlet inn, kunne vi kvantitativt analysere ulike parametre som reflekterer mikrosirkulasjonen.
Vi har studert in vivo på perifere vaskulære nettverk av et kolon tumor implantert i balb-c mus ved hjelp av en fibered confocal fluorescens videomicroscopy system (Cellvizio, Maunakea Technology, Paris, Frankrike 2), etter injeksjon av et makromolekylært fluorescerende kontrastmiddel Fluorescein isotiocyanat-dekstran ( FITC-dekstran) med en molekylvekt på 70 kDa (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, Frankrike) og med eksitasjons-og emisjonsbølgelengder på 488 nm og 520 nm på henholdsvis (for kompatibilitet med vår avbildningssystem).
Det første trinnet i vårt eksperiment var å ta opp 5 sek filmer i hver av de fire kvadrantene i svulsten til å visualisere det kapillære nettverk. Dette tillot representativ prøvetaking av svulsten vascularization. Alle filmene ble behandlet ved hjelp av en programvare (ImageCell, MaunaKea Technology, Paris Frankrike) utfører en automatisert segmentering av skip i bildene rundt en valgt diameter (10 mikrometer i vårt tilfelle, som inkluderte fartøy som spenner 5-20 mikrometer i diameter). Dermed kan vi kvantifisere "funksjonelle kapillære tetthet" (FCD), som er forholdet mellom det totale fartøy området og det totale areal av bildet. Denne parameteren var en surrogatmarkør av mikrovaskulær tetthet, vanligvis målt ved hjelp av patologi verktøy. Figur 1 viser et eksempel på den type bilder innhentet og resultatet av fartøy segmentering. I dette eksempel ble FCD målt som 36%.
Deretter ble tre bilder registrert hvert 30 sek til 20 min for å detektere tilstedeværelsen av kapillær lekkasje. En visuell undersøkelse av bildene ble først utført for å evaluere fravær eller nærvær av kontrastmiddel lekkasje inn i interstitium så vel som dens romlige fordeling (homogene eller heterogene).
Vi trakk tre regioner av int erest (ROI) i kapillærene og tre ROI i interstitium på tidspunkter 0, 5, 10 og 20 min. Signal intensiteter (SI) i løpet av de tre forskjellige blodkar og sammenhengende interstitiale områder ble midlet ved hvert tidspunkt. Indekslekkasje (%) ble beregnet som følger = Σ [(Ip1/Ii1) + (Ip2/Ii2) + (Ip3/Ii3)] x 100/3, hvor Ip er perivaskulær (eller interstitiell) intensitet og II er intra intensitet 5 -7. Figur 2 viser et eksempel på kontrastmiddel lekkasje i interstitium. I dette eksempel ble indeks lekkasje målt som 1,47.
Denne dynamiske kontrast forbedret optisk avbildningsteknikk tillater in vivo målinger av tumor mikrosirkulasjon. Det gjenspeiler arkitekturen av tumor fartøy ved å tallfeste kapillær tetthet, og deres funksjonalitet ved å tallfeste kapillær permeabilitet.
g "/>
Figur 1. Venstre:. Bilde av microvessels i det overflatiske lag av svulsten Høyre: anvendelse av fartøyet deteksjonsmodul til automatisk segment fartøy med diametre 5-20 mikrometer (diameter av interesse: 10 mikrometer). De segmenterte fartøyene er markert med rødt.
Figur 2. Lekkasje fra kapillærene til interstitium ved forskjellige tidspunkter, henholdsvis t 0 (a) t 5 (b), t 10 (c), og 20 t (d). Fartøy (V) blir betraktet som høyt signal lineære strukturer. Før injeksjon (t 0), blir ikke noe signal sett i interstitium (I). Gradvis, kan en forbedring sees i interstitium på grunn av lekkasje av det fluorescerende kontrastmiddel gjennom den unormale tumor endotelisk barriere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Studiet av svulst mikrosirkulasjonen har blitt viktig i forståelsen av patofysiologien av tumorvekst, formidling og respons på behandling en. Optisk avbildning er en av teknikkene som kan anvendes til å observere kapillarene ved hjelp av en fluoriserende kontrastmiddel og for å kvantifisere morfologisk (Functional Capillary Density) og funksjonelle (index lekkasje) parametere.
Fluorescens mikroskopi bildebehandling vi brukt i denne studien har både fordeler og begrensninger. En fordel er å kunne velge størrelsen på kontrastmidlet benyttes. Her, med en 70-kDa FITC-dekstran, lekkasje gjennom endoteliale barrierer ved begynnelsen av eksperimentet var minimal, noe som tillot oss å observere den opprinnelige morfologi (tortuosity, anarkisk nettverk, etc.) Av skipene med en god kontrast mellom fartøy og interstitium 8, og etter en forsinkelse, en lekkasje av kontrastmiddelet løpet av 20 min for observasjon. Den in-planet (xy) oppløsning var høy (3,5 mikrometer), som tillater oss å visualisere fartøyene og interstitium på et mikroskopisk nivå, i stedet for en makroskopisk nivå som med de fleste andre bildeteknikker (MR, CT, ultralyd, PET ...). Endelig er denne sanntids avbildning, noe som innebærer at endringer kan observeres etter hvert som de forekommer.
Men det er ulemper med denne teknikken. Anordningen er delikat å betjene. Faktisk, er sonden meget liten (1,8 mm) og glatte, og det er vanskelig å holde seg på samme sted på tumor over lange tidsperioder. Dyrets pustebevegelser også kompromiss stødighet. For å forbedre dette har vi brukt på en gel for å immobilisere sonden og en håndstøtte for å holde sonden i stilling. Videre kan vi utforske bare overfladisk område av tumor (fra 100 mikrometer til 170 mikrometer), som betyr at de oppnådde resultater bekymring bare de mest overfladiske lag av tumoren.
Den viktigste grensen, however, er vanskeligheten i å nå absolutt kvantifisering ved hjelp av optisk avbildning. Indeks lekkasje er et forhold, og derfor bare en semi-kvantitativ parameter. Først er det gjenstander som skyldes delvis voluming i ROI. Faktisk, selv om den in-planet oppløsning er høy, er z-planet oppløsning lav (skivetykkelse på 70 mikrometer), som betyr at det inneholder både skip og interstitium. Derfor, ved å måle signalintensiteten i et fartøy med et 10 mikrometer i diameter, er det i gjennomsnitt med det omkringliggende interstitium inkludert i snitt. Også i optisk avbildning, er det en kompleks sammenheng mellom signalintensitet og kontrast middelkonsentrasjon. Når et vev er opplyst av fotoner, kan mange hendelser inntreffer samtidig og påvirke signalet oppsamlet. Det er naturlige kromoforer i vev som kan absorbere magnetisering eller utslipps fotoner som hemoglobin eller kollagen. Det er også noe spredning som sprer fotoner i flere retninger. Til slutt, er bleking trolig enav de viktigste spørsmålene når du bruker FITC, fordi det fremkaller et tap av signal uavhengig av konsentrasjon. Flere forskningsgrupper jobber med å kvantifisere den optiske signalet, men dette innebærer en kompleks modelization 9,10.
Endelig er langsgående studier ikke lett utføres. Vi måtte incise huden til å avsløre svulsten for å skaffe bildene, og det kan vise seg vanskelig å lukke opp snittet, særlig når orgelet observert er dypt inne i kroppens hulrom (f.eks lever eller nyre).
Totalt har vi utviklet et dynamisk kontrastforsterket fluorescens optiske avbildningsteknikk til kvantitativt karakter kapillær anatomi og funksjon, ved hjelp av en confocal fluorescens videomicroscopy enhet. Denne teknikken krever ytterligere validering, men kan være nyttig for å sammenligne tumor vaskularisering før og etter behandlingen, eller mellom tumormodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Insulin serynge Myjector 1ml 29G |
Terumo Europe | BS-05M2913 | |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kDa | Sigma-Aldrich | 01619HH | 100 mg/mL diluted in saline |
| Fibered confocal videomicroscopy | Cellvizio - MaunaKea Technologies | ||
| Calibration and Cleaning Kit for LEICAFCM1000 | Leica Microsystems | LSU-488 | Store at 4 °C |
| Probe ProFlexTM Z | MaunaKea Technologies | ||
| Mosaicing software | MaunaKea Technologies | ||
| Vessel detection software | MaunaKea Technologies |
References
- Folkman, J.
- Laemmel, E., Genet, M., Le Goualher, G., Perchant, A., Le Gargasson, J. F., Vicaut, E. Fibered confocal fluorescence microscopy (Cell-viZio) facilitates extended imaging in the field of microcirculation. A comparison with intravital microscopy. J Vasc Res. 41 (5), 400-411 (2004).
- Charnley, N., Donaldson, S., Price, P.
- Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Taillieu, F., Cuenod, C., Siauve, N., Clement, O. Dynamic contrast enhanced optical imaging of capillary leakage. Technol Cancer Res Treat. 10 (1), 49-57 (2011).
- Kurose, I., Kubes, P., Wolf, R., Anderson, D. C., Paulson, J., Miyasaka, M., Granger, D. N. Inhibition of nitric oxide production. Mechanisms of vascular albumin leakage. Circ Res. 73 (1), 164-171 (1993).
- Faye, N. F. L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. Macromolecular capillary leakage is involved in the onset of anaphylactic hypotension. Anesthesiology. , (2012).
- Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. Macromolecular Capillary Leakage Is Involved in the Onset of Anaphylactic Hypotension. Anesthesiology. 117 (5), 1072-1079 (2012).
- Tozer, G. M., Kanthou, C., Baguley, B. C.
- Ntziachristos, V., Schellenberger, E. A., Ripoll, J., Yessayan, D., Graves, E., Bogdanov, A., Josephson, L., Weissleder, R. Visualization of antitumor treatment by means of fluorescence molecular tomography with an annexin V-Cy5.5 conjugate. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (33), 12294-12299 (2004).
- Cuccia, D. J., Bevilacqua, F., Durkin, A. J., Merritt, S., Tromberg, B. J., Gulsen, G., Yu, H., Wang, J., Nalcioglu, O. In vivo quantification of optical contrast agent dynamics in rat tumors by use of diffuse optical spectroscopy with magnetic resonance imaging coregistration. Appl Opt. 42 (16), 2940-2950 (2003).
