Summary
نحن تصف نماذج من إصابة الكلى نقص التروية-ضخه التي يسببها المعتدلة والشديدة والتي الفئران الخضوع من جانب واحد الكلوي عنيق لقط تليها في وقت واحد أو تأخر استئصال الكلية المقابل، على التوالي. هذه النماذج تعطي باستمرار يؤدي إلى الفشل الكلوي وتليف بعد الاصابه، ولكن شدة الإصابة والبقاء على قيد الحياة تعتمد على خلفية والعمر والمعدات الجراحية الماوس.
Abstract
يستخدم نقص التروية-ضخه يسببها إصابة الكلى الحاد (IR-آكي) على نطاق واسع كنموذج للآكي في الفئران، ولكن النتائج غالبا ما تكون متغير تماما مع معدلات وفيات عالية، وغالبا ما يتم الإبلاغ عنها والتي قد تربك التحليلات. يستخدم الثنائية الكلوي تحامل عنيق عادة للحث على IR-آكي، لكن الخلافات بين الضغوط المشبك الفعالة و / أو استجابات الكلوي إلى نقص تروية الكلى بين غالبا ما تؤدي إلى نتائج أكثر متغير. وبالإضافة إلى ذلك، ومن المعروف مرات المشبك أقصر للحث على إصابة أنبوبي أكثر متغير، وبينما الفئران التي تمر الإصابة الثنائية مع أوقات المشبك يعد تطوير أنبوبي إصابة أكثر اتساقا، فإنهم غالبا ما يموت في غضون أول 3 أيام بعد الإصابة بسبب قصور كلوي حاد. لتحسين البقاء على قيد الحياة بعد الإصابة والحصول على نتائج أكثر اتساقا ويمكن التنبؤ بها، وقد وضعنا نموذجين من جانب واحد إصابة نقص التروية-ضخه تليها استئصال الكلية المقابل. يتم تنفيذ كل العمليات الجراحية باستخدام نهج الظهرية، والحد من الإجهاد الجراحية الناتجة جمعةROM البطن بطني، وتستخدم عادة لجراحات IR-آكي الماوس. لتحريض إصابة BALB / ج الفئران معتدلة الخضوع من جانب واحد لقط من عنيق الكلوي لمدة 26 دقيقة، والخضوع أيضا استئصال الكلية المقابل في وقت واحد. باستخدام هذا النهج، 50-60٪ من الفئران تطوير معتدلة آكي 24 ساعة بعد الاصابة لكن 90-100٪ من الفئران البقاء على قيد الحياة. للحث على آكي أكثر شدة، والفئران BALB / ج الخضوع عنيق الكلوي لقط لمدة 30 دقيقة تليها استئصال الكلية المقابل بعد 8 أيام الإصابة. وهذا يسمح التقييم الوظيفي للانتعاش الكلوي بعد الإصابة مع بقاء 90-100٪. الضرر أنبوبي بعد الإصابة في وقت مبكر، فضلا عن إصابة آخر التليف هي متسقة للغاية باستخدام هذا النموذج.
Introduction
وقد وضعت مجموعة متنوعة من نماذج تجريبية من إصابة الكلى الحاد (آكي) لتتناسب مع تنوع وتعقيد حالة الإنسان (انظر المرجع لمراجعة حديثة وشاملة 1). كل من هذه النماذج لديه نقاط قوته ونقاط الضعف، وحين يحاكي كل الظروف الإنسانية ذات الصلة مع الكفاءات المتنوعة، لا شيء نموذج بالضبط الفيزيولوجيا المرضية لنظرائهم الإنسان. وقد تم تطوير ضخه نقص التروية (IR) التي يسببها آكي كنموذج للإصابة الكلى نقص التروية الحادة التي يسببها في القوارض. بينما نادرا ما لوحظ من شدة الإصابة أنبوبي كلوي ينظر في هذا النموذج في المرضى الذين يعانون من إصابات نقص انسياب الدم الكلوي 2، على الرغم من قصوره وإلى حد كبير بسبب طبيعة استنساخه نسبيا من هذا الطراز، وفرت الاستخدام الواسع النطاق، ومن المتوقع، وسوف تستمر لتوفير معلومات هامة عن العديد من الآليات المشتركة الأساسية للآكي، والإصلاح، والعلاج 3. جراحة IR يتطلب فامiliarity مع تشريح الكلى الماوس، الذي قمنا موضح في شكل مبسط في الشكل 1. لا يمكن أن يؤديها الكلوي نقص التروية-ضخه (IR) لعملية جراحية إصابة عن طريق النهج بطني (البطن) أو الظهرية (خلف الصفاق). ونحن نستخدم منهج ظهري لأنه هو أقل من صدمة، والسماح أوقات الانتعاش بشكل أسرع وتحسين البقاء على قيد الحياة (وخاصة عند أول تعلم الإجراء). لا يمكن أن يؤديها الكلوي إصابة IR أحاديا أو ثنائيا. ومع ذلك، فإن الاختلافات بين الضغوط فعالة المشبك (التي قد تنجم عن مداخلة من الدهون محيط بالنقير بين فكي المشبك) و / أو الفروق في استجابات الكلوي إلى نقص التروية بين الجانبين يؤدي إلى نتائج أكثر متغير. في حين أن هذا ليس مشكلة مستعصية على الحل، فإنه يمكن زيادة التباين بين التجارب، التي هي قضية رئيسية لهذا النموذج. الأشعة تحت الحمراء من جانب واحد لا يمكن أن يؤديها مع استئصال الكلية مضاد الوحشي. هذا هو أسلوب لدينا من خيار لأنه يقلل من التباين في لقط بين السويقات، والعمل في الوقت نفسه علىllows واحد لتقييم وظائف الكلى، والتي لا تتأثر مع الأشعة تحت الحمراء من جانب واحد وحده. كان هناك نقاش حول ما هي الطريقة الأكثر عملية مقابل المثلى لتقييم وظائف الكلى في الفئران. الدم واليوريا والنيتروجين (بون) يوفر قدرا من وظيفة الكلى وغير مفيد "أول نظرة" علامة في بعض النماذج من آكي، بما في ذلك الضرر الأشعة تحت الحمراء. ومع ذلك، يمكن أن تتأثر مستويات BUN حسب الحالة حجم الفئران التي قد تتأثر، لا سيما في أعقاب نهج بطني إصابة الأشعة تحت الحمراء، عندما يقلل تأخر الانتعاش تناول عن طريق الفم من السوائل لعدة أيام بعد الجراحة. وأقل تأثرا مصل الكرياتينين حسب حالة الماء ولكن يتأثر بشكل واضح من قبل كتلة العضلات. كان واحدا من الصعوبات مع قياسات كرياتينين المصل مشاكل مع الكشف عن chromogens غير الكرياتينين في مصل الفأر باستخدام التقنيات المعتمدة حامض البكريك. وكبديل لذلك، قد وضعت عددا من المراكز إلى أسلوب يعتمد على HPLC لتحديد الكرياتينين الماوس أن لا يتأثر هذا قطعة أثرية 4. ومع ذلك، UNLآيك BUN والكرياتينين البكريك حمض المقايسات، والتي تتطلب فقط 5-10 ميكرولتر من المصل، HPLC-فحوصات تتطلب ~ 25 ميكرولتر مصل في الفحص، التي إذا أجريت في مكررة سيتطلب ~ 100 ميكرولتر من الدم الكامل لكل مقايسة. هذا يمكن أن تكون مقيدة للدراسات الماوس. وقد وضعت بعض المراكز القائمة على الطيف HPLC وقداس طرق أكثر حساسية التي تسمح تحليل عينة أصغر حجم 5، 6. ومع ذلك، هذه التقنيات ليست متاحة على نطاق واسع. وقد تم تقييم بديل، مقايسة تتالي الأنزيمية (الذي يتطلب فقط ميكرولتر 5-10 من المصل) في الفأر والجرذ عينات المصل وأظهرت وثيقة موازية قياسات HPLC من الكرياتينين في مصل الدم في حين فحوصات حمض البكريك دائما القيم الكرياتينين المبالغة في تقدير 7. في حين لا يستخدم على نطاق واسع هذا الاختبار في الأدب آكي، الفحص متاح تجاريا، وسهلة الاستخدام، ونجد يعطي نتائج يمكن الاعتماد عليها مع هذا النموذج من الأشعة تحت الحمراء التي يسببها آكي في الفئران.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
- الأوتوكلاف جميع الأدوات الجراحية قبل الجراحة. لاحظ أنه إذا واحد هو إجراء جراحات متعددة على الفئران مختلفة، وشطف الأدوات بعد استخدامها ومن ثم تعقيم باستخدام معقم حبة ساخنة. انها ليست كافية لنقع في الايثانول 70٪.
- إعطاء 0.5 مل S / C ملحي معقم قبل الجراحة وبعد العمل الجراحي فورا للتعويض عن فقدان السوائل في الجسم أثناء الجراحة.
- وزن الفئران.
- تخدير الماوس باستخدام زيلازين IP / خليط الكيتامين. وعادة ما يستغرق 3-5 دقيقة للفئران للوصول الجراحية التخدير الطائرة.
- يحلق موقع الجراحية مع منطقة الحدود بما فيه الكفاية للحفاظ على الشعر من تلويث موقع شق. هذا يحتاج إلى أن يؤديها في منطقة التحضيرية، حيث لا يتم إجراء الجراحة.
- تطبيق مرهم التشحيم العيون للعيون لمنع جفاف أثناء العملية.
- ضع الماوس عرضة على سطح ساخن مع تغطية وسادة مقعد ماصة. الساقين الشريط إلى سطح الجراحية.
- في حالة استخدامنظام حمام مائي، تعيين الحرارة عند 38 درجة مئوية 1 ساعة قبل الجراحة.
- إعداد العقيم باستخدام بتدين حل مسحة عصا: فرك من وسط الموقع نحو محيط 3X، في كل مرة تليها الغسل مع Nolvasan لإزالة بتدين. يجب إزالة جميع بتدين من الميدان الجراحية قبل شق من قبل الشطف مع Nolvasan. قبل البدء في إجراء قفازات معقمة يجب أن يتم تغيير لتكون عقيمة.
- تغطية الجراحي الميداني مع ثنى الجراحية المعقمة. سيمنع هذا الشعر طائشة من دخول الميدان الجراحية وتوفير مساحة على أساسها وضع أدوات معقمة أثناء الجراحة.
- جس الموقع الكلى عن طريق الجلد.
- قطع الجلد على طول خط الوسط الظهرية من الماوس (حوالي 1.5 سم) باستخدام المقص والملقط.
- الجلد منفصلة وطبقات تحت الجلد على جانبي ظهري اليسار واليمين من خلال هذا الشق من قبل تشريح حادة باستخدام مقص وملقط.
- إجراء شق صغير من خلال FL الحقعنخ العضلات واللفافة فوق الكلى والداخل للظاهر الكلية اليمنى.
- تشريح بعناية القطبين العلوي والسفلي في الكلى خالية من الأنسجة المحيطة. لاحظ أن الأنسجة الدهنية من جميع أنحاء القطب العلوي يحتوي على الغدة الكظرية تحمل إمدادات الدم الخاصة بها والتي يمكن دفع قبالة الكلى ولكن من الواضح أنه لا ينبغي إزالتها من الماوس (الشكل 1). بعد تحرير الكلى من الأنسجة المحيطة بها، وربط خياطة الحرير 4-0 حول نقير من الكلية اليمنى باستخدام عقدة الجراحية المزدوجة. ترك واحدة من نهاية خياطة ~ 2 في لونغ لتصمد في الكلى كما كنت القطع البعيدة إلى عقدة حتى تتمكن من تصور أن يكون قطعت الموقع. ري جدعة مع ملحي معقم.
- إغلاق طبقة العضلات باستخدام خياطة للامتصاص.
- إجراء شق صغير من خلال العضلات الجهة اليسرى واللفافة فوق الكلى والداخل للظاهر الكلية اليسرى (الشكل 2A).
- عقد بعناية الكلى باستخدام ملقط حادة حين الإفراج الكلويعنيق من الأنسجة المحيطة الدهون باستخدام ملقط (أرقام 2B-2F). الكثير من الضغط على الكلى باستخدام ملقط حادة قد تسبب الإصابة الكلوية وبالتالي يحتاج المرء أن نتذكر هذا عند تصميم الضوابط "الشام" للدراسات. إذا وجدت أن الضوابط الشام الخاص على تطوير الإصابة الكلوية (كما يتضح من ارتفاع في الكرياتينين في مصل الدم)، وهي طريقة بديلة قد تفكر في الإفراج عن الأنسجة الدهنية المحيطة من عنيق الكلوي هو للفة بلطف الأنسجة بمحلول ملحي معقم غارقة القطن مسحات الرؤوس. في تجربتنا وإلى حد ما تعلق الدهون بإحكام على عنيق الكلوي وأنه لا يمكن بسهولة إزالة مع مسحات القطن، وحتى هذا قد لا يكون النهج الأول كنت تريد استخدامها. ومع ذلك، مثل جوانب أخرى من هذا النموذج، وهذا هو الشيء الذي سيكون لديك لإنشاء لنفسك مع الممارسة والخبرة.
- المشبك ترك الكلوي عنيق باستخدام المشبك الأوعية الدموية غير المؤلمة باستخدام ملقط عقد (لتسهيل وضع المشبك)، استخدم الموقت لمختلف CLAمرات النائب اعتمادا على سلالة الماوس وشدة الإصابة المطلوبة (انظر الجدول 1).
- تغطية الكلية اليسرى مع الجلد (الشكل 2H).
- تغطية شق الجلد مع الشاش غارقة المالحة.
- الداخل للظاهر الكلى، تأكد من مظهر داكن موحدة والإفراج عن المشبك بعد العصر المشار إليه، وتؤكد أن مظهر داكن يعكس بشكل موحد في جميع أنحاء الكلى (الشكل 2I / G). إذا لم يكن بسرعة وبشكل موحد إعادة يروي (حتى الوردي) ينبغي استبعاد الماوس الكلى من مزيد من التحليل. دفع برفق الكلى مرة أخرى إلى الفضاء خلف الصفاق.
- إغلاق طبقة العضلات باستخدام خياطة للامتصاص.
- إغلاق طبقة الجلد باستخدام حيدة النايلون خياطة غير قابل للامتصاص.
- إدارة بوبرينورفين وعي.
- نقل الفئران بعيدا عن مجال الجراحة على وسادة التدفئة حتى يستيقظ.
- عودة الفئران لغرفة الحيوانية.
- تراقب عن كثب الفئران وإعطاء جرعات إضافيةمن بوبرينورفين كما هو مبين أعلاه كل 8-12 ساعة لألم أو إزعاج. العلامات السريرية الناتجة في إدارة المسكنات وتشمل التغييرات الاكتئاب أو غيرها من السلوكية، ومظهر غير طبيعي، أو الموقف مثل الشعرية-الانتصاب، التقوس في الجلوس، وعدم الاستمالة وتناول الطعام، أو الجمود.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
معتدل الأشعة تحت الحمراء التي يسببها آكي. الأشعة تحت الحمراء من جانب واحد في وقت واحد مع استئصال الكلية المقابل يقلل كثيرا من التباين في النتائج، ولكن مع أوقات أقصر المشبك اللازمة لالفئران البقاء على قيد الحياة هذا الإجراء، ونحن لا يزال وجد أن٪ فقط 50-60 من الفئران المتقدمة المتوقعة القصور الكلوي 24 ساعة بعد الإصابة (الشكل 3A). من الناحية العملية وهذا يخلق صعوبات تقييم البيانات ما لم تشمل دراسات نظم العلاج التي يمكن أن تبدأ على الأقل 24 ساعة بعد الإصابة، مما يتيح الوقت لتقييم وظائف الكلى وتجاهل الفئران التي لا تتطور القصور الكلوي.
شديدة IR-يسببها آكي. وبالإضافة إلى أداء الأشعة تحت الحمراء من جانب واحد في وقت واحد مع استئصال الكلية المقابل، ونحن أداء الأشعة تحت الحمراء من جانب واحد وحده. يمكن أن الفئران البقاء على قيد الحياة فترات أطول بكثير من نقص التروية وتميل إلى وضع أكثر شدة التليف بعد الاصابه. مع الفترة نفسها من نقص التروية، والفئران تعرض لجانب واحد ديفي نقص الترويةلوب التليف أكثر شدة من نقص التروية الثنائية أو نقص التروية من جانب واحد مع استئصال الكلية 8، ويستخدم أيضا حتى هذا النموذج كنموذج في مرحلة ما بعد آكي التليف. والعيب هو أنه ليس من الممكن تقييم الانتعاش وظيفية بعد الإصابة الأشعة تحت الحمراء من جانب واحد حتى لا يكون هناك أي وسيلة لتقييم شدة إصابة دون حصاد أنسجة الكلى والتي قد لا يكون من الممكن للدراسات على المدى الطويل. لهذا السبب قمنا بتطوير بروتوكول للتحريض شديدة من جانب واحد إصابة الأشعة تحت الحمراء، وتقييم الانتعاش وظيفية الكلوي عن طريق إجراء استئصال الكلية المقابل بعد 8 أيام من الإصابة الأصلي. باستخدام هذا النهج 90-100٪ من الفئران البقاء على قيد الحياة من الاصابة، ولكن الأهم من ذلك أن الفئران تطوير الإصابة الكلوية متسقة للغاية ويمكن تقييمها للانتعاش الوظيفية التالية آكي من يوم 9 فصاعدا (الشكل 3B). وهذه النتائج تتوافق مع الدراسات على الفئران تشير إلى أن أطول الكلوي مرات المشبك عنيق لحث على أكثر التأسيسية إصابة أنبوبي كلوي من أقصر المشبك TI MES مصممة للحث معتدل آكي 9 الى متوسط الموج. وبالإضافة إلى ذلك، بما يتفق مع الدراسات السابقة 8، هذه الفئران تطوير باستمرار آخر إصابة الكلى تليف (الذي قمنا المقررة في يوم 28). لا يرتبط هذا مع بروتينية على الأقل على خلفية BALB / ج: بعد الشديد IR-آكي في يوم 28 إصابة آخر البولية الزلال / الكرياتينين النسبة هي 0.8 ± 0.04 (يعني ± SEM في ميكروغرام / ملغ). ومن غير المعروف ما إذا كان نموذج IR-آكي شديد يؤدي إلى بروتينية على خلفيات أخرى.
الشكل 1. علم التشريح من الفأرة الكلوي نقير. موقف تبين من غمد الأوعية الدموية الكلوية فيما يتعلق الحالب، ومنصات الدهون حول الكلية والغدة الكظرية مع إمدادات الدم. يصادف دائرة سوداء موقف المشبك الصغير.
50495/50495fig2.jpg "/>
الشكل 2. التعرض ولقط من الماوس الكلى غمد الأوعية الدموية (A)، والتعرض من الكلية اليسرى بعد تشريح الجلد وطبقة العضلات؛ (B - E)، ويقام الكلية اليسرى بلطف باستخدام ملقط حادة في حين تتم إزالة الدهون حول الكلية بعناية باستخدام ملقط. (F)، مكشوف ترك عنيق (السهم الأخضر) الكلوي. خط متقطع الأبيض يمثل الموقف المتوقع من الحالب داخل لوحة الدهون محيط بالنقير. يحتاج هذه المنطقة التي ينبغي تجنبها مع المشبك الأوعية الدموية. (G)، مايكرو، المشبك تطبيقها على الكلية اليسرى. (H)، المثبتة تتناول الكلية اليسرى مع الجلد. (I)، (G)، المظهر في الكلى قبل (A)، خلال (I) وبعد (G) بعد إزالة المشبك الأوعية الدموية.
fig3.jpg "/>
الشكل (3). الانتعاش وظيفية بعد آكي. التغييرات في مصل الكرياتينين (بواسطة فحوصات الأنزيمية) بعد إصابة IR معتدلة (26 دقيقة وقت الشبك) واستئصال الكلية المقابل (A)، والتغيرات في كرياتينين المصل بعد تحريض من إصابة شديدة (30 دقيقة وقت الشبك) واستئصال الكلية في المقابل اليوم 8 (B). الدراسات التي أجريت على الفئران BALB / ج، ن = 6 لكل مجموعة. وأعرب النتائج كما يعني + /-SEM مصل الكرياتينين في ملغ / دل، وتقاس باستخدام مقايسة الأنزيمية.
| سلالة الماوس | العمر ماوس تقريبي | تقريبي وزن الفأر | المشبك نوع | الشركة ورقم الكتالوج | وقت نقص التروية لإصابة شديدة | وقت نقص التروية للإصابة معتدلة | التدفئة درجة الحرارة وسادة |
| BALB / ج 4-5 أشهر | 25-28 ز | المشبك الأوعية الدموية (795 غرام الضغط) | ROBOZ، RS-5459 | 30 دقيقة (أو أكثر) | 26 دقيقة | 38 ° C | |
| C57BL / 6 | 4-5 أشهر | 24-27 ز | المشبك الأوعية الدموية (795 غرام الضغط) | ROBOZ، RS-5459 | 29 دقيقة (أو أكثر) | 26 دقيقة | 38 ° C |
| CD1 | 4-5 أشهر | 36-39 ز | المشبك الأوعية الدموية (75-85 ز الضغط) | FST، 18055-02 | 29 دقيقة (أو أكثر) | 26 دقيقة | 38 ° C |
الجدول 1. أوصت المشابك الأوعية الدموية، وأوقات نقص التروية، وسلالات الفئران التي قمنا تقييمها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وصفنا نموذجين من IR-AKI لدراسة آثار المعتدل والشديد الإصابة الكلوية. هذه النماذج تسمح لنا للحث على إصابة ثابت ويمكن التنبؤ بها مع معدل وفيات منخفض. بروتوكول لدينا تحدد كثيرا من الصعوبات والعثرات ترتبط تقليديا مع هذا النموذج. وعلاوة على ذلك، ونحن قد أظهرت أن اعتمادا على طول كلوي تحامل عنيق، ونموذج يؤدي الى عكس إلى حد كبير خفيفة ومتوسطة آكي، أو آكي أكثر شدة مع انتعاش ناقصة والتليف الكلوي الثابتة. تليف بعد الاصابه في نموذج IR-آكي الشديدة قد تنجم عن حقيقة أن الفئران هي قادرة على البقاء على قيد الحياة مع أكثر إصابة الكلوي الحاد مما هو ممكن إذا أجريت هذه الأوقات تعد الدماغية ثنائيا. ومع ذلك، هناك أيضا أدلة على أن وجود الكلى المقابل لم يصب خلال الأيام القليلة الأولى بعد IR يعزز ما بعد آكي التليف 8. لذلك، في حين تظل آليات عبر الحديث بين الكليتين يصب بأذى والجرحى أن تكون إنشأسسنا، وهذا قد يفسر أيضا آلية لتعزيز التليف بعد الاصابه التي نلاحظها في هذا النموذج. في حين أنه لا يزال يتعين تحديدها سواء النتائج باستخدام هذه النماذج يمكن ترجمتها إلى علاجات لأمراض الإنسان، لأنها توفر نماذج يمكن الاعتماد عليها لدراسة آليات والتداوي في IR-آكي ومنع ما بعد آكي الكلوي التليف، وهي مشكلة سريرية أن يبرز بوصفه المساهم الرئيسي في التدريجي مرض الكلى المزمن 10، 11.
هناك عدد من القضايا الحرجة التي يمكن أن تؤثر على شدة الإصابة آكي بعد الأشعة تحت الحمراء التي تحتاج إلى أن حضر بعناية ل: سلالة الماوس 12، 13 الجنسين، العمر 14 والوزن من الفأرة، المشبك الأوعية الدموية المستخدمة، وأنظمة التدفئة 15. يمكن اختيار المشابك الأوعية الدموية الحق أن يكون تحديا. ويتم تقييم كفاءة المشبك أثناء إجراء العمليات الجراحية كما ينبغي أن تصبح الكلى أسود موحد في غضون 5-10 دقائق من وضع المشبك. ومع ذلك، فإنه هو أيضا IMPOrtant أن الكلى كله هو إعادة perfused (الألوان الوردية متابعة) بسرعة بعد إزالة المشبك. لقد وجدنا بعض المشابك أثقل تعمل بشكل جيد مع سلالات معينة (على سبيل المثال BALB / ج و C57BL / 6)، ولكن في حالات أخرى هذه المشابك لحث على إصابة الأوعية الدموية وضخه الكلوي غالبا ما تكون ناقصة (على سبيل المثال: CD1). يتم سرد موجز للالمشابك الأوعية الدموية، والأوزان المشبك (الضغط) وسلالات الفئران التي لدينا تقييم في الجدول 1. لأنظمة التدفئة، وعدد من المحققين استخدام منصات التدفئة السيارات التنظيم مع تحقيقات درجة الحرارة لمراقبة والحفاظ على درجة حرارة ثابتة الجسم. بينما من المفيد من الناحية النظرية، وجدنا أن هذا نظام التدفئة يؤدي إلى تقلبات كبيرة في درجة حرارة الجسم على مدار الجراحة، مما أدى إلى نتائج مختلفة تماما. وبالإضافة إلى ذلك، وهذه النظم هي مكلفة نسبيا لذلك قد يحد في عدد من الفئران واحدة يمكن أن تعمل على في أي وقت واحد. بعد الكثير من التجربة والخطأ انتقلنا إلى درجة حرارة ثابتة، وتعميم الماء هيئة التعليم العالينظام تينغ. والميزة الرئيسية لذلك هو أن منصة التدفئة يعطي درجات حرارة مستقرة (38 ° C) في جميع أنحاء عملية جراحية. مع مساحة منصة كبيرة فإنه من الممكن أيضا أن تعمل على عدد من الفئران على السطح في وقت واحد (والذي هو شرط العملية لمعظم الدراسات IR-آكي). أما وقد قلت ذلك، ونحن لم تجد ما زال هناك تقلبات كبيرة في الإصابة بعد معتدلة (ولكن ليس شديد) IR-آكي. هذه ليست مشكلة بالنسبة للدراسات التي تم تهيئتها العلاجات 24 ساعة أو أكثر بعد الإصابة، منذ الفئران النامية إصابة كافية أو مفرطة يمكن إزالتها من الدراسة قبل التوزيع العشوائي من خلال تحليل كرياتينين المصل. ومع ذلك، إذا يعالجون الفئران قبل الإصابة أو إذا كان يتم استخدام النماذج الوراثية، قد تحتاج إلى إدخال ضوابط إضافية على تقلب التجريبية. منذ التذبذب في درجة حرارة الجسم الأساسية من المرجح أن تكون مساهما رئيسيا في تقلبات في إصابة IR في هذا النموذج، نهج واحد للحد من تقلب سيكون لمدرجات الحرارة الأساسية onitor باستخدام المسابر المستقيم من أجل تحديد الحيوانات المناسبة لتضمين أو استثناء في تحليلات لاحقة. الاعتبارات النهائية العمر الماوس، الوزن، ونوع الجنس. وكان معظم من تجربتنا مع الفئران BALB / ج، ولقد حصلنا على أفضل النتائج عند الفئران تصل مستقرة وزن الجسم بنسبة 4-5 أشهر من العمر، مع وزن الجسم ~ 25-28 غرام. وأخيرا، منذ الذكور لديهم قدر أكبر من القابلية للIR-آكي من الإناث 13، ونحن أداء كل من دراساتنا باستخدام الفئران الذكور فقط. ومع ذلك، هناك متغيرات إضافية التي من الصعب السيطرة عليها، لذلك سيكون لكل مختبر وكل محقق الحاجة إلى إنشاء مرات المشبك دقيقة وشروط للحث على شدة الإصابة يشتهون في سلالة الفأر التي يختارونها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم تضارب المصالح في الكشف عنها.
Acknowledgments
يتم اعتماد مختبر الدكتور دي Caestecker من قبل المعاهد الوطنية للصحة 1RO1 HL093057-01-01 و1RC4DK090770. يتم اعتماد مختبر الدكتور هاريس "من قبل DK38226، DK51265، DK62794 وتمويل من إدارة المحاربين القدامى. الدعم للماوس الكلى جراحات الإصابات والكرياتينين في مصل الدم، وفحوصات التليف قدمت أيضا من قبل فاندربيلت اوبراين الكلى الاصابات مركز منحة 1P30 DK079341.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine (anesthetic) | Webster Veterinary | 07-881-9413 (100 mg/ml) | Final concentration 30 mg/ml Ketamine with 3 mg/ml Xylazine administered at 3-4 ml/kg (100 mg/kg Ketamine and 10 mg/kg Xylazine) |
| Xylazine (analgesic) | Webster Veterinary | 07-808-1939 (100 mg/ml) | As above |
| Antisedan (anti-Xylazine) | Webster Veterinary | 07-867-7097 (5 mg/ml) | Optional: to reverse effects of Xylazine in order to increase the rate of recovery after surgery Use 0.5-0.7 mg/kg |
| Buprenorphine (analgesic) | Bedford Laboratories | NDC 55390-100-10 (0.3 mg/ml) | Dose 0.05-0.1 μg/g every 8-12 hr. Make up a 1:5 dilution in sterile normal saline preoperatively and give 2.5-5 μl/g of the diluted solution. |
| Ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17033-211-38 | |
| Betadine swab sticks | Purdue Products L.P. | NDC 67618-153-01 | |
| Nolvasan Surgical Scrub | Pfizer Animal Care | 300253 | |
| Table 2. Drugs and solutions for I/R surgery. | |||
| Iris Scissors | Integra Miltex | VWR 21909-404 | For skin and muscle dissection |
| Curved iris forceps | FST | 11065-07 | To hold skin and muscle, to remove peri-nephric fat |
| Blunt forceps | ROBOZ | RS-5228 | To manipulate kidneys |
| Vascular clamp (795 g pressure) | ROBOZ | RS-5459 | Good for C57BL/6 and BALB/c mice strains |
| Schwartz clip applying forceps | ROBOZ | RS-5450 | For RS-5459 clamps |
| Vascular clamp (75-85 g pressure) | FST | 18055-02 | Optimal for CD1 mice strain, but also can be used for C57BL/6 and BALB/c |
| Micro-Serrefine Clamp Applicator-14 cm with Lock | FST | 18056-14 | For FST 18055-02 clamps |
| Gayman T/Pump (water-bath heated platform) | Braintree Scientific | TP-650 | The water heater is set at 38 °C 1 hr prior surgery |
| 15" W x 24" Heated platform | Braintree Scientific | HHP-2 | Connect to Gayman heated water pump |
| Heating pad | Braintree Scientific | Model 39DP | Uses microwave for heating. This is useful for warming during recovery |
| Absorbable suture (Vicryl 5-0) | ETHICON | VCP834G | For fascia and muscle |
| Non-absorbable suture: monofilament nylon MONOMID 6/0 660B) | CP Medical | CP-B660B-03 | For skin |
| Halsey needle holder: Tungsten Carbide/13 cm | FST | 12501-13 | To hold suture needles |
| Timer | FST | 06-662-3 | To quantify ischemia time |
| Hot bead sterilizer | FST | 18000-45 | To sterilize instruments between mice if you are performing multiple surgeries (it is not sufficient to soak instruments in ethanol) |
| Electric razor | Braintree Scientific | CLP-22965 | |
| Tape | Durapore | 1538-0 | |
| 1 ml Syringe | EXELint | 26044 | |
| Sterile cotton tipped applicators | Kendall | 8884541300 | |
| Absorbent BenchPad | VWR | 56617-014 | |
| Surgical drapes | VWR | 21902-985 | Need to be autoclaved |
| 2’’ x 2’’ Gauze Pads | Medi-First | 60673 | |
| Sterile gloves | Cardinal Health | 2D7251 | |
| Table 3. Equipment and instruments for I/R surgery. | |||
References
- Singh, A. P., Junemann, A., Muthuraman, A., Jaggi, A. S., Singh, N., Grover, K., Dhawan, R. Animal models of acute renal failure. Pharmacological reports: PR. 64, 31-44 (2012).
- Heyman, S. N., Rosenberger, C., Rosen, S. Experimental ischemia-reperfusion: Biases and myths-the proximal vs. Distal hypoxic tubular injury debate revisited. Kidney Int. 77, 9-16 (2010).
- Lieberthal, W., Nigam, S. K. Acute renal failure. II. Experimental models of acute renal failure: Imperfect but indispensable. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 278, F1-F12 (2000).
- Dunn, S. R., Qi, Z., Bottinger, E. P., Breyer, M. D., Sharma, K. Utility of endogenous creatinine clearance as a measure of renal function in mice. Kidney Int. 65, 1959-1967 (2004).
- Yuen, P. S., Dunn, S. R., Miyaji, T., Yasuda, H., Sharma, K., Star, R. A. A simplified method for HPLC determination of creatinine in mouse serum. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 286, F1116-F1119 (2004).
- Hetu, P. O., Gingras, M. E., Vinet, B. Development and validation of a rapid liquid chromatography isotope dilution tandem mass spectrometry (LC-IDMS/MS) method for serum creatinine. Clin. Biochem. 43, 1158-1162 (2010).
- Keppler, A., Gretz, N., Schmidt, R., Kloetzer, H. M., Groene, H. J., Lelongt, B., Meyer, M., Sadick, M., Pill, J. Plasma creatinine determination in mice and rats: An enzymatic method compares favorably with a high-performance liquid chromatography assay. Kidney Int. 71, 74-78 (2007).
- Yang, L., Besschetnova, T. Y., Brooks, C. R., Shah, J. V., Bonventre, J. V. Epithelial cell cycle arrest in G2/M mediates kidney fibrosis after injury. Nat. Med. 16, 535-543 (2010).
- Shanley, P. F., Rosen, M. D., Brezis, M., Silva, P., Epstein, F. H., Rosen, S. Topography of focal proximal tubular necrosis after ischemia with reflow in the rat kidney. Am. J. Pathol. 122, 462-468 (1986).
- Chawla, L. S., Amdur, R. L., Amodeo, S., Kimmel, P. L., Palant, C. E. The severity of acute kidney injury predicts progression to chronic kidney disease. Kidney Int. 79, 1361-1369 (2012).
- Lo, L. J., Go, A. S., Chertow, G. M., McCulloch, C. E., Fan, D., Ordonez, J. D., Hsu, C. Y. Dialysis-requiring acute renal failure increases the risk of progressive chronic kidney disease. Kidney Int. 76, 893-899 (2009).
- Burne, M. J., Haq, M., Matsuse, H., Mohapatra, S., Rabb, H. Genetic susceptibility to renal ischemia reperfusion injury revealed in a murine model. Transplantation. 69, 1023-1025 (2000).
- Muller, V., Losonczy, G., Heemann, U., Vannay, A., Fekete, A., Reusz, G., Tulassay, T., Szabo, A. J. Sexual dimorphism in renal ischemia-reperfusion injury in rats: Possible role of endothelin. Kidney Int. 62, 1364-1371 (2002).
- Schmitt, R., Marlier, A., Cantley, L. G. Zag expression during aging suppresses proliferation after kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 19, 2375-2383 (2008).
- Oxburgh, L., de Caestecker, M. P.
