Ischemi-reperfusion modell av akut Kidneyskadan och efter skada Fibros i möss

Summary

Vi beskriver modeller av måttlig och svår ischemi-reperfusion-inducerad njurskada där mössen genomgår unilateral renal BLOMSTJÄLK fastspänning följt av samtidig eller fördröjd kontralateral nefrektomi, respektive. Dessa modeller ger genomgående upphov till nedsatt njurfunktion och efter skadan fibros, men skadornas svårighetsgrad och överlevnad är beroende av musen bakgrund, ålder och kirurgisk utrustning.

Abstract

Ischemi-reperfusion inducerad akut njurskada (IR-AKI) används ofta som en modell av AKI i möss, men resultaten är ofta ganska varierande med höga, ofta oredovisade dödlighet som kan förbrylla analyser. Bilateral renal BLOMSTJÄLK fastspänning används ofta för att inducera IR-AKI, men skillnaderna mellan effektiva klämma tryck och / eller renal svar på ischemi mellan njurarna leder ofta till mer varierande resultat. Dessutom är kortare klämma gånger känt att inducera mer varierande tubulär skada, och medan möss som genomgår bilateral skada med längre klämma gånger utveckla mer konsekvent tubulär skada, de dör ofta inom de första 3 dagarna efter skadan på grund av allvarlig njurinsufficiens. Att förbättra efter skada överlevnad och få mer konsekventa och förutsägbara resultat, har vi utvecklat två modeller av ensidiga ischemi-reperfusion skada följt av kontralateral nefrektomi. Båda operationer utförs med hjälp av en dorsal tillvägagångssätt, förminskande kirurgisk stress som följer fROM ventral laparotomi, som vanligen används för mus IR-AKI-operationer. För induktion av måttlig skada BALB / c-möss genomgå ensidiga fastspänning av renal BLOMSTJÄLK för 26 min och även undergå samtidig kontralateral nefrektomi. Användning av detta tillvägagångssätt, 50-60% av möss utvecklar måttlig AKI 24 h efter skada men 90-100% av mössen överlever. För att inducera mer allvarlig AKI, BALB / c möss genomgå renal pedicle fastspänning under 30 min följt av kontralateral nefrektomi 8 dagar efter skada. Detta möjliggör funktionell bedömning av renal återhämtning efter skada med 90-100% överlevnad. Tidigt efter skadan tubulär skada samt efter skada fibros är mycket konsekvent med denna modell.

Introduction

En mängd olika experimentella modeller av akut njurskada (AKI) har utvecklats för att matcha den mångfald och komplexitet av människans villkor (se referens för en ny, omfattande översyn ^1). Var och en av dessa modeller har sina egna styrkor och svagheter, och medan varje efterliknar motsvarande humana förhållanden med varierande effektivitet, ingen exakt modellera patofysiologin av sina mänskliga motsvarigheter. Ischemireperfusion (IR)-inducerad AKI har utvecklats som en modell av akut ischemi-inducerad njurskada hos gnagare. Medan allvarlighetsgrad av renal tubulär skada ses i denna modell ses sällan hos patienter med nedsatt hypoperfusion skador ^2, trots sina begränsningar och till stor del på grund av den relativt reproducerbara karaktären av denna modell, har dess omfattande användning tillhandahålls och det förväntas, kommer att fortsätta att ge viktiga insikter i många av de gemensamma grundläggande mekanismerna för AKI, reparation och terapi ^3. IR kirurgi kräver familiarity med musen njure anatomi, som vi har illustrerat i förenklad form i figur 1. Njurischemi-reperfusion (IR) skada operation kan utföras via ventrala (laparotomi) eller rygg (retroperitoneal) tillvägagångssätt. Vi använder en dorsal strategi eftersom det är mindre traumatiskt, så snabbare återhämtning och förbättrad överlevnad (särskilt när först lära proceduren). Renal IR skada kan ske ensidigt eller bilateralt. Leder dock skillnader mellan effektiva klämma tryck (som kan följa av mellanliggande perihilar fett mellan klämkäftarna) och / eller skillnader i renal svar på ischemi mellan sidorna till mer varierande resultat. Även om detta inte är ett oöverstigligt problem, kan det öka variationen mellan experiment, vilket är en viktig fråga för denna modell. Ensidig IR kan utföras med kontraindikationer lateral nefrektomi. Detta är vår metod för val eftersom det minskar variationen i fastspänning mellan pedicles, och samtidigt enllows en för att utvärdera njurfunktion, som är opåverkat med ensidig IR ensam. Det har varit diskussioner om vad som är den mest praktiska kontra optimal metod för att bedöma njurfunktionen hos möss. Urea (BUN) ger ett mått på njurfunktionen och är en användbar "första titt" markör i vissa modeller av AKI, inklusive IR skada. Däremot kan BUN nivåer påverkas av volym status av mössen som kan beröras, särskilt efter ventral tillvägagångssätt IR skada, när fördröjd återhämtning minskar oralt intag av vätska under ett antal dagar efter operationen. Serumkreatinin påverkas mindre av vätskestatus men klart påverkats av muskelmassa. En av svårigheterna med serumkreatinin mätningar har varit problem med detektion av icke-kreatinin kromogener i mus-serum med pikrinsyra tekniker. Som ett alternativ, har ett antal centra utvecklat en HPLC-metod för att kvantifiera musen kreatinin som inte påverkas av denna artefakt ^4. Emellertid UNLike BUN och pikrinsyra analyser kreatinin, vilket endast kräver 5-10 il serum, HPLC-analyser kräver ~ 25 il serum per analys, vilket om det utförs i två exemplar kommer att kräva ~ 100 pl helblod per analys. Detta kan vara begränsande för musstudier. Vissa centra har utvecklat mer känsliga HPLC och masspektrometri-baserad metoder som tillåter analys av små provvolymer ^{5, 6.} Men dessa tekniker är inte allmänt tillgängliga. En alternativ, enzymatisk kaskad analys (vilket kräver endast 5-10 il serum) har utvärderats i mus och råtta serumprover och visat att nära parallell HPLC-mätningar av serumkreatinin medan pikrinsyra analyser alltid överskattar kreatinin värden ^7. Även denna analys inte används allmänt i AKI litteraturen, är analysen kommersiellt tillgänglig, enkel att använda, och vi finner ger tillförlitliga resultat med denna modell av IR-inducerad AKI i möss.

Protocol

1. Autoklav alla kirurgiska instrument för kirurgi. Observera att om man utför flera operationer på olika möss, skölj instrument efter användning och sedan sterilisera med en varm pärla autoklav. Det är inte tillräckligt att dra i 70% etanol.
2. Ge 0,5 ml S / C steril normal saltlösning preoperativt och omedelbart postoperativt för att kompensera för förlusten av kroppsvätska under operation.
3. Väg mössen.
4. Söva musen med IP Xylazin / ketamin blandning. Det brukar ta 3-5 min för mössen att nå kirurgiska plan anestesi.
5. Raka operationsområdet med tillräckligt gränsområdet för att hålla håret från att förorena snittet webbplatsen. Detta måste utföras på ett förberedande område, inte där operationen utförs.
6. Applicera salva oftalmologiska smörjande till ögonen för att förhindra uttorkning under förfarandet.
7. Placera musen benäget på den uppvärmda ytan täckt med absorberande bänk pad. Tape ben till den kirurgiska ytan.
8. Om du användervattenbadet införde värme vid 38 ° C 1 timme före operationen.
9. Aseptisk framställning med användning Betadine lösning svabb pinne: skrubba från mitten av platsen mot periferin 3x, varje gång följt av skrubbning med Nolvasan att avlägsna Betadine. All Betadine bör avlägsnas från operationsområdet före incision genom sköljning med Nolvasan. Innan du börjar steriltvätta handskar bör ändras för att bli steril.
10. Täck kirurgiska området med en steril kirurgisk duk. Detta kommer att förhindra att oönskade hår från att komma in i operationsområdet och ger en yta som att lägga sterila instrument under operation.
11. Palpera njure plats genom huden.
12. Skär rygghuden längs mittlinjen av mus (ungefär 1,5 cm) med användning av sax och pincett.
13. Separat hud och subkutana lager över de vänstra och högra dorsala sidorna genom detta snitt genom trubbig dissektion med hjälp av sax och pincett.
14. Gör ett litet snitt genom höger flANK muskel och fascia ovanför njure och exteriorize höger njure.
15. Försiktigt dissekera de övre och nedre polerna hos njuren fria från omgivande vävnad. Observera att fettvävnaden från hela övre polen innehåller binjuren bär sin egen blodtillförsel som kan skjutas bort njuren men uppenbarligen inte bör avlägsnas från musen (Figur 1). Efter befriande njure från omgivande vävnad, knyta 4-0 silke sutur runt hilum av höger njure med en dubbel kirurgisk knut. Lämna en ände av suturen ~ 2 i lång tid att hålla upp njuren som du skär distalt knuten så att du kan visualisera platsen som ska skäras. Skölj stubben med steril koksaltlösning.
16. Stäng muskellagret med resorberbara suturer.
17. Gör ett litet snitt genom den vänstra flanken muskel och fascia ovanför njure och exteriorize den vänstra njuren (Figur 2A).
18. Håll försiktigt njure med trubbig pincett samtidigt släppa renalBLOMSTJÄLK från omgivande fettvävnad med pincett (figur 2B-2F). För mycket press på njuren med hjälp av trubbig pincett kan orsaka njurskador så måste man komma ihåg detta när man utformar "bluff" kontroller för studierna. Om du märker att dina skenkontroller utvecklar njurskada (vilket framgår av en ökning av serumkreatinin), en alternativ metod som du kan överväga att släppa den omgivande fettvävnad från renal BLOMSTJÄLK är att försiktigt rulla vävnaderna med koksaltlösning indränkt steril bomull- tippade kompresser. I vår erfarenhet fettet är ganska tätt knuten till renal BLOMSTJÄLK och kan inte enkelt tas bort med bomullspinnar, så det kanske inte är den första metoden du skulle vilja använda. Men liksom andra aspekter av denna modell, är detta något som du kommer att behöva upprätta själv med träning och erfarenhet.
19. Clamp vänster renal BLOMSTJÄLK med icke traumatisk Kärlklämma hjälp innehar pincett (för att underlätta klämma placering), använda timer för olika CLAmp gånger beroende på musstam och skada svårighetsgrad krävs (se tabell 1).
20. Täck den vänstra njuren med huden (Figur 2H).
21. Täck huden snitt med koksaltlösning indränkt gasbinda.
22. Exteriorize njure, bekräftar enhetligt mörka utseende och släpp klämman efter de angivna tiderna, och bekräfta att mörka utseende vänder likformigt i njuren (Figur 2I / G). Om njurarna inte snabbt och enhetligt re-BEGJUTA (rosa upp) ska musen uteslutas från vidare analys. Skjut försiktigt njuren tillbaka till retroperitonealrummet.
23. Stäng muskellagret med resorberbara suturer.
24. Stäng hudlagret med monofilament nylon icke-resorberbara suturer.
25. Administrera buprenorfin smärtlindring.
26. Överför möss borta från det kirurgiska området på en värmedyna tills de vaknar.
27. Återgå mössen till djurens rum.
28. Nära övervaka mössen och ge ytterligare doserav buprenorfin som anges ovan varje 8-12 h för smärta eller obehag. Kliniska tecken resulterar i administrering av analgetika inkluderar depression eller andra beteendeförändringar, onormalt utseende, eller kroppshållning som upprest päls, krökt kroppshållning, brist på grooming och äta, eller orörlighet.

Representative Results

Måttlig IR-inducerad AKI. Ensidig IR med samtidig kontralateral nefrektomi minskar väsentligt variabilitet i resultaten, men med kortare klämma gånger som behövs för mössen att överleva denna procedur, vi fortfarande funnit att endast 50-60% av mössen utvecklade den förväntade njurinsufficiens 24 tim efter skada (figur 3A). I praktiken har detta skapar svårigheter att utvärdera data om de studier innefattar behandlingsregimer som kan initieras minst 24 timmar efter skadan, vilket ger tid för att bedöma njurfunktionen och kasta möss som inte utvecklar njurinsufficiens.

Svår IR-inducerad AKI. Förutom att utföra ensidiga IR med samtidig kontralateral nefrektomi, utför vi ensidiga IR ensam. Möss kan överleva mycket längre perioder av ischemi och tenderar att utveckla en svårare efter skada fibros. Med samma period ischemi, möss utsätts för ensidig ischemi utvecklop strängare fibros än bilateral ischemi eller unilateral ischemi med nefrektomi ^8, så denna modell även användas som en modell för post-AKI fibros. Nackdelen är att det inte är möjligt att bedöma funktionell återhämtning efter unilateral IR skada så det finns inget sätt att utvärdera hur allvarlig skadan utan skörd njurvävnad och det kanske inte är möjligt för långsiktiga studier. Av denna anledning har vi utvecklat ett protokoll för att framkalla allvarlig ensidiga IR skada, och bedöma renal funktionell återhämtning genom att göra kontralateral nefrektomi 8 dagar efter den ursprungliga skadan. Med denna metod 90-100% av mössen överlever skadan, men viktigast mössen utvecklas mycket konsekvent renal skada och kan utvärderas för funktionell återhämtning efter AKI från Dag 9 och framåt (Figur 3B). Dessa resultat överensstämmer med studier på råttor visar att längre renal BLOMSTJÄLK klämma gånger framkalla mer ingående renal tubulär skada än kortare klämma ti mes avsedd att framkalla mild till måttlig AKI ^9. Dessutom överensstämmer med tidigare studier ^8, dessa möss utvecklar konsekvent efter skada renal fibros (som vi har bedömt vid dag 28). Detta är inte förknippad med proteinuri åtminstone på en BALB / c bakgrund: efter svår IR-AKI vid dag 28 efter skada urin albumin / kreatinin-kvoten är 0,8 ± 0,04 (medelvärde ± SEM i pg / mg). Det är okänt om den svåra IR-AKI modellen ger upphov till proteinuri på andra bakgrunder.

Figur 1. Anatomi av musen renal hilum. Illustrera position renalvaskulär skidan i förhållande till urinledaren, perinephric fettkuddarna och binjuren med blodtillförsel. Den svarta cirkeln markerar positionen av mikro-klämma.

50495/50495fig2.jpg "/>
Figur 2. Exponering och fastspänning av mus njurens vaskulära mantel (A), exponering av den vänstra njuren efter dissektion av hud och muskler skikt,. (B - E), är den vänstra njuren höll försiktigt med trubbig pincett medan perinephric fett avlägsnas försiktigt med pincett. (F), Exposed vänster renal BLOMSTJÄLK (grön pil). Den vita streckade linjen markerar den förväntade positionen av urinledaren inom perihilar fett pad. Denna region måste undvikas med den vaskulära klämman. (G), Micro-klämma användas till vänster njure. (H), Clamped vänster njure är täckt med huden. (I), (G), Framträdande av njuren innan (A), under (I) och efter (G) efter avlägsnande av den vaskulära klämman.

fig3.jpg "/>
Figur 3. Funktionell återhämtning efter AKI. Förändringar i serumkreatinin (genom enzymatiska analyser) efter måttlig IR skada (26 min klämma tid) och kontralateral nefrektomi (A), förändringar i serumkreatinin efter induktion av svår skada (30 min klämma tid) och kontralateral nefrektomi vid Dag 8 (B). Studier utförda i BALB / c-möss, n = 6 per grupp. Resultat uttrycks som medelvärde + /-SEM serumkreatinin i mg / dl, mätt med hjälp av enzymatisk analys.

Musstam	Ungefärlig Mouse ålder	Ungefärlig musvikt	Clamp typ	Företag och katalognummer	Ischemi tid för allvarlig skada	Ischemi tid för måttlig skada	Värmedyna temperatur
BALB / c- 4-5 månader	25-28 g	Kärlklämma (795 g tryck)	Roboz, RS-5459	30 minuter (eller längre)	26 min	38 ° C
C57BL / 6	4-5 månader	24-27 g	Kärlklämma (795 g tryck)	Roboz, RS-5459	29 min (eller längre)	26 min	38 ° C
CD1	4-5 månader	36-39 g	Kärlklämma (75-85 g tryck)	FST, 18.055-02	29 min (eller längre)	26 min	38 ° C

Tabell 1. Rekommenderad vaskulära klämmor, tider ischemi, och stammar mus som vi har utvärderat.

Discussion

Vi beskriver två modeller av IR-AKI för att studera effekterna av måttlig och svår njurskada. Dessa modeller ger oss möjlighet att framkalla konsekvent och förutsägbar skada med låg dödlighet. Vår protokoll beskriver många av de svårigheter och fallgropar som traditionellt förknippas med denna modell. Dessutom har vi visat att beroende på längden av renal BLOMSTJÄLK fastspänning, inducerar modellen en stor del reversibel mild och måttlig AKI, eller strängare AKI med ofullständig återhämtning och ihärdig renal fibros. Post-skada fibros i svår IR-AKI modell kan bero på det faktum att möss kan överleva med mer allvarlig njurskada än vad som skulle vara möjligt om dessa längre ischemiska tider hade utförts bilateralt. Men det finns också belägg för att förekomsten av en oskadad kontralateral njure för de första dagarna efter IR ökar efter AKI fibros ^8. Därför, medan mekanismerna för överhörning mellan oskadade och skadade njurar återstår att etableupprättats, kan denna mekanism står också för ökad efter skada fibros som vi observerar i denna modell. Även om det återstår att avgöra om resultaten med hjälp av dessa modeller kan översättas till terapi för sjukdomar hos människor, de ger tillförlitliga modeller för att studera mekanismer och terapi i IR-AKI och att förhindra post-AKI renal fibros, ett kliniskt problem som alltmer framstår som en viktig bidragsgivare i progressiv kronisk njursjukdom ^{10, 11.}

Det finns ett antal kritiska frågor som kan påverka graden av AKI efter IR skada som måste noga uppmärksammas: musstammen ^12, kön ^13, ålder ¹⁴ och vikten av musen, den Kärlklämma används, och värmesystem ^15. Välja rätt vaskulära klämmorna kan vara en utmaning. Effektivitet av klämman bedöms under det kirurgiska ingreppet som njuren bör bli enhetligt svarta inom 5-10 min klämma placering. Det är emellertid också important att hela njuren åter-perfusion (pinks upp) snabbt efter att ta bort klämman. Vi har hittat några av de tyngre klämmor fungerar bra med vissa stammar (t.ex. BALB / c och C57BL / 6), men i andra dessa klämmor framkalla kärlskada och renal reperfusion är ofta ofullständiga (t.ex.: CD1). En sammanfattning av de vaskulära klämmor, vikter klämma (tryck) och stammar mus som vi har utvärderat är uppräknad i tabell 1. För värmesystem, ett antal utredare använda auto-reglerade värmedynor med temperaturgivare för att övervaka och hålla konstant kroppstemperatur. Medan teoretiskt fördelaktiga, hittade vi det här värmesystemet kan leda till stora svängningar i kroppstemperatur under loppet av operationen, vilket ger upphov till helt olika resultat. Dessutom är dessa system är relativt dyra så kan begränsa i antalet möss en kan drivas med vid något tillfälle. Efter en hel del trial and error har vi flyttat till en konstant temperatur, cirkulerande vatten heastallationssystem. Den största fördelen med detta är att uppvärmning plattformen ger stabila temperaturer (38 ° C) under hela operationen. Med den stora plattformen området är det också möjligt att arbeta på ett antal möss på ytan vid en viss tidpunkt (som är ett praktiskt krav för de flesta IR-AKI-studier). Med detta sagt, vi hittade det fortfarande fanns betydande variabilitet i skada efter måttlig (men ej svår) IR-AKI. Detta är inte ett problem för studier i vilka behandlingar inleds 24 timmar eller mer efter skadan, eftersom möss utvecklar otillräcklig eller alltför allvarlig skada kan tas bort från studien före randomisering genom analys av serumkreatinin. Men om mössen behandlas före skadan eller om genetiska modeller används, kan ytterligare kontroller på experimentell variabilitet behöver införas. Eftersom variationer i kroppstemperaturen är sannolikt den största bidragsgivaren till variabilitet i IR skada i denna modell, en strategi för att begränsa variationen skulle vara att monitor kärntemperaturer använder rektala sonder i syfte att fastställa lämpliga djur för att inkludera eller exkludera i efterföljande analyser. De slutliga överväganden är mus ålder, vikt och kön. De flesta av våra erfarenheter har varit med BALB / c-möss, och vi har fått de bästa resultaten när mössen når stabil kroppsvikt vid 4-5 månaders ålder, med en kroppsvikt ~ 25-28 g. Slutligen, eftersom män har större känslighet för IR-AKI än honorna ^13, utför vi alla våra studier använder hanmöss enbart. Men det finns ytterligare variabler som är svåra att kontrollera, så varje labb som samtliga kommer att behöva fastställa exakta klämma tider och förhållanden för att inducera svåra skador som de önskar i musstammen av sitt val.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine (anesthetic)	Webster Veterinary	07-881-9413 (100 mg/ml)	Final concentration 30 mg/ml Ketamine with 3 mg/ml Xylazine administered at 3-4 ml/kg (100 mg/kg Ketamine and 10 mg/kg Xylazine)
Xylazine (analgesic)	Webster Veterinary	07-808-1939 (100 mg/ml)	As above
Antisedan (anti-Xylazine)	Webster Veterinary	07-867-7097 (5 mg/ml)	Optional: to reverse effects of Xylazine in order to increase the rate of recovery after surgery Use 0.5-0.7 mg/kg
Buprenorphine (analgesic)	Bedford Laboratories	NDC 55390-100-10 (0.3 mg/ml)	Dose 0.05-0.1 μg/g every 8-12 hr. Make up a 1:5 dilution in sterile normal saline preoperatively and give 2.5-5 μl/g of the diluted solution.
Ophthalmic ointment	Dechra	NDC 17033-211-38
Betadine swab sticks	Purdue Products L.P.	NDC 67618-153-01
Nolvasan Surgical Scrub	Pfizer Animal Care	300253
Table 2. Drugs and solutions for I/R surgery.
Iris Scissors	Integra Miltex	VWR 21909-404	For skin and muscle dissection
Curved iris forceps	FST	11065-07	To hold skin and muscle, to remove peri-nephric fat
Blunt forceps	ROBOZ	RS-5228	To manipulate kidneys
Vascular clamp (795 g pressure)	ROBOZ	RS-5459	Good for C57BL/6 and BALB/c mice strains
Schwartz clip applying forceps	ROBOZ	RS-5450	For RS-5459 clamps
Vascular clamp (75-85 g pressure)	FST	18055-02	Optimal for CD1 mice strain, but also can be used for C57BL/6 and BALB/c
Micro-Serrefine Clamp Applicator-14 cm with Lock	FST	18056-14	For FST 18055-02 clamps
Gayman T/Pump (water-bath heated platform)	Braintree Scientific	TP-650	The water heater is set at 38 °C 1 hr prior surgery
15" W x 24" Heated platform	Braintree Scientific	HHP-2	Connect to Gayman heated water pump
Heating pad	Braintree Scientific	Model 39DP	Uses microwave for heating. This is useful for warming during recovery
Absorbable suture (Vicryl 5-0)	ETHICON	VCP834G	For fascia and muscle
Non-absorbable suture: monofilament nylon MONOMID 6/0 660B)	CP Medical	CP-B660B-03	For skin
Halsey needle holder: Tungsten Carbide/13 cm	FST	12501-13	To hold suture needles
Timer	FST	06-662-3	To quantify ischemia time
Hot bead sterilizer	FST	18000-45	To sterilize instruments between mice if you are performing multiple surgeries (it is not sufficient to soak instruments in ethanol)
Electric razor	Braintree Scientific	CLP-22965
Tape	Durapore	1538-0
1 ml Syringe	EXELint	26044
Sterile cotton tipped applicators	Kendall	8884541300
Absorbent BenchPad	VWR	56617-014
Surgical drapes	VWR	21902-985	Need to be autoclaved
2’’ x 2’’ Gauze Pads	Medi-First	60673
Sterile gloves	Cardinal Health	2D7251
Table 3. Equipment and instruments for I/R surgery.