Summary
Wir beschreiben Modelle der mittelschweren und schweren Ischämie-Reperfusion-induzierte Nierenschädigung, in denen die Mäuse unterziehen einseitige renale Stiel Klemm gefolgt durch gleichzeitige oder verzögerte kontralaterale Nephrektomie sind. Diese Modelle konsequent führen zu Nierenfunktionsstörungen und posttraumatische Fibrose, aber Verletzungsschwere und Überleben sind abhängig von Maus Hintergrund, Alter und chirurgischen Einrichtungen.
Abstract
Ischämie-Reperfusion akuten Nierenschädigung (AKI-IR) wird weithin als ein Modell der AKI in Mäusen verwendet, aber die Ergebnisse sind oft sehr variabel mit hohen, oft nicht gemeldet Sterblichkeit, die Analysen verwechseln kann. Bilaterale renale Stiel Klemmung wird häufig verwendet, um IR-AKI induzieren, aber die Unterschiede zwischen effektiver Klemme Drücke und / oder renalen Reaktionen auf Ischämie zwischen Nieren oft mehr variable Ergebnissen führen. Darüber hinaus werden kürzere Klemme mal bekannt, mehr variable tubuläre Schädigung induzieren, während Mäuse und unterziehen bilateralen Verletzungen mit längeren Klemme mal konsequenter tubuläre Schädigung entwickeln sie oft innerhalb der ersten 3 Tage nach der Verletzung wegen schwerer Niereninsuffizienz sterben. Um nach der Verletzung das Überleben zu verbessern und zu erhalten mehr konsistente und vorhersagbare Ergebnisse, haben wir zwei Modelle der einseitigen Ischämie-Reperfusion Verletzungen durch kontralaterale Nephrektomie gefolgt entwickelt. Beide Operationen werden durchgeführt unter Verwendung eines dorsalen Zugang, wodurch chirurgischen Stress durch from ventralen Laparotomie, die gemeinhin für Maus IR-AKI Operationen verwendet. Für die Induktion der mittleren Verletzungen BALB / c Mäusen zu unterziehen einseitiger Einspannung des renalen Stiel für 26 min unterzogen und gleichzeitig kontralaterale Nephrektomie. Mit diesem Ansatz entwickeln 50-60% der Mäuse moderate AKI 24 Stunden nach der Verletzung, aber 90-100% der Mäuse überleben. Um weitere schwere AKI induzieren, unterziehen BALB / c Mäusen Nieren Stiel Klemmung für 30 min durch kontralaterale Nephrektomie 8 Tagen nach Verletzungen gefolgt. Dies ermöglicht funktionelle Beurteilung der Nierenfunktion Genesung nach Verletzungen mit 90-100% Überleben. Frühe posttraumatische Tubulusschäden sowie nach der Verletzung Fibrose sind sehr konsistent mit diesem Modell.
Introduction
Eine Vielzahl von experimentellen Modellen der akuten Nierenschädigung (AKI) wurden entwickelt, um die Vielfalt und Komplexität des menschlichen Daseins (siehe Referenz für eine aktuelle, umfassende Überprüfung 1) entsprechen. Jedes dieser Modelle hat seine eigenen Stärken und Schwächen, und während jeder ahmt die entsprechenden menschlichen Bedingungen mit unterschiedlichen Wirkungsgraden, keine präzise Modellierung der Pathophysiologie von ihren menschlichen Pendants. Ischämie Reperfusion (IR)-induzierten AKI als Modell von akuter Ischämie-induzierter Nierenschädigung in Nagetieren entwickelt. Während die Schwere der Schädigung der Nierentubuli in diesem Modell zu sehen ist selten bei Patienten mit renaler Minderdurchblutung Verletzungen 2 beobachtet, trotz ihrer Einschränkungen und vor allem wegen der relativ reproduzierbare Natur dieses Modells seines umfangreichen Einsatzes hat vorgesehen, und es wird erwartet, wird weiterhin wichtige Erkenntnisse über viele der gemeinsamen grundlegenden Mechanismen der AKI, Reparatur und Therapie 3 vorzusehen. IR Chirurgie erfordert familiarity mit der Maus Niere Anatomie, die wir in einer vereinfachten Form in Abbildung 1 dargestellt sind. Renal Ischämie-Reperfusion (IR) Verletzungen Operation kann über ventralen (Bauchschnitt) oder dorsal (retroperitoneale) Ansätze durchgeführt werden. Wir verwenden eine dorsale Ansatz, da es weniger traumatisch ist, so dass eine schnellere Genesung und eine verbesserte Überlebensrate (insbesondere, wenn das Erlernen der ersten Prozedur). Renal IR Verletzung kann einseitig oder beidseitig erfolgen. Dies führt jedoch Unterschiede zwischen effektiver Klemme Druck (die von Zwischenschaltung perihiläre Fett zwischen den Spannbacken führen) und / oder Unterschiede in der renalen Ischämie zwischen Reaktionen auf Seiten mehr unterschiedliche Ergebnisse. Zwar ist dies kein unüberwindbares Problem, kann es Variabilität zwischen den Experimenten zu erhöhen, das ist ein großes Problem für dieses Modell. Einseitige IR mit contra-lateraler Nephrektomie durchgeführt werden. Dies ist unsere Methode der Wahl, da es reduziert Variabilität Klemmung zwischen Pedikel und gleichzeitig einllows man beurteilen Nierenfunktion, die unberührt mit einseitiger IR allein ist. Es wurde darüber diskutiert, was ist die praktischste vs optimale Methode, um die Nierenfunktion bei Mäusen zu beurteilen. Blut-Harnstoff-Stickstoff (BUN) liefert ein Maß für die Nierenfunktion und ist ein nützlicher "ersten Blick" Marker in einigen Modellen von AKI, einschließlich IR Verletzungen. Allerdings kann BUN Ebenen Vol. Status der Mäuse, die betroffen sein könnten betroffen sein, insbesondere nach ventralen Zugang IR Verletzungen, wenn verzögerte Erholung reduziert orale Aufnahme von Flüssigkeiten für eine Anzahl von Tagen nach der Operation. Serum-Kreatinin wird weniger durch Flüssigkeitszufuhr Status beeinflusst, sondern ist eindeutig durch Muskelmasse beeinflusst. Eine der Schwierigkeiten, mit Serum-Kreatinin-Messungen hat Probleme mit dem Nachweis der Nicht-Kreatinin Chromogene in Maus-Serum mit Pikrinsäure Techniken. Alternativ haben einige Zentren eine HPLC-basiertes Verfahren zur Maus Kreatinin quantifizieren, die nicht von diesem Artefakt 4 betroffen ist entwickelt. Allerdings unlike BUN und Kreatinin-Pikrinsäure-Assays, die nur verlangen 5-10 ul Serum, erfordern HPLC-Assays ~ 25 ul Serum pro Test, die, wenn sie in doppelte durchgeführt wird ~ 100 ul Vollblut pro Assay benötigt. Dies kann Mäusestudien limitierend sein. Einige Zentren haben empfindlichere HPLC und Massenspektrometrie-basierte Methoden, die Analyse kleiner Probenvolumina 5, 6 ermöglichen entwickelt. Allerdings sind diese Techniken nicht allgemein verfügbar. Eine Alternative, enzymatische Kaskade Assay (was nur 5-10 ul Serum) wurde in Maus und Ratte Serumproben wurden ausgewertet und gezeigt, dass eng parallel HPLC-Messungen von Serum-Kreatinin während Pikrinsäure-Assays immer überschätzen Kreatinin-Werte 7. Während dieser Test ist nicht weit verbreitet in der AKI Literatur verwendet wird, ist der Test im Handel erhältlich, einfach zu bedienen, und wir finden, gibt zuverlässige Ergebnisse mit diesem Modell von IR-induzierten AKI in Mäusen.
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Protocol
- Autoklav alle chirurgischen Instrumente vor der Operation. Beachten Sie, dass, wenn man mehrere Operationen durchführen wird auf verschiedenen Mäusen, Spülen Sie die Instrumente nach Gebrauch und dann sterilisieren mit einem heißen Perle Sterilisator. Es ist nicht ausreichend, um in 70% Ethanol einweichen.
- Geben Sie 0,5 ml S / C sterile Kochsalzlösung prä-und postoperativ sofort für den Verlust von Körperflüssigkeit während der Operation zu kompensieren.
- Wiegen die Mäuse.
- Anesthetize Maus mit IP Xylazin / Ketamin Mischung. Es dauert in der Regel 3-5 min für die Mäuse, um chirurgische Anästhesie Ebene zu erreichen.
- Rasur das OP-Gebiet mit genügend Grenzgebiet, um Haare aus Verunreinigung des Inzisionsstelle halten. Dies muss in einem vorbereitenden Bereich ausgeführt werden, nicht, wo die Operation durchgeführt wird.
- Apply Augen Schmier-Salbe für die Augen ein Austrocknen zu verhindern während des Verfahrens.
- Platzieren Sie die Maus in Bauchlage auf der beheizten Oberfläche mit einem saugfähigen Pad Bank abgedeckt. Band Beine auf die chirurgische Oberfläche.
- Bei der Verwendung vondas Wasserbad-System setzen Wärme bei 38 ° C 1 Stunde vor der Operation.
- Aseptische Herstellung mit Betadine Lösung Tupfer-Stick: schrubben vom Zentrum des Ortes in Richtung der Peripherie 3x, jedes Mal durch Schrubben mit Nolvasan gefolgt, um die Betadine entfernen. Alle Betadine sollte aus dem Operationsfeld entfernt werden, bevor Einschnitt durch Spülen mit Nolvasan. Vor Beginn der aseptischen Verfahren Handschuhe sollten geändert werden, um steril sein werden.
- Titelbild Operationsfeld mit einer sterilen Operationstuch. Dies wird Haarsträhne vom Betreten des OP-Feld zu verhindern und eine Fläche, auf der sterilen Instrumente während der Operation lag.
- Ertasten Niere Lage durch die Haut.
- Schneiden Sie die Rückenhaut entlang der Mittellinie der Maus (ca. 1,5 cm) mit einer Schere und Pinzette.
- Separate Haut und des subkutanen Schichten über den linken und rechten dorsalen Seiten durch diesen Einschnitt durch stumpfe Dissektion mit einer Schere und Pinzette.
- Machen Sie einen kleinen Schnitt durch die rechte flank Muskeln und Faszien oberhalb der Niere und exteriorisieren der rechten Niere.
- Vorsichtig zerlegen die oberen und unteren Pole der Niere frei von umgebendem Gewebe. Beachten Sie, dass Fettgewebe aus der ganzen oberen Pol der Nebenniere trägt seine eigene Blutversorgung, die abgeschaltet werden kann die Niere geschoben aber offensichtlich nicht von der Maus (Abbildung 1) entfernt werden enthält. Nach der Befreiung Niere vom umgebenden Gewebe, binden das 4-0 Seidenfaden um den Hilus der rechten Niere mit einem Doppel chirurgischen Knoten. Lassen Sie ein Ende des Fadens in ~ 2 lange zu halten, bis die Niere, wie Sie Schneiden distal der Knoten sind so zu visualisieren kann die Website zu schneiden. Spülen Sie den Stumpf mit steriler Kochsalzlösung.
- Schließen Sie die Muskulatur durch resorbierbares Nahtmaterial.
- Machen Sie einen kleinen Schnitt durch die linke Flanke Muskeln und Faszien oberhalb der Niere und exteriorisieren der linken Niere (Abbildung 2A).
- Sorgfältig halten Niere mit stumpfen Pinzette beim Loslassen NierenStiel aus den umliegenden Fettgewebe mit einer Pinzette (2B-2F). Zu viel Druck auf die Niere mit den stumpfen Pinzette kann Nierenschädigung so muss man sich daran erinnern, um bei der Gestaltung "Schein"-Kontrollen für die Studien. Wenn Sie, dass Ihr Schein Kontrollen Nierenschädigung (wie durch einen Anstieg des Serum-Kreatinin belegt) zu finden, eine alternative Methode können Sie prüfen, um die umliegende Fettgewebe aus der renalen Stiel lösen ist, sanft rollen die Gewebe mit Salzlösung getränkte sterile Baumwolle Wattestäbchen. Nach unserer Erfahrung wird das Fett ziemlich eng an die Nieren Stiel befestigt und kann nicht einfach mit einem Wattestäbchen entfernt werden, so kann dies nicht der erste Ansatz, den Sie verwenden möchten wäre. Jedoch, wie andere Aspekte dieses Modells, ist dies etwas, das Sie haben, um für sich selbst mit der Praxis und Erfahrung zu etablieren wird.
- Clamp links renalen Stiel mit nicht traumatischen Gefäßklemme mit Haltezange (zu Klemme Platzierung zu erleichtern), verwenden Sie Timer für verschiedene clamp Zeiten abhängig von der Maus-Stamm und Verletzungsschwere erforderlich (siehe Tabelle 1).
- Decken Sie die linke Niere mit der Haut (2H).
- Titelbild Hautschnitt mit Kochsalzlösung getränkten Gaze.
- Exteriorisieren Niere, bestätigen einheitlich dunkle Aussehen und lassen Sie die Klammer nach den angegebenen Zeiten, und bestätigen, dass düsteren Erscheinungsbild einheitlich kehrt in der Niere (2I / G). Wenn die Niere nicht schnell und gleichmäßig wieder perfuse (pink up) sollte die Maus aus der weiteren Analyse ausgeschlossen werden. Schieben Sie zurück in die Niere Retroperitonealraum.
- Schließen Sie die Muskelschicht mit resorbierbares Nahtmaterial.
- Schließen Sie die Hautschicht mit Monofilament Nylon-resorbierbares Nahtmaterial.
- Verwalten Buprenorphin Analgesie.
- Übertragen Mäuse vom OP-Feld auf einem Heizkissen, bis sie aufwachen.
- Bringen Sie die Mäuse Tierraum.
- Überwacht die Mäuse und geben zusätzliche Dosenvon Buprenorphin wie oben angegeben alle 8-12 h für Schmerzen oder Beschwerden. Klinische Zeichen was Verabreichung von Analgetika sind Depressionen oder andere Verhaltensänderungen, Auffälligkeiten oder Körperhaltung wie Piloerektion, gekrümmte Haltung, mangelnde Pflege und Essen, oder Immobilität.
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Representative Results
Moderate IR-induzierten AKI. Einseitige IR mit gleichzeitiger kontralaterale Nephrektomie deutlich reduziert Schwankungen bei den Ergebnissen, aber mit kürzeren Klammer mal notwendig, dass die Mäuse, um dieses Verfahren zu überleben, haben wir noch festgestellt, dass nur 50-60% der Mäuse die erwartete Niereninsuffizienz 24 Stunden entwickelt nach der Verletzung (Abbildung 3A). In der Praxis bedeutet dies schafft Schwierigkeiten der Auswertung von Daten, es sei denn die Studien Behandlungsschemata, die mindestens 24 Stunden nach der Verletzung begonnen werden kann beinhalten, so dass genügend Zeit zur Beurteilung der Nierenfunktion und entsorgen Mäusen, die nicht entwickeln Niereninsuffizienz.
Schwere IR-induzierten AKI. Neben der Durchführung einseitiger IR mit gleichzeitiger kontralaterale Nephrektomie führen wir einseitige IR allein. Mäuse überleben können viel längere Ischämie und neigen dazu, mehr schwere posttraumatische Fibrose zu entwickeln. Mit dem gleichen Zeitraum von Ischämie, Mäuse, einseitige Ent Ischämie ausgesetztlop schwerer Fibrose als bilaterale Ischämie oder Ischämie mit einseitiger Nephrektomie 8 wird so auch dieses Modell als ein Modell der post-AKI Fibrose eingesetzt. Der Nachteil ist, dass es nicht möglich ist, die funktionelle Erholung nach einseitiger IR Verletzung beurteilen, so gibt es keine Möglichkeit, die Beurteilung der Schwere der Verletzungen, ohne Ernte Nierengewebe und die möglicherweise nicht für längerfristige Untersuchungen möglich. Aus diesem Grund haben wir ein Protokoll zur Induktion schwere einseitige IR Verletzungen und Beurteilung der Nierenfunktion Erholung, indem Sie kontralaterale Nephrektomie von 8 Tagen nach der ursprünglichen Verletzung entwickelt. Mit diesem Ansatz 90-100% der Mäuse überleben die Verletzungen, aber wichtiger ist die Mäuse entwickeln sich sehr konsistent Nierenschädigung und kann für die funktionelle Erholung nach AKI von Day 9. Schulstufe (3B) ausgewertet werden. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit Studien an Ratten zeigt, dass mehr Nierenfunktion Stiel Klemme mal mehr Bestandteil Schädigung der Nierentubuli induzieren als kürzere Klemme ti mes zur induzieren mild bis AKI 9 moderieren. Darüber hinaus, im Einklang mit früheren Studien, 8, diese Mäuse entwickeln konsequent nach der Verletzung Nierenfibrose (die wir am Tag 28 bewertet). Dies ist nicht mit Proteinurie mindestens auf einer BALB / c Hintergrund verbunden: nach schweren IR-AKI am Tag 28 nach der Verletzung des Albumin / Kreatinin-Verhältnis beträgt 0,8 ± 0,04 (Mittelwert ± SEM in pg / mg). Es ist unbekannt, ob die schweren IR-AKI Modell zur Entstehung Proteinurie auf andere Hintergründe.
Abbildung 1. Anatomie der Maus Nierenhilus. Illustrieren Position des renalen Gefäßscheide in Bezug auf Harnleiter, perinephric Fettpolster und der Nebenniere mit Blutversorgung. Der schwarze Kreis markiert Position von Mikro-Klammer.
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Abbildung 2. Belichtung und Spannen von Mausniere Gefäßscheide (A), die Exposition der linken Niere nach der Sektion von Haut und Muskulatur;. (B - E), ist die linke Niere vorsichtig mit stumpfen Pinzette während Fettkapsel sorgfältig entfernt wird mit einer Pinzette gehalten. (F), Exposed links renalen Stiel (grüner Pfeil). Der weiße gestrichelte Linie kennzeichnet die erwartete Position des Harnleiters im perihiläre Fettpolster. Dieser Bereich muss mit der Gefäßklemme. (G), Micro-Klemme, die an der linken Niere. (H) zu vermeiden, geklemmt linken Niere mit der Haut bedeckt ist. (I), (G), Aussehen der Niere vor (A), während (I) und nach (G) nach Entfernen der Gefäßklemme.
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Abbildung 3. Funktionelle Erholung nach AKI. Änderungen in Serum-Kreatinin (durch enzymatische Assays) nach mäßigem IR Verletzungen (26 min Klemme Zeit) und kontralaterale Nephrektomie (A), Veränderungen in der Serum-Kreatinin nach Induktion der schweren Verletzungen (30 min Klemme Zeit) und kontralaterale Nephrektomie bei Tag 8 (B). Studies in BALB / c Mäusen, n = 6 pro Gruppe. Ergebnisse ausgedrückt als Mittelwert + /-SEM Serum-Kreatinin in mg / dl, gemessen mit enzymatischen Assays.
| Mausstamm | Ungefähre Maus Alter | Ungefähre Mausgewicht | Clamp-Typ | Unternehmen und Katalog-Nummer | Ischämie Zeit für schwere Verletzungen | Ischämie Zeit für mittelschwere Verletzungen | Heizkissen Temperatur |
| BALB / c 4-5 Monate | 25-28 g | Gefäßklemme (795 g Druck) | Roboz, RS-5459 | 30 min (oder länger) | 26 min | 38 ° C | |
| C57BL / 6 | 4-5 Monate | 24-27 g | Gefäßklemme (795 g Druck) | Roboz, RS-5459 | 29 min (oder länger) | 26 min | 38 ° C |
| CD1 | 4-5 Monate | 36-39 g | Gefäßklemme (75-85 g Druck) | FST, 18055-02 | 29 min (oder länger) | 26 min | 38 ° C |
Tabelle 1. Empfohlene Gefäßklemmen, Ischämie Zeiten und Maus-Stämme, die wir geprüft haben.
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Discussion
Wir beschreiben zwei Modelle der IR-AKI, um die Auswirkungen von mittelschweren und schweren Nierenschädigung zu studieren. Diese ermöglichen uns die konsistente und vorhersagbare Verletzungen mit geringer Sterblichkeit zu induzieren. Unser Protokoll beschreibt viele der Schwierigkeiten und Fallstricke traditionell mit diesem Modell verbunden. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass abhängig von der Länge der renalen Stiel Klemmung, das Modell eine weitgehend reversible milde und moderate AKI oder mehr schwere AKI induziert mit unvollständiger Erholung und anhaltende Nierenfibrose. Post-Verletzung Fibrose in der schweren IR-AKI Modell kann aus der Tatsache, dass die Mäuse in der Lage, mit mehr schweren Nierenschädigung überleben als dies möglich wäre, wenn diese länger ischämischen mal hatte bilateral durchgeführt worden sind führen. Allerdings gibt es auch Hinweise, dass das Vorhandensein eines unverletzten kontralateralen Niere für die ersten paar Tage nach der post-IR AKI Fibrose 8 erhöht. Während also die Mechanismen der Übersprechen zwischen unverletzten und verletzten Nieren bleiben Estab seineingesetzten Ausschusses kann dieser Mechanismus auch für eine verbesserte post-Verletzungen Fibrose, die wir beobachten in diesem Modell erklären. Während es zu prüfen, ob Erkenntnisse über diese Modelle in Therapeutika für Erkrankungen des Menschen übertragen werden können bleibt, bieten sie zuverlässige Modelle, Mechanismen und Therapeutika in IR-AKI studieren und post-AKI Nierenfibrose, ein klinisches Problem, das als abzeichnet verhindern wichtigen Beitrag bei der progressiven chronischen Nierenerkrankungen 10, 11.
Es gibt eine Reihe von kritischen Fragen, die die Schwere der AKI nach IR Verletzungen, die sorgfältig besucht werden müssen, können beeinflussen: Mausstamm 12, Geschlecht 13, 14 Jahren und das Gewicht der Maus, die Gefäßklemme verwendet, und Heizsysteme 15. Die Wahl der richtigen Gefäßklemmen kann eine Herausforderung sein. Wirkungsgrad der Klemme während des chirurgischen Eingriffs zu beurteilen, wie der Niere werden sollte gleichmäßig schwarz innerhalb von 5-10 min Klammer Platzierung. Es ist jedoch auch important dass die ganze Niere wird wieder durchblutet (Rosa up) schnell nach dem Entfernen der Klemme. Wir haben festgestellt, einige der schwereren Klemmen arbeiten gut mit bestimmten Stämmen (zB BALB / c und C57BL / 6), in anderen aber diese Klemmen induzieren Gefäßverletzung und renale Reperfusion ist oft unvollständig (zB: CD1). Eine Zusammenfassung der Gefäßklemmen, Klemme Gewichte (Druck) und Maus-Stämme, die wir geprüft haben, ist in Tabelle 1 aufgeführt. Für Heizungsanlagen, verwenden Sie eine Reihe von Forschern auto-regulierten Heizkissen mit Temperaturfühler zur Überwachung und Aufrechterhaltung konstanter Körpertemperatur. Während theoretisch vorteilhaft, fanden wir dieses Heizsystem kann in großen Schwankungen der Körpertemperatur über den Verlauf der Operation führen, was zu ganz unterschiedlichen Ergebnissen. Darüber hinaus sind diese Systeme relativ teuer sind, so kann die Zahl der Mäuse eine operieren kann zu einem beliebigen Zeitpunkt zu begrenzen. Nach einer Menge von Versuch und Irrtum haben wir auf eine konstante Temperatur bewegt, zirkulierende Wasser heating System. Der Hauptvorteil ist, dass die Heizplatte stabile Temperaturen (38 ° C) gibt in der Chirurgie. Mit dem großen Plattformbereich ist es auch möglich, auf eine Reihe von Mäusen auf der Oberfläche zu einem beliebigen Zeitpunkt (das ist eine Voraussetzung für die meisten praktischen IR-Untersuchungen AKI) zu betreiben. Having said that, wir fanden es immer noch erhebliche Variabilität in der Nachspielzeit nach moderater (aber nicht schwer) IR-AKI. Dies ist nicht ein Problem für Studien, in denen Behandlungen 24 Stunden oder mehr nach der Verletzung begonnen werden, da Mäuse entwickeln unzureichend oder übermäßig schwere Verletzungen können aus der Studie entfernt werden, bevor der Randomisierung durch die Analyse von Serum-Kreatinin. Allerdings, wenn Mäuse behandelt wird vor der Verletzung oder genetische Modelle werden verwendet, können zusätzliche Kontrollen experimentellen Variabilität eingeführt werden müssen. Da Schwankungen der Körperkerntemperatur wird wahrscheinlich den größten Anteil an Variabilität in sein IR Verletzungen in diesem Modell ein Ansatz zur Variabilität begrenzen würde zu mONITOR Kerntemperatur mit rektalen Sonden, um geeignete Tiere zu bestimmen, um ein-oder ausschließen in nachfolgenden Analysen. Die letzten Überlegungen sind Maus Alter, Gewicht und Geschlecht. Die meisten unserer Erfahrung hat mit BALB / c Mäuse gewesen, und wir haben die besten Ergebnisse erzielt werden, wenn Mäuse stabiles Körpergewicht erreichen um 4-5 Monate alt, mit einem Körpergewicht 25-28 g ~. Schließlich, da Männchen größere Anfälligkeit für IR-AKI als die Weibchen 13 haben, führen wir alle unsere Studien mit männlichen Mäusen nur. Allerdings gibt es weitere Variablen, die schwer zu kontrollieren sind, so dass jedes Labor und jeder Prüfer müssen präzise Clamp Zeiten und Bedingungen zu schaffen, um die Schwere der Verletzungen, die sie wünschen in der Maus-Stamm ihrer Wahl zu induzieren.
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Disclosures
Autoren haben keine Interessenkonflikte offen zu legen.
Acknowledgments
Dr. de Caestecker Labor wird durch NIH 1RO1 HL093057-01 und 1RC4DK090770-01 unterstützt. Dr. Harris 'Labor wird durch DK38226, DK51265, DK62794 und Finanzierung von der Veterans Administration unterstützt. Unterstützung für Maus Nierenschädigung Operationen, Serum-Kreatinin und Fibrose Assays auch von der Vanderbilt O'Brien Kidney Injury-Center Zuschuss 1P30 DK079341 vorgesehen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine (anesthetic) | Webster Veterinary | 07-881-9413 (100 mg/ml) | Final concentration 30 mg/ml Ketamine with 3 mg/ml Xylazine administered at 3-4 ml/kg (100 mg/kg Ketamine and 10 mg/kg Xylazine) |
| Xylazine (analgesic) | Webster Veterinary | 07-808-1939 (100 mg/ml) | As above |
| Antisedan (anti-Xylazine) | Webster Veterinary | 07-867-7097 (5 mg/ml) | Optional: to reverse effects of Xylazine in order to increase the rate of recovery after surgery Use 0.5-0.7 mg/kg |
| Buprenorphine (analgesic) | Bedford Laboratories | NDC 55390-100-10 (0.3 mg/ml) | Dose 0.05-0.1 μg/g every 8-12 hr. Make up a 1:5 dilution in sterile normal saline preoperatively and give 2.5-5 μl/g of the diluted solution. |
| Ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17033-211-38 | |
| Betadine swab sticks | Purdue Products L.P. | NDC 67618-153-01 | |
| Nolvasan Surgical Scrub | Pfizer Animal Care | 300253 | |
| Table 2. Drugs and solutions for I/R surgery. | |||
| Iris Scissors | Integra Miltex | VWR 21909-404 | For skin and muscle dissection |
| Curved iris forceps | FST | 11065-07 | To hold skin and muscle, to remove peri-nephric fat |
| Blunt forceps | ROBOZ | RS-5228 | To manipulate kidneys |
| Vascular clamp (795 g pressure) | ROBOZ | RS-5459 | Good for C57BL/6 and BALB/c mice strains |
| Schwartz clip applying forceps | ROBOZ | RS-5450 | For RS-5459 clamps |
| Vascular clamp (75-85 g pressure) | FST | 18055-02 | Optimal for CD1 mice strain, but also can be used for C57BL/6 and BALB/c |
| Micro-Serrefine Clamp Applicator-14 cm with Lock | FST | 18056-14 | For FST 18055-02 clamps |
| Gayman T/Pump (water-bath heated platform) | Braintree Scientific | TP-650 | The water heater is set at 38 °C 1 hr prior surgery |
| 15" W x 24" Heated platform | Braintree Scientific | HHP-2 | Connect to Gayman heated water pump |
| Heating pad | Braintree Scientific | Model 39DP | Uses microwave for heating. This is useful for warming during recovery |
| Absorbable suture (Vicryl 5-0) | ETHICON | VCP834G | For fascia and muscle |
| Non-absorbable suture: monofilament nylon MONOMID 6/0 660B) | CP Medical | CP-B660B-03 | For skin |
| Halsey needle holder: Tungsten Carbide/13 cm | FST | 12501-13 | To hold suture needles |
| Timer | FST | 06-662-3 | To quantify ischemia time |
| Hot bead sterilizer | FST | 18000-45 | To sterilize instruments between mice if you are performing multiple surgeries (it is not sufficient to soak instruments in ethanol) |
| Electric razor | Braintree Scientific | CLP-22965 | |
| Tape | Durapore | 1538-0 | |
| 1 ml Syringe | EXELint | 26044 | |
| Sterile cotton tipped applicators | Kendall | 8884541300 | |
| Absorbent BenchPad | VWR | 56617-014 | |
| Surgical drapes | VWR | 21902-985 | Need to be autoclaved |
| 2’’ x 2’’ Gauze Pads | Medi-First | 60673 | |
| Sterile gloves | Cardinal Health | 2D7251 | |
| Table 3. Equipment and instruments for I/R surgery. | |||
References
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