Summary
植物害虫の相互作用の研究のために必要とされる効率的なハダニの均質な試料の調製、実験的な植物の侵入、および植物の損傷の評価のためのプロトコルが、開発された。
Abstract
ナミハダニ、 ナミハダニは 、経済的価値の150以上を有する種の著しく幅広い、上フィードユビキタス多食節足動物草食動物である。それは、特にナス科およびウリ科トウモロコシ、綿など（ 例えば 、トマト、ナス、ピーマン、キュウリ、ズッキーニ）、温室効果観賞植物（ 例えば 、バラ、キク、カーネーション）、毎年恒例の畑作物（内、温室作物の主要害虫である大豆、テンサイ）、および多年生の文化（アルファルファ、イチゴ、ブドウ、柑橘類、およびプラム）の1,2。それが重要な農業害虫になり、極端な過食に加えて、T.ナミハダニ 3-7 は、その制御のために使用される殺虫剤および殺ダニ剤の広い配列に耐性を発現する傾向を有する。
ナミハダニは、（27℃で7日間）迅速なライフサイクルを有するように、優れた実験的な生物であるかつ容易に実験室での高密度に維持することができる。 （ インサイチュハイブリダイゼーションおよび抗体染色を含む）の遺伝子発現をアッセイし、RNA干渉を用いたハダニ内因性遺伝子の発現を不活性化するための方法が8-10開発されている。最近では、Tの全ゲノムシーケンスナミハダニはすでにその宿主植物（ シロイヌナズナやトマトナス·リコペルシカム ）11の一部に存在する同等のゲノムリソースを持つモデル生物として、この害虫草食動物を開発する機会を作成し、報告されている。一緒に、これらのモデル生物は、植物害虫の相互作用の分子基盤への洞察を提供することができます。
ここでは、大規模な成人女性のダニの数、実験プラントホスト上の応用、およびハダニ供給による植物被害の評価を迅速かつ簡単に収集するための効率的な方法が記載されている。提示されたプロトコルエンその後の実験の用途に用いることができる任意の発達段階（卵、幼虫、若虫、成人男性、女性）で個人の何百もの高速で効率的な収集をディセーブルさ。
Introduction
植物の害虫の相互作用は非常に科学的、経済的に重要なトピックである。それは、歴史的に（例えばトマトなど）の両方作物植物とモデル工場、Aを用いて検討したシロイヌナズナ 。両方の場合において、草食動物に対する植物の感受性は、草食動物の攻撃の後にまたは間接的に害虫の性能の評価を介して直接植物表現型の評価のいずれかを介して測定することができる。
植物の感受性の直接測定は、方法の範囲を使用して害虫種の数のために、以前に使用した。例えば、鱗翅目の幼虫の食害は、グリッド12の助けを借りて、肉眼でコナガ （コナガ）またはトリコプルシア （キャベツルーパー）のいずれかで消費される植物組織の一部の推定として測定される。また、その後の定量的画像解析による葉の損傷のデジタル画像を利用する方法があります。このような方法はに使用したAの研究アザミウマ （ミカンキイロアザミウマ）13、Scaptomyzaフラバ （リーフマイニングショウジョウバエ）14、およびTとシロイヌナズナの対話NI 15。
植物の感受性の間接的な測定は、広く植物害虫の相互作用の研究に使用される。 A.の例については、感受性シロイヌナズナアブラムシモモアカアブラムシの食害を桃には、一般的に害虫の繁殖力との相互作用16,17の後の植物の全体の形態の記述の分析を通じて評価される。 Aの別の典型的な間接的な指標害虫へのシロイヌナズナの感受性は、草食動物の乾燥や湿潤重量の評価である。このパラメータは、一般に、 モンシロチョウ （小白）、Pとして、lepidoteransの草食性を特徴付けるために使用されているコナガ 、またはTその幼虫や蛹の段階15,17のNI。
ハダニは、セルの内容FEですeders。ダニによる損傷は、緑の淡い白から色の範囲退緑斑点の集合体として認識されている。ハダニの食害に植物宿主の感受性は、以前にハダニのパフォーマンス日数の分析を通じて間接的に評価した後に侵入18,19、または直接植物週間後蔓延18の全体の形態を使用したり、公開される葉のデジタル画像を使用してその後の自動画像解析19日間ダニへ。これらのメソッドを開発し、トマト植物とTとの相互作用の研究のために使用されていたナミハダニ、典型的には、混合ダニ集団から集めた後、柔らかい毛ブラシを用いて、葉の表面上に配置したハダニの数が少ない（処置あたり5-15）を使用した。しかし、これらの方法は、ダニの大きい番号が適用される必要の研究には適していない。また、画像解析ソフトにおける枚葉画像の直接処理しながらアドビフォトショップ（サンノゼ、CA）又はImageJの20トマト損傷の分析のために使用することができるよう、これらのプロトコルは、表面のより大きな反射率を有するか、または軽く（着色及び視認性の高い毛状突起を有している、葉に適用するために変更が必要例えば 、 シロイヌナズナ ）植物の損傷をマーク退緑斑点の自動選択を妨害する。さらに、容易に以前の方法で利用することができハダニの発育段階が最も普及していると容易に識別成人女性に限定し、他の発達段階の利用を妨げるされています。
植物ハダニ相互作用のハイスループット分析に向けた最初の重要なステップは、ハダニを植物に挑戦し、確実な相互作用の成果を評価するために、再現性のあるシンプルで堅牢なプロトコルを確立することである。
このビデオ、大型のテンキーを迅速かつ簡単に収集するための効率的な方法では成人女性のダニのBER、実験プラントホスト上の応用、およびハダニ供給による植物被害の評価が記載されている。提示されたプロトコルは、その後の実験の用途に用いることができる任意の発達段階（卵、幼虫、若虫、成人男性、女性）で個人の何百もの高速で効率的な収集を可能にします。さらに、これらのプロトコルには、任意のダニ宿主植物に適用することができるが、特にA.例において実証されているシロイヌナズナ 。
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Protocol
ハダニ人口の1。メンテナンス
注：ハダニは、カリフォルニア赤インゲン豆（ インゲンマメ ）で飼育されています。
- 前侵入に2〜3週間種子からマメ植物を育てる。
- 侵入された植物との混在は、これらの植物;大人のダニが急速に新鮮な植物材料を植民地化します。
- 新鮮な植物に置き換え、7〜10日ごとに古い寄生さマメ植物を除去します。
2。成人女性ダニの収集
- 洗濯方法を使用してコレクションをダニ
- ダニを収集するには、1から2日前までに、実験に寄生した植物と接触して、新鮮な豆の植物を置く。
- 1000〜2000の大人の女性のダニを収集するために20から30の新鮮な豆の植物を使用してください。
- RTで水道水を使用して0.001％でのTween 20の溶液を調製する。
- 一度に2から3の植物を使用して、トゥイーン20溶液中に出没マメ植物を洗う。
- ダニの死亡を回避するために10分以内に完了するステップ2.1.4。
- 定義されたメッシュサイズ篩ダニ懸濁液の濾過により成人女性ダニの分離
- （破片を除去するために）500ミクロンと300ミクロン（成人女性のダニを収集する）（ 図1A）：以下のメッシュサイズのモレキュラーシーブを準備します。
- 500ミクロンのふるいを通して懸濁物をろ過する。
- 300ミクロンのふるいを通して懸濁物を濾過し直して。大人の女性のダニは保持されます。
- トゥイーン20を除去して清潔な水道水における成人女性のダニを300ミクロンのふるいを浸します。
- ふるいの底に単層でダニを広げた。
- ふるいのメッシュと側面から余分な水を除去するために紙タオルを使用してください。 NOTE：ダニを回復するために迅速に乾燥する必要があるため、これが行われる。
- 図1に示すように、組立体を調製B;これは、ダニが自由に移動できるようになりますが、それらは逃げるのを防ぎます。
- 支持体として使用されているふるいの上にダニの篩を配置します。
- 飛散ダニを防ぐために水で底のふるいを囲む。注：ダニは約5分後に回復を開始します。約30分後、移動ダニの数は、収集（ 図1D）を開始するのに十分である。彼らは、コレクションを妨害する絹を生産するようにダニは、1時間以内に収集する必要があります。
ダニと3。プラント寄生
NOTE：成体雌ダニを回収した後、それらは植物の侵入のために使用することができる。 A）細いブラシ（プロトコルセクション3.1）を使用して、aとb）ポンプまたは真空ライン（プロトコルセクション3.2）を使用して：成人女性のダニによる実験植物をはびこるために使用する2つの方法があります。
- ブラシを使ってダニ寄生
注：ハダニの侵入ブラシで植物当たり最大30ダニの適用のために使用される。- サイズ00や細かい柔らかい毛ラウンドアートブラシを使用してください。
- RTの水道水でブラシを濡らす。
- そっとブラシの先端を使用してふるいからダニをピックアップし、工場に転送。
- ポンプを使用して侵入をダニ
NOTE：30以上のダニが適用されるときに、ポンプ/真空ラインにより集めダニによる植物の侵襲が使用される。この方法では、マイクロエレクトロニクス部品のピックアップや真空ライン用の真空ポンプを用いることができる。これは、空気の流れを一定にし、十分な強度（2-4 PSI）を維持することが重要である。- ポンプ/真空管とチップの間のアダプタとして下部に1.5ミリリットルの遠心管のカットを使用してポンプや真空ラインに接続しているチューブに1ミリリットルピペットチップを取り付けます。
- ピペットチップおよびアダプタ（1.5ミリリットル遠心管）との間に紙タオル一枚を置きます。注：この目的は、Tの内部トラップダニにある彼は、吸引プロセス中にチップをピペットし、また空気の流れ（ 図1C）を低減する。
- ピペットチップを用いてふるいから直接ダニを集める。
- または、ステレオスコープを使用して寄生した葉からダニを一つずつ集める。
- ダニの必要数は、収集された際に、ピペットチップの背面に紙タオルの一部が乱さであることを確認して、チューブからピペットチップを取り外します。
- ピペットチップをタップし、一緒にダニに凝集によってダニを集める。その後、葉の上に置きます。秒以内に、ダニは葉の上に分散させるために開始されます。
4。記録との評価植物被害
- 記録植物被害
注：Aのシロイヌナズナは 、植物の損傷はダニ摂食の4日後に評価される。損傷が退緑斑点の総表面積として記録されている。損傷の測定のために、全体のロゼットを切断し、走査される。記載されスキャンパラメータは、エプソンV30スキャナ用ですが、任意の同様のフラットベッドスキャナのための良い出発点として機能します。個々の実験の実行との間の比較を可能にすべての実験のための一定のスキャンパラメータを保持します。- 植物材料を汚染するスキャナ表面を防止するために、透明シートでスキャナベッドをカバーしています。
- その葉の向軸（上）側は、スキャナの光源と撮像素子に直面しているスキャナベッド上の全ロゼットと場所をカットします。ロゼットが重複することなく、個々の葉を取り込むには余りにも密であれば別の方法として、スキャナベッドに置く前に細かいハサミで重複しない葉の個々の葉やグループにロゼットを解剖。複数のロゼットを同時にスキャンすることができます。
- の遵守やスキャナカバーの汚染を防止するために、白い紙とロゼットや葉をカバーしています。
- 閉じるスキャナカバーし、次のパラメータを指定してスキャンを実行します。解像度：1,200 DPI;カラーモード：Adobe RGBの;明るさ：25;ファイルタイプ：最大品質のJPEG。
- その後の被害の分析のための画像ファイルを保存します。
- 植物被害の定量化
NOTE：損傷の領域を手動でフォトショップを用いて計算される。原因ダニ供給の結果、葉の形や症状の色の強さに大きな差には、自動の方法は信頼性に欠けるた。従って、格子法は、植物の損傷を評価するために使用される。- フォトショップと植物の画像を開きます。
- 0.25ミリメートル×0.25ミリメートルの部門（ - ショー - グリッド、キーボードショートカットのCtrl + 'を表示またはディスプレイ）のグリッドでスキャンした画像をオーバーレイして、新しいレイヤーを作成します。
- 重ねられた層の上に、ドット（「鉛筆ツール」、キーボードショートカットBを使用）を使用して、損傷を受けた葉の面積をマーク。グリッド単位の半分以上をカバーする損傷があるそれより下のグリッドの各正方形のために1つのドットを使用してください。ドットの大きさ、 すなわち （ピクセル単位で定義され、
- グリッド部の少なくとも半分を覆う植物の損傷を示すグリッドのすべての正方形ドットでマークされたときに、ヒストグラムツール（ウィンドウ - ヒストグラム）を使用して層上の画素の総数を決定する。ヒストグラムツールは、画素数を計測できるようにするものである。各ドットは、画素の一定および既知の数で表されるので、ヒストグラムツールは、拡張によって、顕著な正方形の総数を総ドット数を表す画素の総数を測定します。
- 数式を使用してマークされた「ドット」の数を計算する。
ドット数=ドット当たりの画素の画素/数の合計数。 - 1ドットのグリッドの1マスに対応するように、グリッドの1平方の面積で画像上にマークされたドット数を乗じて損傷の総面積を計算する。
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Representative Results
20から30はびこっマメ植物を使用して、1は、篩を用いて約2,000の大人の女性のダニを収集することができます。ダニを転送するためにブラシを使用している場合、プラントごとに20ダニで10工場をはびこるするのに必要な時間は約15分である。収集およびアプリケーションの方法の組み合わせを図2に示す。
このプロトコルは、収集したダニは、同様の生理状態や植物ハダニの相互作用の研究に適した（ 図3 A）であることを実証し、植物の損傷の再現性のある結果を生成します。プロトコル·再現性を評価するために、成体雌性ダニは、ダニが20 3週齢A.のロゼット葉上に置いた洗浄方法を使用して収集された濡れたブラシでシロイヌナズナ植物 （アクCOL-0）。処理した植物は、スキャンされた4日postinfestation及び損傷の領域は、上述の技術を用いて定量した。繰り返し実験結果の比較はANOVAを用いて行った。
実験用途の一例として、我々は3 A.全体でハダニの食害に対する感受性の自然変動を評価した濡れたブラシと記録損傷4日後の侵入を用いて植物当たり20女性のハダニの適用によりシロイヌナズナアク。スキャンした画像内の損傷の典型的な外観を図3（b）に示します。その後、破損データの定量化は、棒グラフや箱ひげ図として提示し、選択された統計的手法（ 図3C）によって分析することができる。この例では、テューキーHSD検定に続くANOVAをデータ分析に使用した。
図1実験は、成人女性のダニを分離するために設定します。異なるハダニの発育の分離を可能にするためにモレキュラーシーブのセット（A）ステージ。 （A. 0.5ミリメートル開口部サイズ - ダニ懸濁液から破片を取り除きB 0.3ミリメートル - 成人女性のダニを集めC 0.2ミリメートル - 若い、女性、男性、そしてニンフを収集D 0.16ミリメートルで - 幼虫と若虫を収集し、E。 0.1ミリメートル-ポンプを用いダニを収集するために使用されるダニは、洗浄および濾過後のエスケープせずに回復することを可能にするために使用される卵を収集する）（B）セットアップ（C）セットアップ（D）ふるいを収集する準備ができて成体雌ダニを移動させると。
図2に適用するダニの数に応じて、成体雌ダニを単離するための可能な戦略。実験デザインは、成人女性のハダニの多数を使用する必要がある場合、最も効率的なアプローチは、直接真空ポンプ収集方法を使用することである豆の葉から。実験は成人女性または個人が慎重に若い植物に配置する必要があり、少数の以外の発達段階を使用する必要がある場合は、それが続く篩を用いて洗浄するアプローチとハダニの発育段階の収集と分別を行うことをお勧めしますブラシで侵入。
図3。代表的な結果。 （A）実験結果の再現性。 3週齢のAで測定された被害面積シロイヌナズナ植物、アクCOL-0、4日間20女性のハダニを適用した後。繰り返し実験結果の比較はANOVAた（n = 6、F = 0.621、P = 0.735）を用いて行った。 （BとC）3全体のハダニの食害に対する感受性の自然変動シロイヌナズナアク：COL-0、ハダニの食害後植物のLerの-0、およびWs2を（B）の外観。赤い矢印は、代表的な被災地に向かって指しています。ハダニの食害に対する感受性の（C）の違いダメージの面積によって評価される。ハダニの食害に対する感受性が有意にアク渡っ（ANOVAを、N = 6、F = 13.4、p = 0.0004）が変化する。手紙は、P <0.05（テューキーHSD検定）での遺伝子型との間に有意な差を示す。グラフ化の値は、平均値の平均値±標準誤差である。
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Discussion
このビデオでは、分離することと、大人の女性のダニ数の多い植物をはびこるために使用されるプロトコルを示しています。我々はAを使用して、このプロトコルを提示したがシロイヌナズナには、任意の植物ハダニインタラクションシステムのために使用することができるし、現在正常にトマト、ブドウ（ ビニフェラ種 ）植物にも適用されている。収集されたダニが同等の生理的状態（ 図3）であることを示すプロトコル利回り再現性のある結果を、。
これらのプロトコルは実施が簡単ですが、彼らはダニの回復に影響を与えるように、いくつかの重要なステップは、特別な注意が必要です。葉から洗濯ダニは、同時に最大3つのマメ植物で行われ、室温で水を使用して10分以内に完了しなければならないしなければならない。また、ダニは急速な乾燥のためのふるい上に広げなければなりません。ダニの回復が不十分である場合には、トゥイーン20洗剤の推奨された量は私たちであったかどうかチェックすることが重要ですEDと洗剤を十分にすすぎ工程の間に除去された場合。
; A）ポンプによるダニコレクションは30以上のダニが、ダニの数が少ないのコレクションはブラシの使用を必要とし、比較的遅いのコレクションに適しています。提示されたプロトコルには重要な制限が2つあります。しかし、洗浄方法を通して大人のダニを集めて濃縮して大幅にその適用を容易にし、 B）退緑斑点の表面を得点を通じて被害分析は、時間と手間のかかる工程であってもすることができます。今後の努力がダニ摂食の尺度として用いることができるマーカー遺伝子の同定に置くべきである。
以前に公開された方法論と比較すると、ハダニコレクションの発表方法は、実行可能な個人と1段階の発達段階の効率的な分離を大量に集めることの利点を提供しています。さらに、Visual inspectiを通じて植物の害虫の相互作用における植物の損傷表現型の評価あるいは、デジタル画像解析は、典型的には、（例えば、遺伝子発現分析又は代謝産物プロファイリングのような）分子の読み出しのいくつかのフォームを含む複雑な解析の最初のステップである。現在のプロトコルは、いくつかのダニ害虫および植物との間の長期的相互作用の分析にも有用である材料日後の蔓延のコレクションの適用に適している;しかし、このプロトコルは、効果的に、より短い時間（時間）の間に、給電サイトで発生する植物の応答をキャプチャすると同時にダニの数百を適用するには1を可能にします。
要約すると、宿主植物および植物被害の評価に成体雌ダニを適用するための方法が記載されている。これらのプロトコルは、植物およびナミハダニの間の相互作用の遺伝的および分子的基礎を理解することを目的とした実験のために必須である。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plant material: | |||
| California red kidney bean | Stokes, Thorold, ON, Canada | 2 week old, well infested with spider mites 2 or 3 days before use. Other cultivars of Phaseolus vulgaris can be used. | |
| Chemicals: | |||
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | 1% stock solution is prepared to simplify aliquoting |
| Tap water | At room temperature, heat- and cold-shock affect mite survival rate and performance | ||
| Other materials and equipment: | |||
| Plastic tray | |||
| Set of scissors | |||
| 2 L beakers | |||
| Paper towels | |||
| Sets of sieves | Manufactured in house | Detailed instructions are available | |
| Thin brush | |||
| Pipettes | |||
| Pipette tips | 0.2 and 1 ml | ||
| 1.5 ml centrifuge tubes | |||
| Air pump | Aquarium type pump with inverted air flow. Vacuum line can be used. Required pressure drop is approx. 2-4 psi | ||
| Stereoscope | |||
| Scanner | Epson | V30 | Any flatbed scanner allowing necessary degree of control over scan quality. We use Epson V30 for our experiments. |
| Computer | Windows or OS X PC which is compatible with scanner hardware and Adobe Photoshop software. | ||
| Adobe Photoshop software | Adobe Systems Inc., San Jose, CA, USA | various | Any version with Histogram tool included. |
References
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