Summary
Protocoles pour la préparation efficace des échantillons homogènes de tétranyques, l'infestation de plantes expérimentales et l'évaluation des dommages aux plantes, tel que requis pour les études d'interaction plante-ravageur ont été développés.
Abstract
Le tétranyque à deux points, Tetranychus urticae, est un herbivore polyphage arthropodes omniprésente qui se nourrit d'une remarquable large éventail d'espèces, avec plus de 150 de la valeur économique. Il est un ravageur important des cultures de serre, en particulier dans les solanacées et les cucurbitacées (par exemple, les tomates, aubergines, poivrons, concombres, courgettes) et les plantes ornementales (par exemple, roses, chrysanthèmes, œillets), les cultures annuelles (telles que le maïs, le coton, soja et la betterave à sucre), et dans des cultures pérennes (luzerne, fraises, raisins, agrumes, et les prunes) 1,2. En plus de la polyphagie extrême qui en fait un nuisible agricole importante, T. urticae a tendance à développer une résistance à un large éventail d'insecticides et acaricides qui sont utilisés pour le contrôle 3-7.
T. urticae est un excellent organisme expérimental, car elle a un cycle de vie rapide (7 jours à 27 ° C)et peut être facilement maintenue à une densité élevée dans le laboratoire. Méthodes de dosage de l'expression du gène (y compris l'hybridation in situ et dans la coloration des anticorps) et pour inactiver l'expression de gènes endogènes de tétranyques en utilisant l'interférence de l'ARN ont été mis au point 10.8. Récemment, la séquence complète du génome de T. urticae a été rapporté, la création d'une opportunité de développer ce ravageur herbivore comme un organisme modèle de ressources génomiques équivalentes qui existent déjà dans certains de ses plantes hôtes (Arabidopsis thaliana et la tomate Solanum lycopersicum) 11. Ensemble, ces organismes modèles pourraient fournir des indications sur les bases moléculaires des interactions plante-parasite.
Ici, une méthode efficace pour la collecte rapide et facile d'un grand nombre d'acariens femelles adultes, leur application sur une plante hôte expérimental, et l'évaluation des dommages de l'usine en raison de l'acarien alimentation sont décrits. Le protocole présenté enables collection rapide et efficace de centaines de personnes à tous les stades de développement (œufs, larves, nymphes, adultes mâles et les femelles) qui peut être utilisé pour l'application expérimentale ultérieure.
Introduction
Interaction plante-ravageur est un sujet de grande importance scientifique et économique. Il a été historiquement étudiée en utilisant les deux plantes de culture (comme la tomate) et la plante modèle, R. thaliana. Dans les deux cas, la sensibilité de la plante à herbivore peut être mesuré soit directement par l'évaluation du phénotype de la plante après herbivore attaque ou indirectement par le biais de l'évaluation de la performance des ravageurs.
Les mesures directes de la sensibilité de la plante ont été utilisées précédemment pour un certain nombre d'espèces d'insectes nuisibles en utilisant une gamme de méthodes. Par exemple, le broutage des larves de lépidoptères est mesurée comme une estimation de la partie du tissu de la plante consommée soit par Plutella xylostella (teigne) ou Trichoplusia ni (arpenteuse du chou) à l'œil nu à l'aide d'une grille 12. En outre, il existe des méthodes qui utilisent l'imagerie numérique de l'endommagement de la feuille postérieure avec une analyse quantitative de l'image. Ces méthodes ont été utilisées dansétudes de A. interaction thaliana avec Frankliniella occidentalis (les thrips des petits fruits) 13, Scaptomyza flava (drosophile feuille-mines) 14, et T. ni 15.
Les mesures indirectes de la sensibilité de la plante sont largement utilisés dans les études d'interaction plante-parasite. Par exemple, la sensibilité de A. thaliana à Myzus persicae puceron herbivores est généralement évaluée par l'analyse de la fécondité des ravageurs et la description de la morphologie d'une plante après interaction 16,17. Un autre indicateur indirect typique de A. thaliana sensibilité à un parasite est une évaluation du poids sec ou humide de la herbivore. Ce paramètre est couramment utilisé pour caractériser les herbivores de lepidoterans, Pieris rapae tels que (petit blanc), P. xylostella, ou T. ni à leur larves ou des pupes en scène 15,17.
Les acariens sont des cellules contenu feeders. Dommages aux acariens est reconnu comme une collection de taches chlorotiques dont la couleur va du blanc au vert pâle. La sensibilité d'une plante hôte à tétranyque herbivores a déjà été évalué, soit indirectement par le biais de l'analyse de jours de performance de tétranyque post-infestation 18,19, ou directement en utilisant morphologie des plantes semaines post-infestation 18 ou en utilisant un appareil d'imagerie numérique de feuilles exposées aux acariens pour les jours à la suite l'analyse automatique d'image 19. Ces méthodes ont été mises au point et utilisées pour des études d'interactions entre les plants de tomates et T. urticae, et généralement utilisé un petit nombre de tétranyques (5-15 par traitement) qui ont été collectées à partir de la population d'acariens mixte et ont été placés sur la surface de la feuille à l'aide d'une brosse à poils doux. Cependant, ces procédés ne conviennent pas pour des études où un plus grand nombre d'acariens doivent être appliquées. En outre, alors que le traitement direct des images de feuilles dans le logiciel d'analyse d'imagetels que Adobe Photoshop (San Jose, CA) ou ImageJ 20 peuvent être utilisés pour l'analyse des dommages de tomate, ces protocoles doivent être modifiés pour être appliquée à des feuilles qui ont une plus grande réflectivité de la surface ou sont légèrement colorés et avoir trichomes très visibles ( par exemple, A. thaliana) qui interfèrent avec la sélection automatique des taches chlorotiques qui marquent dommages aux plantes. En outre, le stade de développement des acariens qui peuvent être facilement utilisés avec les méthodes précédentes est limitée aux femmes adultes les plus répandues et facilement identifiables et s'oppose à l'utilisation d'autres stades de développement.
La première étape critique vers l'analyse à haut débit de l'usine-acarien interaction est d'établir des protocoles simples et robustes et reproductibles pour contester les plantes avec les acariens et fiable d'évaluer les résultats d'interaction.
Dans cette vidéo, une méthode efficace pour la collecte rapide et facile d'un grand nombrenombre d'acariens femelles adultes, leur application sur une plante hôte expérimental, et l'évaluation des dommages de l'usine en raison de l'acarien alimentation sont décrits. Le protocole présenté permet la collecte rapide et efficace de centaines de personnes à tous les stades de développement (œufs, larves, nymphes, adultes mâles et les femelles) qui peut être utilisé pour l'application expérimentale ultérieure. En outre, ces protocoles peuvent être appliqués à n'importe quelle plante acarien hôte, mais sont particulièrement démontré dans le cas de A. thaliana.
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Protocol
1. Maintien de la tétranyque population
REMARQUE: Les acariens sont élevés sur la Californie de haricots rouges (Phaseolus vulgaris).
- Faire pousser des plantes à partir de graines de soja pour 2-3 semaines avant l'infestation.
- Intermix ces plantes avec les plantes infestées; acariens adultes seront rapidement coloniser matériel végétal frais.
- Enlever les vieux plants de haricots infestés tous les 7-10 jours, pour les remplacer par des plantes fraîches.
2. Collecte femelle adulte acariens
- Mite Collection en utilisant la méthode de lavage
- Pour recueillir les acariens, placez un plant de haricot frais en contact avec les plantes infestées 1 à 2 jours avant l'expérience.
- Utilisez 20 à 30 plants de haricots frais pour recueillir 1.000 à 2.000 femmes adultes acariens.
- Préparer une solution de Tween 20 à 0,001% en utilisant l'eau du robinet à température ambiante.
- Laver les plants de haricots infestés dans la solution de Tween 20, en utilisant 2 à 3 plantes à la fois.
- Terminé l'étape 2.1.4 dans les 10 min pour éviter la mortalité des acariens.
- Isolation des adultes femelles acariens par filtration de la suspension Mite à travers des tamis de maillage défini
- Préparer tamis de la taille des mailles suivantes: 500 um (pour enlever les débris) et 300 um (pour recueillir les acariens femelles adultes) (figure 1A).
- Filtrer la suspension à travers le tamis de 500 um.
- ReFilter la suspension à travers le tamis de 300 um. Les femelles adultes seront conservés.
- Trempez un tamis de 300 um d'acariens femelles adultes dans l'eau du robinet pour éliminer le Tween 20.
- Etaler les acariens en une seule couche dans le bas du tamis.
- Utilisez une serviette en papier pour enlever l'excès d'eau de la maille et les côtés du tamis. NOTE: Ceci est fait parce acariens doivent sécher rapidement afin de récupérer.
- Préparer un ensemble tel que représenté sur la figure 1B; ce qui permettra acariens de se déplacer librement, mais les empêcher de s'échapper.
- Placer le tamis avec des acariens sur le dessus du tamis qui est utilisé en tant que support.
- Entourez tamis de fond avec de l'eau pour empêcher les acariens de se disperser. REMARQUE: Les acariens va commencer la récupération après environ 5 min. Après environ 30 min, le nombre d'acariens mobiles est suffisant pour commencer la collection (figure 1D). Acariens doivent être recueillies dans 1 heure, car ils produisent de la soie qui va interférer avec la collection.
3. Infestation des plantes par des acariens
REMARQUE: Une fois les acariens femelles adultes ont récupéré, ils peuvent être utilisés pour l'infestation de la plante. Il ya deux méthodes utilisées pour infester les plantes expérimentales avec les acariens femelles adultes: a) à l'aide d'un pinceau fin (section de protocole 3.1) et b) à l'aide d'une pompe ou d'une ligne de vide (section du protocole 3.2).
- Infestation par les acariens à l'aide d'un pinceau
REMARQUE: Araignée infestation par les acariensavec une brosse est utilisée pour l'application d'un maximum de 30 acariens par plant.- Utilisez un cheveu doux ronde art pinceau de taille 00 ou plus fin.
- Mouiller la brosse avec de l'eau du robinet RT.
- Ramasser délicatement les acariens de la tamis en utilisant la pointe du pinceau et de les transférer à l'usine.
- Infestation par les acariens à l'aide d'une pompe
REMARQUE: l'infestation des plantes par les acariens recueillies par une ligne / pompe à vide est utilisé lorsque plus de 30 acariens sont appliquées. Par ce procédé, une pompe à vide pour le ramassage de composants microélectroniques ou une ligne de vide peut être utilisé. Il est important de maintenir constant le débit d'air et d'une résistance suffisante (2-4 psi).- Attacher un embout de pipette de 1 ml pour le tube qui relie à la conduite de pompe à vide ou à l'aide d'une coupe de 1,5 ml de tube de centrifugation à fond comme un adaptateur entre le tube / pompe à vide et la pointe.
- Placez un morceau de serviette en papier entre la pointe de la pipette et l'adaptateur (1,5 ml de tube de centrifugation). NOTE: le but est de piéger les acariens à l'intérieur til embout de pipette pendant le processus d'aspiration et également de réduire le débit d'air (figure 1C).
- Collecter les acariens directement depuis le tamis à l'aide de la pointe de pipette.
- Sinon, recueillir les acariens un par un à partir de feuilles infestées à l'aide d'un stéréoscope.
- Lorsque le nombre requis d'acariens ont été recueillies, retirer l'embout de la pipette à partir du tube, en s'assurant que le morceau de serviette en papier à l'arrière de la pointe de la pipette n'est pas perturbé.
- Collecter les acariens en tapant sur la pointe de la pipette et l'agglutination des acariens ensemble. Ensuite, placez-les sur la feuille; quelques secondes, les acariens vont commencer à se disperser sur la feuille.
4. Enregistrement et l'évaluation des dommages plantes
- Dommages de l'usine d'enregistrement
REMARQUE: Pour A. thaliana, dommages aux plantes est évaluée après 4 jours d'acariens alimentation. Dommages est enregistré comme la surface totale des taches chlorotiques. Pour la mesure des dégâts, l'ensemble de la rosette est coupé et balayé.paramètres d'analyse décrites sont d'un scanner Epson V30 mais agira comme un bon point de départ pour tout scanner à plat similaire. Gardez paramètres de balayage constant pour toutes les expériences permettant la comparaison entre les expériences individuelles pistes.- Couvrir vitre du scanner avec une feuille de transparence pour éviter de contaminer la surface du scanner avec du matériel végétal.
- Couper une rosette entière et les placer sur la vitre du scanner afin adaxial côté (supérieur) de feuilles sont confrontés à la source de lumière du scanner et de l'élément de capture. Alternativement, si rosettes sont trop denses pour capturer feuilles individuelles sans chevauchement, disséquer la rosette en feuilles ou des groupes de feuilles non-chevauchement avec des ciseaux fins individuelles avant de placer sur la vitre du scanner. Rosettes multiples peuvent être analysés simultanément.
- Couvrir rosettes ou des feuilles avec un morceau de papier blanc pour empêcher l'adhésion et la contamination de la capot du scanner.
- Fermer le couvercle du scanner et effectuer une analyse avec les paramètres suivants: Résolution: 1,200 dpi; Mode couleur: Adobe RVB; Luminosité: 25; Type de fichier: JPEG de qualité maximale.
- Enregistrer des fichiers image pour une analyse ultérieure de dommages.
- Dommages de l'usine de quantification
REMARQUE: La zone de dégâts est calculé manuellement à l'aide de Photoshop. En raison des grandes différences dans la forme des feuilles et de l'intensité des couleurs et des symptômes à la suite de l'alimentation des acariens, des méthodes automatiques ne sont pas fiables. Ainsi, une méthode de grille est utilisée pour évaluer les dégâts de la plante:- Ouvrez l'image de la plante avec Photoshop.
- Créez un nouveau calque, puis superposer l'image numérisée avec une grille de 0,25 mm x 0,25 mm divisions (Voir ou Affichage - Afficher - Grille, raccourci clavier Ctrl + ').
- Sur une couche de revêtement, marquer les zones de feuilles endommagées en utilisant un point (utiliser le "Outil Crayon", raccourci clavier B). Utiliser un seul point pour chaque carré de la grille au-dessous de laquelle il ya des dommages couvrant plus de la moitié de l'unité de grille. La taille du point est définie en pixels (par exemple,
- Lorsque toutes les cases de la grille présentant des défauts de l'usine couvrant au moins la moitié de l'unité de grille sont marqués d'un point, utilisez l'outil de l'histogramme (Fenêtre - histogramme) pour déterminer le nombre total de pixels sur la couche. L'outil de l'histogramme permet de se mesurer le nombre de pixels. Etant donné que chaque point est représenté par un nombre constant et connu de pixels, l'outil d'histogramme mesurer le nombre total de pixels, représentant le nombre total de points, et, par extension, le nombre total de carrés marqués.
- Calculer le nombre de "points" marqués à l'aide de la formule:
Nombre de points = nombre total de pixels / nombre de pixels par point. - Calculer la surface totale de dommages en multipliant le nombre de points marqués sur l'image de la zone d'une place de la grille, comme un point correspond à une case de la grille.
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Representative Results
Utilisation de 20 à 30 plants de haricots infestés, on peut recueillir près de 2.000 femmes adultes acariens en utilisant des tamis. Le temps nécessaire pour infester 10 plantes avec 20 acariens par plant est d'environ 15 min si vous utilisez une brosse à transférer les acariens. Combinaisons de collecte et les méthodes d'application sont présentés dans la figure 2.
Ce protocole génère des résultats reproductibles de dégâts à la plante, ce qui démontre que les acariens sont collectées de l'état physiologique similaire et adapté aux études plante-araignée rouge interaction (Figure 3). Pour évaluer la reproductibilité protocole, acariens femelles adultes ont été recueillies à l'aide de la méthode de lavage où 20 acariens ont été placés sur les feuilles de la rosette de la vieille 3 semaines A. plantes thaliana (adhésion Col-0) avec une brosse humide. Les plantes traitées ont été balayés 4 jours postinfestation et la zone de dommages a été quantifiée en utilisant les techniques décrites ci-dessus. Comparaison des résultats répétés d'expérimentation a été effectuée à l'aide de variance.
A titre d'exemple de l'application expérimentale, nous avons évalué la variation naturelle de la sensibilité à l'acarien herbivores sur 3 A. thaliana adhésions par application de 20 tétranyques femelles par plante à l'aide d'une brosse humide et dommages d'enregistrement 4 jours après l'infestation. Aspect typique de dommages dans les images numérisées est représenté sur la figure 3B. Ensuite, la quantification de données sur les dommages peuvent être présentées sous forme de graphique à barres ou une boîte à moustaches et analysé par la méthode statistique de choix (figure 3C). Dans cet exemple, ANOVA suivie par le test de Tukey HSD ont été utilisées pour l'analyse des données.
Figure 1. Expérimental mis en place pour l'isolement des acariens femelles adultes. (A) Ensemble de tamis pour permettre la séparation des différents tétranyque développementétapes. (A. 0.5 mm taille d'ouverture - élimine les débris de l'acarien suspension b 0,3 mm -.. Recueille acariens femelles adultes c 0,2 mm -.. Recueille les jeunes femmes, les hommes, et les nymphes d 0,16 mm -.. Recueille les larves et les nymphes e.. 0,1 mm -.. recueille les œufs) (B) Configuration utilisée pour permettre de récupérer les acariens sans échapper après lavage et filtration (C) Configuration utilisée pour recueillir les acariens en utilisant une pompe (D) Sieve avec femelle adulte acariens mobile prêt à être recueillies..
Figure 2. Des stratégies possibles pour isoler les acariens femelles adultes, selon le nombre d'acariens à appliquer. Si la conception expérimentale nécessite l'utilisation d'un grand nombre de adultes tétranyques femelles, l'approche la plus efficace est d'utiliser la méthode de collecte de pompe à vide directement à partir de feuilles de haricot.Si une expérience nécessite l'utilisation d'un stade de développement autres que les femelles adultes ou un petit nombre de personnes doivent être soigneusement placé les jeunes plants, il est recommandé d'effectuer la collecte et fractionnement de tétranyque stades de développement de l'approche de lavage en utilisant des tamis suivie par infestation avec une brosse.
Figure 3. Des résultats représentatifs. (A) La reproductibilité des résultats expérimentaux. zone de dommages mesurée sur le vieux trois semaines A. plantes thaliana, l'adhésion Col-0, 4 jours après l'application de 20 tétranyques femelles. La comparaison des résultats d'expériences répétées a été effectuée en utilisant ANOVA (n = 6, F = 0,621, P = 0,735). (B et C) La variation naturelle de la sensibilité à l'acarien herbivores sur 3Adhésions A. thaliana: Col-0, Ler-0, et WS2 (B) Apparition de plantes après tétranyque herbivores.. Les flèches rouges pointent vers les zones endommagées typiques. (C) Les différences de sensibilité à l'acarien herbivores comme évalués par la zone de dégâts. La sensibilité à la tétranyque herbivores varie considérablement d'adhésions (ANOVA, n = 6, F = 13,4, P = 0,0004). Les lettres indiquent les différences significatives entre les génotypes à P <0,05 (test de Tukey HSD). Valeurs représentées graphiquement sont la moyenne ± erreur standard de la moyenne.
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Discussion
Cette vidéo montre protocoles utilisés pour isoler et à infester les plantes avec un grand nombre d'acariens femelles adultes. Bien que nous avons présenté ce protocole en utilisant A. thaliana, il peut être utilisé pour n'importe quel système d'interaction plante-araignée acariens et est actuellement appliquée avec succès aussi sur la tomate et la vigne (Vitis vinifera) plantes. Les rendements de protocole résultats reproductibles, ce qui indique que les acariens sont collectées de l'état physiologique comparable (Figure 3).
Bien que ces protocoles sont simples à réaliser, plusieurs étapes critiques exigent une attention particulière car ils auront une incidence sur la récupération acariens. acariens de lavage des feuilles doivent être fait sur un maximum de trois plants de haricots simultanément et doit être terminé dans les 10 min avec de l'eau à température ambiante. En outre, les acariens doivent être réparties sur un tamis pour un séchage rapide. Si la récupération des acariens n'est pas satisfaisant, il est important de vérifier si la quantité recommandée de détergent Tween 20 nous a étéed et si le détergent a été totalement supprimé au cours de l'étape de rinçage.
Il ya deux limites majeures au protocole présentées: a) la collecte des acariens par pompe fonctionne bien pour les collections de plus de 30 acariens mais la collecte d'un plus petit nombre d'acariens nécessite l'utilisation d'une brosse et est relativement lent; Cependant, la collecte et la concentration acariens adultes par l'intermédiaire du procédé de lavage facilite grandement leur application; b) l'analyse des dommages par entailler la surface de taches chlorotiques peut être un temps et l'étape de l'effort de consommer; effort futur doit fixer dans l'identification des gènes marqueurs qui peuvent être utilisés comme une mesure d'acarien alimentation.
Par rapport aux méthodes déjà publiées, la méthode présentée de collecte de tétranyque offre un avantage de recueillir un grand nombre d'individus viables et une séparation efficace des phases de développement en une seule étape. En outre, l'évaluation des dommages aux plantes phénotype dans l'interaction plante-parasite par inspecti visuelleou sur l'analyse numérique de l'image est typiquement la première étape d'une analyse complexe qui implique une certaine forme d'moléculaire de lecture (tels que l'analyse de l'expression du gène ou d'un métabolite de profilage). Les protocoles actuels sont adaptés à la demande de quelques acariens et la collecte des matières jours post-infestation qui sont utiles pour l'analyse des interactions à long terme entre la plante et les ravageurs; Toutefois, ce protocole permet d'appliquer une centaines d'acariens simultanément pour capturer efficacement les réponses des plantes qui se produisent pendant une période de temps plus courte (h) et au niveau du site d'alimentation.
En résumé, les méthodes d'application de femelle adulte acariens sur les plantes hôtes et l'évaluation des dommages aux plantes ont été décrites. Ces protocoles sont essentiels pour des expériences visant à comprendre la base génétique et moléculaire de l'interaction entre les plantes et le tétranyque à deux points.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plant material: | |||
| California red kidney bean | Stokes, Thorold, ON, Canada | 2 week old, well infested with spider mites 2 or 3 days before use. Other cultivars of Phaseolus vulgaris can be used. | |
| Chemicals: | |||
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | 1% stock solution is prepared to simplify aliquoting |
| Tap water | At room temperature, heat- and cold-shock affect mite survival rate and performance | ||
| Other materials and equipment: | |||
| Plastic tray | |||
| Set of scissors | |||
| 2 L beakers | |||
| Paper towels | |||
| Sets of sieves | Manufactured in house | Detailed instructions are available | |
| Thin brush | |||
| Pipettes | |||
| Pipette tips | 0.2 and 1 ml | ||
| 1.5 ml centrifuge tubes | |||
| Air pump | Aquarium type pump with inverted air flow. Vacuum line can be used. Required pressure drop is approx. 2-4 psi | ||
| Stereoscope | |||
| Scanner | Epson | V30 | Any flatbed scanner allowing necessary degree of control over scan quality. We use Epson V30 for our experiments. |
| Computer | Windows or OS X PC which is compatible with scanner hardware and Adobe Photoshop software. | ||
| Adobe Photoshop software | Adobe Systems Inc., San Jose, CA, USA | various | Any version with Histogram tool included. |
References
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