Summary
Los protocolos para la preparación eficaz de las muestras homogéneas de la araña roja, la infestación de plantas experimentales y la evaluación de daños en las plantas, como se requiere para los estudios de interacción planta-plaga se desarrollaron.
Abstract
El ácaro de la araña de dos manchas, Tetranychus urticae, es un herbívoro artrópodos polífagas ubicuo que se alimenta de una notable amplia gama de especies, con más de 150 de valor económico. Es una de las principales plagas de los cultivos de invernadero, especialmente en las Solanáceas y Cucurbitáceas (por ejemplo, tomates, berenjenas, pimientos, pepinos, calabacín) y plantas ornamentales de invernadero (por ejemplo, rosas, crisantemos, claveles), cultivos extensivos anuales (como el maíz, el algodón, soja y remolacha azucarera), y en cultivos perennes (alfalfa, fresas, uvas, cítricos y ciruelas) 1,2. Además de la polifagia extrema que hace que sea una plaga agrícola importante, T. urticae tiene una tendencia a desarrollar resistencia a una amplia variedad de insecticidas y acaricidas que se utilizan para su control 3-7.
T. urticae es un organismo experimental excelente, ya que tiene un ciclo de vida rápido (7 días a 27 ° C)y puede ser fácilmente mantenido a alta densidad en el laboratorio. Métodos de ensayo de la expresión génica (incluyendo la hibridación in situ y tinción de anticuerpos) y para inactivar la expresión de genes endógenos de ácaros araña utilizando la interferencia de ARN se han desarrollado 8-10. Recientemente, toda la secuencia del genoma de T. urticae ha informado, creando una oportunidad para el desarrollo de este herbívoro plaga como organismo modelo con recursos genómicos equivalentes que ya existen en algunas de sus plantas hospederas (Arabidopsis thaliana y el Solanum lycopersicum tomate) 11. Juntos, estos organismos modelo podría ayudar a comprender las bases moleculares de las interacciones planta-plaga.
Aquí, un método eficiente para la recogida rápida y sencilla de un gran número de ácaros hembras adultas, su aplicación en un host de planta experimental, y la evaluación de los daños a las plantas debido a la alimentación del ácaro araña se describen. El protocolo presentado enables colección rápido y eficiente de los cientos de personas en cualquier etapa de desarrollo (huevos, larvas, ninfas, adultos machos, y las hembras) que se puede utilizar para la aplicación experimental posterior.
Introduction
Interacción planta-plaga es un tema de gran importancia científica y económica. Se estudió históricamente el uso de ambas plantas de cultivo (tales como el tomate) y el modelo de planta, A. thaliana. En ambos casos, la susceptibilidad de las plantas a los herbívoros se podía medir de forma directa a través de la evaluación del fenotipo de la planta después de un ataque de herbívoros o indirectamente a través de la evaluación del desempeño de plagas.
Las mediciones directas de susceptibilidad de las plantas se utilizaron previamente para un número de especies de plagas de insectos usando una gama de métodos. Por ejemplo, la herbivoría de larvas de lepidópteros se mide como una estimación de la porción de tejido de la planta consumida por cualquiera de Plutella xylostella (palomilla dorso de diamante) o Trichoplusia ni (gusano falso medidor) por el ojo desnudo con la ayuda de una rejilla 12. Además, existen métodos que utilizan la imagen digital de daño de la hoja con el posterior análisis de imagen cuantitativo. Tales métodos se utilizaron enestudios de A. interacción con Frankliniella occidentalis thaliana (trips occidental de las flores) 13, Scaptomyza flava (drosophila hoja-minería) 14, y T. NI 15.
Mediciones indirectas de la susceptibilidad de las plantas son ampliamente utilizados en los estudios de interacción planta-plaga. Por ejemplo, la susceptibilidad de A. thaliana a melocotón áfido Myzus persicae herbivoría se evalúa típicamente a través de análisis de la fecundidad de las plagas y descripción de la morfología bruto de una planta después de la interacción 16,17. Otro indicador indirecto típico de A. thaliana susceptibilidad a una plaga es una evaluación de peso seco o húmedo del herbívoro. Este parámetro se utiliza para caracterizar la herbivoría de lepidoterans, tales como Pieris rapae (pequeño blanco), P. xylostella, o T. ni a su larvas o pupal etapas 15,17.
Los ácaros son células contenido de FeEders. Daño inducido Mite-es reconocida como una colección de manchas cloróticas que varían en color de blanco a verde pálido. La susceptibilidad de una planta huésped a la herbivoría araña roja se evaluó previamente, ya sea indirectamente a través del análisis de los días de función araña después de la infestación de 18,19, o directamente a través de la morfología bruto de plantas semanas después de la infestación de 18 o usando una imagen digital de las hojas expuestas a los ácaros por día con el posterior análisis automatizado de imágenes 19. Estos métodos se están desarrollando y utilizando para el estudio de las interacciones entre las plantas de tomate y T. urticae, y por lo general se utiliza un pequeño número de ácaros de la araña (5-15 por tratamiento) que se recogieron a partir de la población de ácaros mixta y se colocaron en la superficie de las hojas usando un cepillo de cerdas suaves. Sin embargo, estos métodos no son adecuados para estudios en los que un mayor número de ácaros se deben aplicar. Además, mientras que el procesamiento directo de las imágenes de la hoja en el software de análisis de imágenestales como Adobe Photoshop (San José, CA) o ImageJ 20 se pueden utilizar para el análisis de daño de tomate, estos protocolos requieren una modificación con el fin de ser aplicado a las hojas que tienen una mayor reflectividad de la superficie o están ligeramente coloreados y tienen tricomas altamente visibles ( por ejemplo, A. thaliana) que interfieren con la selección automatizada de manchas cloróticas que marcan daños a las plantas. Además, la etapa de desarrollo de los ácaros araña que se pueden utilizar fácilmente con los métodos anteriores se limita a las hembras adultas más prevalentes y fácilmente identificables y se opone a la utilización de otras etapas de desarrollo.
El primer paso crítico para análisis de alto rendimiento de la interacción planta-ácaro araña es establecer protocolos reproducibles, simples y robustas para desafiar a las plantas con la araña roja y fiable evaluar los resultados de la interacción.
En este vídeo, un método eficiente para la recogida rápida y sencilla de un gran númeromero de ácaros hembras adultas, su aplicación en un host de planta experimental, y la evaluación de los daños a las plantas debido a la alimentación del ácaro araña se describen. El protocolo presentado permite la recolección rápido y eficiente de los cientos de personas en cualquier etapa de desarrollo (huevos, larvas, ninfas, adultos machos, y las hembras) que se puede utilizar para la aplicación experimental posterior. Además, estos protocolos se pueden aplicar a cualquier planta huésped ácaros, pero se demuestran específicamente en el caso de A. thaliana.
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Protocol
1. El mantenimiento de la araña roja Población
NOTA: Los ácaros son criados en California frijoles rojos (Phaseolus vulgaris).
- Cultiva plantas de frijol de semillas durante 2-3 semanas antes de la infestación.
- Intermix estas plantas con las plantas infestadas; ácaros adultos se colonizar rápidamente el material vegetal fresco.
- Retire las plantas de frijol infestados cada 7-10 días, reemplazándolos con plantas frescas.
2. Recopilación de la hembra adulta ácaros
- Mite colección utilizando el método de lavado
- Para recoger los ácaros, coloque una planta de frijol fresco en contacto con las plantas infestadas 1 a 2 días antes del experimento.
- Utilice 20 a 30 plantas de soja frescos para recoger entre 1.000 y 2.000 ácaros hembra adulta.
- Preparar una solución de Tween 20 al 0,001% con agua del grifo a temperatura ambiente.
- Lavar las plantas de frijol infestadas en la solución de Tween 20, utilizando de 2 a 3 plantas en un momento.
- Realice desde el paso 2.1.4 dentro de los 10 min para evitar la mortalidad de ácaros.
- Aislamiento de ácaros hembras adultas por filtración de la suspensión a través de tamices de Mite Definido Tamaño de la malla
- Preparar tamices de los siguientes tamaños de malla: 500 m (para eliminar los desechos) y 300 m (para recoger los ácaros adultos femeninos) (Figura 1A).
- Se filtra la suspensión a través del tamiz de 500 micras.
- Filtrar de nuevo la suspensión a través del tamiz de 300 micras. Se conservarán los ácaros hembras adultas.
- Sumerja un tamiz de 300 micras con los ácaros hembras adultas en el agua limpia del grifo para eliminar el Tween 20.
- Spread ácaros en una sola capa en la parte inferior del tamiz.
- Use una toalla de papel para eliminar el exceso de agua de la malla y los lados del tamiz. NOTA: Esto se hace porque los ácaros necesitan secarse rápidamente con el fin de recuperarse.
- Preparar un conjunto como se muestra en la Figura 1B; esto permitirá que los ácaros se muevan libremente, pero evitará que se escape.
- Coloque el tamiz con ácaros en la parte superior de la criba que se utiliza como soporte.
- Surround tamiz de fondo con agua para evitar que los ácaros de la dispersión. NOTA: Los ácaros se iniciará la recuperación después de aproximadamente 5 min. Después de aproximadamente 30 min, el número de ácaros en movimiento es suficiente para iniciar la recogida de (Figura 1D). Los ácaros deben ser cobrados en un plazo de 1 hora, ya que producen la seda que interfiera con la colección.
3. Planta de la infestación con ácaros
NOTA: Una vez ácaros hembra adultos se han recuperado, que se pueden utilizar para la infestación de la planta. Existen 2 métodos utilizados para infectar plantas experimentales con ácaros hembras adultas: a) utilizando un pincel fino (servicio de protocolo 3.1) y b) utilizando una bomba de vacío o una línea (servicio de protocolo 3.2).
- Infestación de ácaros usando un cepillo de
NOTA: Araña infestación de ácaroscon un cepillo se utiliza para la aplicación de hasta 30 ácaros por planta.- Use un cepillo de arte suave pelo ronda de tamaño 00 o más fino.
- Humedecer el cepillo con agua del grifo RT.
- Recoger suavemente hasta los ácaros del tamiz utilizando la punta del pincel y transferirlos a la planta.
- Infestación de ácaros usando una bomba
NOTA: la infestación de plantas con ácaros recolectados por una línea de bomba / vacío se utiliza cuando se aplican más de 30 ácaros. Para este método, una bomba de vacío para componentes microelectrónicos de recogida o una línea de vacío se puede utilizar. Es importante mantener la constante de flujo de aire y de resistencia suficiente (2-4 psi).- Coloque una punta de pipeta de 1 ml al tubo que se conecta a la línea de la bomba de vacío o mediante el uso de un corte de 1,5 ml tubo de centrífuga en la parte inferior como un adaptador entre el tubo de la bomba / vacío y la punta.
- Coloque un pedazo de toalla de papel entre la punta de la pipeta y el adaptador (tubo de centrífuga de 1,5 ml). Nota: El propósito de esto es para atrapar los ácaros dentro de tél pipeta de punta durante el proceso de aspiración y también para reducir el flujo de aire (Figura 1C).
- Recoger ácaros directamente desde el tamiz con la punta de la pipeta.
- Alternativamente, recoger los ácaros uno por uno a partir de hojas infestadas utilizando un estereoscopio.
- Cuando se ha recogido el número requerido de los ácaros, quite la punta de la pipeta del tubo, asegurándose de que el pedazo de toalla de papel en la parte posterior de la punta de la pipeta se ve alterado.
- Recoger ácaros tocando la punta de la pipeta y se peguen los ácaros juntos. A continuación, colocarlos en la hoja; en cuestión de segundos, los ácaros comenzarán a dispersar en la hoja.
4. Registro y Evaluación de Daños Plant
- Daños a las plantas de grabación
NOTA: Para A. thaliana, daños a las plantas se evalúa después de 4 días de alimentación del ácaro. El daño se registró como la superficie total de manchas cloróticas. Para la medición de daño, toda la roseta se corta y se escanea.Parámetros de análisis descritos son para un escáner Epson V30 pero actuará como un buen punto de partida para cualquier escáner plano similar. Mantener los parámetros de exploración constantes para todos los experimentos que permite la comparación entre las corridas experimentales individuales.- Cubra escáner con hoja de transparencia para evitar la contaminación de la superficie del escáner con material vegetal.
- Cortar toda una roseta y el lugar en el escáner de modo lado adaxial (superior) de las hojas se enfrentan a la fuente de luz del escáner y elemento de captura. Alternativamente, si los rosetones son demasiado densos para capturar las hojas individuales sin solapamiento, diseccionar el rosetón en hojas o grupos de hojas que no se superponen con tijeras finas individuales antes de colocar en el escáner. Múltiples rosetas se pueden escanear simultáneamente.
- Cubra rosetas o las hojas con una hoja de papel blanco para evitar la adhesión y la contaminación de la cubierta del escáner.
- Cierre la tapa del escáner y haga una búsqueda con los siguientes parámetros: Resolución: 1,200 dpi; Modo de color: Adobe RGB; Brillo: 25; Tipo de archivo: JPEG de máxima calidad.
- Guarde archivos de imágenes para análisis de daños posteriores.
- Cuantificación de daños Plant
NOTA: El área de daño se calcula manualmente usando Photoshop. Debido a las grandes diferencias en la forma de la hoja y la intensidad de color de los síntomas como resultado de la alimentación de ácaros, métodos automáticos no eran fiables. Por lo tanto, un método de la cuadrícula se utiliza para evaluar los daños planta:- Abra la imagen de la planta con Photoshop.
- Crear una nueva capa, a continuación, superponer la imagen escaneada con una cuadrícula de 0,25 mm x 0,25 mm divisiones (Ver o Display - Show - Cuadrícula, atajo de teclado Ctrl + ').
- En una capa superpuesta, marcar las áreas dañadas de la hoja utilizando un punto (usar la "Herramienta Lápiz", atajo de teclado B). Utilice un único punto para cada cuadrado de la cuadrícula debajo de la cual hay un daño que cubren más de la mitad de la unidad de red. El tamaño del punto se define en píxeles (es decir,
- Cuando todos los cuadrados de la cuadrícula que muestran daños a las plantas que cubren al menos la mitad de la unidad de la cuadrícula están marcados con un punto, utilice la herramienta histograma (Ventana - Histograma) para determinar el número total de píxeles de la capa. La herramienta permite que un histograma para medir el número de píxeles. Dado que cada punto está representado por un número constante y conocida de píxeles, la herramienta histograma medirá el número total de píxeles, que representa el número total de puntos, y, por extensión, el número total de cuadrados marcados.
- Calcular el número de "puntos" marcados con la siguiente fórmula:
Número de puntos = número total de píxeles / número de píxeles por punto. - Calcular el área total de daño de multiplicar el número de puntos marcados en la imagen por el área de 1 cuadrado de la cuadrícula, como un punto corresponde a un cuadrado de la cuadrícula.
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Representative Results
El uso de 20 a 30 plantas de frijol infestadas, se puede recolectar alrededor de 2.000 ácaros hembra adulta utilizando tamices. El tiempo requerido para infestar 10 plantas con 20 ácaros por planta es de aproximadamente 15 minutos si se utiliza un cepillo para transferir los ácaros. Las combinaciones de los métodos de recolección y de la aplicación se muestran en la Figura 2.
Este protocolo genera resultados reproducibles de daños en las plantas, lo que demuestra que los ácaros son recogidos de estado fisiológico similar y adecuado para los estudios de interacción planta-ácaro araña (Figura 3 A). Para evaluar la reproducibilidad del protocolo, ácaros hembras adultas fueron obtenidos mediante el método de lavado donde 20 ácaros fueron colocados en hojas en roseta de 3 semanas de edad A. plantas thaliana (adhesión Col-0) con un pincel húmedo. Las plantas tratadas fueron escaneados 4 días postinfestation y área de daño se cuantificó usando las técnicas descritas anteriormente. Comparación de los resultados de los experimentos repetidos se realizó mediante ANOVA.
Como un ejemplo de aplicación experimental, se evaluó la variación natural en la susceptibilidad a la herbivoría ácaro araña a través de 3 A. thaliana adhesiones de aplicación de 20 ácaros de la araña hembra por planta con un cepillo mojado y daños grabación 4 días después de la infestación. Apariencia típica de los daños en las imágenes escaneadas se muestra en la Figura 3B. Después, la cuantificación de los datos de daño puede ser presentado como un gráfico de barras o un diagrama de caja y se analizó mediante el método estadístico de elección (Figura 3C). En este ejemplo, ANOVA seguido por el test HSD de Tukey se utilizó para el análisis de datos.
Figura 1. Experimental creó para el aislamiento de ácaros hembras adultas. (A) Juego de tamices para permitir la separación de diferente desarrollo araña rojaetapas. (A. 0.5 mm tamaño de la abertura - elimina los desechos de la suspensión de ácaros b 0,3 mm -.. Recoge ácaros hembras adultas c 0,2 mm -.. Recoge las hembras jóvenes, machos y ninfas d 0,16 mm -.. Recoge larvas y ninfas e.. 0,1 mm -.. recoge los huevos) (B) de configuración se utiliza para permitir que los ácaros se recuperen sin escapar después del lavado y filtrado (C) Configuración utilizada para recoger los ácaros usando la bomba (D) Tamiz con el movimiento de los ácaros hembra adulta listo para ser recogido..
Figura 2. Estrategias posibles para aislar ácaros hembra adultos, de acuerdo con el número de ácaros de aplicar. Si el diseño experimental requiere el uso de un alto número de ácaros de araña de mujeres adultas, el enfoque más eficaz es utilizar el método de recogida de la bomba de vacío directamente a partir de las hojas de frijol.Si un experimento requiere el uso de una etapa de desarrollo distintos de las hembras adultas o un pequeño número de individuos necesitan ser colocados cuidadosamente en las plantas más jóvenes, se recomienda realizar la recolección y el fraccionamiento de las etapas de desarrollo de los ácaros araña con el enfoque de lavado utilizando tamices seguido por infestación con un cepillo.
Figura 3. Los resultados representativos. (A) La reproducibilidad de los resultados experimentales. Área Daños medido en 3 semanas de edad A. plantas thaliana, la adhesión Col-0, 4 días después de la aplicación de 20 arañas rojas femenino. Comparación de los resultados de los experimentos repetidos se hizo utilizando ANOVA (n = 6, F = 0,621, p = 0,735). (B y C) La variación natural en la susceptibilidad al ácaro herbivoría través de 3Accesiones de A. thaliana Col-0, Ler-0, y WS2 (B) Aparición de plantas después de la herbivoría araña roja.. Las flechas rojas apuntan hacia las zonas típicas dañadas. (C) Las diferencias en la susceptibilidad al ácaro herbivoría según la evaluación de la zona de daños. La susceptibilidad al ácaro herbivoría varía significativamente entre las accesiones (ANOVA, n = 6, F = 13.4, P = 0,0004). Las letras indican diferencias significativas entre los genotipos a P <0.05 (prueba de Tukey HSD). Valores graficados son la media ± error estándar de la media.
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Discussion
Este video muestra los protocolos que se utilizan para aislar y para infestar las plantas con un gran número de ácaros hembras adultas. Aunque hemos presentado este protocolo utilizando A. thaliana, que puede ser utilizado para cualquier sistema de interacción ácaro araña planta-y en la actualidad se está aplicando con éxito también en plantas de tomate y de vid (Vitis vinifera). Los rendimientos de protocolo resultados reproducibles, lo que indica que los ácaros son recogidos de estado fisiológico comparable (Figura 3).
Mientras que estos protocolos son simples de realizar, varios pasos críticos requieren una atención especial ya que afectarán a la recuperación de ácaros. Ácaros del lavado de las hojas deben ser hecho en un máximo de tres plantas de frijol de manera simultánea y tiene que ser completado dentro de 10 minutos con agua a temperatura ambiente. Además, los ácaros tienen que ser propagado en un tamiz para el secado rápido. Si la recuperación de ácaros es satisfactoria, es importante comprobar si la cantidad recomendada de detergente Tween 20 nos fueEd y si el detergente se eliminó completamente durante la etapa de aclarado.
Hay dos grandes limitaciones en el protocolo que se presentan: a) la recolección de ácaros por la bomba funciona bien para las colecciones de más de 30 ácaros pero colección de un número menor de ácaros requiere el uso de un cepillo y es relativamente lento; Sin embargo, la recolección y la concentración de ácaros adultos a través del método de lavado facilita en gran medida su aplicación; b) análisis de daños a través de anotar la superficie de manchas cloróticas puede ser un tiempo-y paso el esfuerzo que consume; esfuerzo futuro debe establecer en la identificación de genes marcadores que pueden ser utilizados como una medida de la alimentación del ácaro.
En comparación con las metodologías previamente publicados, el método presentado de la recogida de ácaro araña ofrece una ventaja de la recogida de un gran número de individuos viables y la separación eficiente de las etapas de desarrollo en un solo paso. Además, la evaluación del fenotipo de daño a la planta en la interacción planta-plaga a través inspecti visualo análisis de imagen digital es típicamente la primera etapa de un análisis complejo que implica alguna forma de molecular de lectura de salida (tal como el análisis de perfiles de expresión génica o metabolito). Los protocolos actuales son adecuados para la aplicación de un par de ácaros y colección de materiales días posteriores a la infestación que son valiosos para el análisis de las interacciones a largo plazo entre la planta y las plagas; Sin embargo, este protocolo permite a uno para aplicar cientos de ácaros simultáneamente para capturar eficazmente respuestas de las plantas que se producen durante un período corto de tiempo (horas) y en el sitio de alimentación.
En resumen, se han descrito métodos para la aplicación de los ácaros de la hembra adulta en plantas huésped y evaluación de daños a las plantas. Estos protocolos son esenciales para los experimentos dirigidos a la comprensión de las bases genéticas y moleculares de la interacción entre las plantas y el ácaro de la araña de dos manchas.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plant material: | |||
| California red kidney bean | Stokes, Thorold, ON, Canada | 2 week old, well infested with spider mites 2 or 3 days before use. Other cultivars of Phaseolus vulgaris can be used. | |
| Chemicals: | |||
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | 1% stock solution is prepared to simplify aliquoting |
| Tap water | At room temperature, heat- and cold-shock affect mite survival rate and performance | ||
| Other materials and equipment: | |||
| Plastic tray | |||
| Set of scissors | |||
| 2 L beakers | |||
| Paper towels | |||
| Sets of sieves | Manufactured in house | Detailed instructions are available | |
| Thin brush | |||
| Pipettes | |||
| Pipette tips | 0.2 and 1 ml | ||
| 1.5 ml centrifuge tubes | |||
| Air pump | Aquarium type pump with inverted air flow. Vacuum line can be used. Required pressure drop is approx. 2-4 psi | ||
| Stereoscope | |||
| Scanner | Epson | V30 | Any flatbed scanner allowing necessary degree of control over scan quality. We use Epson V30 for our experiments. |
| Computer | Windows or OS X PC which is compatible with scanner hardware and Adobe Photoshop software. | ||
| Adobe Photoshop software | Adobe Systems Inc., San Jose, CA, USA | various | Any version with Histogram tool included. |
References
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