Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals.
Synaptische transmissie is een zeer snel proces. Actiepotentiaal gedreven instroom van Ca 2 + in de presynaptische terminal, door middel van spanningsafhankelijke calciumkanalen (VGCCs) gelegen in de release gezicht membraan, is de trigger voor de vesikel fusie en de afgifte van neurotransmitters. Cruciaal voor de snelheid van de synaptische transmissie is de ruimtelijke en temporele synchronie tussen de aankomst van de actiepotentiaal, VGCCs en de neurotransmitter vrijkomen machines. De mogelijkheid om direct op te nemen Ca 2 + stromen vanaf de release gezicht membraan van individuele presynaptische terminals is absoluut noodzakelijk voor een juist begrip van de relatie tussen de presynaptische Ca 2 + en neurotransmitters. Toegang tot de presynaptische vrijlating gezicht membraan voor elektrofysiologische opname is niet beschikbaar in de meeste bereidingen en presynaptische Ca 2 + bericht is gekenmerkt met behulp van beeldvormende technieken en macroscopische huidige meteNTS – technieken die niet beschikken over voldoende tijdsresolutie om Ca 2 + toegang te visualiseren. De karakterisering van VGCCs direct bij enkele presynaptische terminals niet mogelijk was in het centrum van synapsen en is tot nu toe met succes alleen bereikt in de kelk-achtige synaps van het kuiken ciliaire ganglion en in kelken rat. We hebben met succes aangepakt dit probleem in de gigantische reticulospinal synaps van de lamprei ruggenmerg door het ontwikkelen van een acuut gedissocieerde voorbereiding van het ruggenmerg dat geïsoleerde reticulospinal axonen levert met functionele presynaptische terminals verstoken van postsynaptische structuren. We kunnen fluorescent labelen en identificeren van individuele presynaptische terminals en richten ze voor opname. Met behulp van deze voorbereiding, hebben we direct gekenmerkt VGCCs bij de release gezicht van individuele presynaptische terminals met behulp van immunohistochemie en elektrofysiologie benaderingen. Ca 2 + stromingen zijn rechtstreeks opgenomen in de release gezicht membraan of individuele presynaptische terminals, de eerste van die opname uit te voeren bij de centrale synapsen uitgevoerd.
Synaptische transmissie is een zeer snelle en nauwkeurige werkwijze. Actiepotentiaal invasie van de presynaptische terminal leidt tot het openen van VGCCs gelegen in de release gezicht membraan, de daaruit voortvloeiende toename van de presynaptische Ca 2 + als de trigger voor de vesikel fusie en de afgifte van neurotransmitters 1. Al deze stappen uitgevoerd binnen honderden microseconden 2, en dus vereisen strakke ruimtelijke koppeling van VGCCs aan de vesikel fusie machine 3. Presynaptische Ca 2 + fluxen zijn voornamelijk gekenmerkt door beeldvorming benaderingen met behulp van Ca 2 + gevoelige kleurstoffen 4. Integratie Ca2 + buffers dat Ca2 + moduleren in presynaptische neuronen is gebruikt om het verband tussen presynaptische calcium en neurotransmissie 3 indirect karakteriseren. Bovendien moduleren presynaptische vrije Ca2 + concentratie uncaging Ca2 + 5 of opname macroscopic Ca 2 + stromingen zijn gebruikt in combinatie met de maatregelen van de vesikel fusie en / of vrijgave; zoals capaciteit metingen 6 of postsynaptische reacties 2 op dezelfde vraag aan te pakken. Echter, het karakteriseren van Ca 2 + stromen direct bij de release gezicht, de gespecialiseerde afdeling van de presynaptische membraan waar membraandepolarisatie wordt vertaald in Ca 2 + stromen triggering synaptische vesikel fusie en de neurotransmitter release, is een integraal onderdeel van het verkrijgen van een nauwkeurige meting van de Ca 2 + vereiste voor synaptische vesikel fusie. Bovendien is de mogelijkheid om direct te karakteriseren Ca2 + stromingen individuele presynaptische terminals, in combinatie met nauwkeurige simultaanmeting van vesikel fusie en vrijheid maakt een nauwkeurige opheldering van de timing tussen het tijdsverloop van de actiepotentiaal, presynaptische Ca2 + stroom, vesikel fusie en de release. De toegang tot de release gezicht membraanis niet beschikbaar in de meeste presynaptische terminals worden gesloten en aanhechting van de postsynaptische dendrieten. Deze ontoegankelijkheid is een belangrijk obstakel in de karakterisering van VGCCs omdat het voorkomt directe metingen van stroom bij individuele presynaptische terminals. Directe karakterisering van presynaptische Ca 2 + stromen op individueel presynaptische terminals is tot nu toe niet mogelijk geweest in het centrum van synapsen en is alleen op twee calyceal soort presynaptische terminals; kelk-achtige synaps van het kuiken ciliaire ganglion 7-10 en rat kelken 11,12. In alle andere presynaptische terminals waaronder de reus reticulospinal synaps in de lamprei ruggenmerg 13, heeft het gebrek aan toegang tot de presynaptische vrijlating gezicht membraan het gebruik van indirecte benaderingen noodzakelijk zoals Ca 2 + imaging aan presynaptische Ca 2 + fluxen te bestuderen.
<img alt="Figuur 1" fo: content-width = "5in" src = "/ files / ftp_upload / 51925 / 51925fig1highres.jpg" width = "500" />
Figuur 1 Lamprey gigantische reticulospinal synaps. (A) Dwarsdoorsnede van lamprei ruggenmerg aangeeft dorso-ventrale richting. Reticulospinal axonen zijn gemarkeerd met groene asterix. (B) 3-D reconstructie van de reticulospinal synaps in de lamprei ruggenmerg tonen presynaptische reticulospinal axon waardoor talrijke en passant contacten (gemarkeerd met groene pijlen) op de postsynaptische neuron 13. Presynaptische terminals zijn gelabeld met Alexa Fluor 488 hydrazide geconjugeerd phalloidin (groen), terwijl de postsynaptische neuron is gevuld met Alexa Fluor 568 hydrazide (rood).
Lamprei gigantische reticulospinal axonen, gelegen in het ventrale gebied van het ruggenmerg parallel aan de rostrale-caudale as Figuur 1a, vorm meerdere en passant synaptische contacten op neuronen van despinale ventrale hoorn 14 Figuur 1b 13. Macroscopische whole-cell Ca 2 + stromen zijn opgenomen vanuit reticulospinal axonen in de intacte ruggenmerg 13,15. Echter, eerdere blind pogingen directe meting van Ca2 + stromen in reticulospinal axons in de intacte lamprey ruggenmerg middels cel verbonden patch clamp techniek onsuccesvol 13 gebleken wegens gebrek aan toegang tot de presynaptische afgifte gezicht membraan wegens de tegengestelde postsynaptische processen Figuur 1b. De release gezicht membraan eerder ontsloten door verwijdering van het postsynaptische neuron 11, mechanische verstoring van de synaps vóór opname 12 of enzymatische behandeling in combinatie met mechanische dissociatie 16. Gezien de complexe organisatie van het ruggenmerg, zou het uiterst moeilijk blijkt om de postsynaptische neuron te identificeren en schuif het mechanisch of verstoren the synaps. Vandaar dat we besloten om enzymatische behandeling 17, gevolgd door mechanische dissociatie gebruiken.
Met deze aanpak hebben we een acuut gedissocieerde voorbereiding van de lamprei ruggenmerg die levensvatbare geïsoleerde reticulospinal axonen met functionele presynaptische terminals zonder enige postsynaptische processen oplevert ontwikkeld, waardoor onbeperkte toegang tot individuele presynaptische terminals. In combinatie met een standaard omgekeerde microscoop en fluorescentie beeldvorming, het stelt ons in staat om te identificeren en te richten op individuele fluorescent-geïdentificeerde presynaptische terminals, met een patch pipet met een opname oplossing die Ca 2 + stromen Figuur 4c pt figuur 4d isoleert, voor het opnemen van het gebruik van cel- bijgevoegde voltage-clamp techniek. Ca 2 + stromingen zijn rechtstreeks opgenomen in de presynaptische vrijlating gezicht membraan van individuele presynaptische terminals figuur 4f. Dit is een significant doorbraak op het gebied van synaptische transmissie omdat het het eerste opname uitgevoerd bij centrale synapsen worden uitgevoerd.
Onze dissociatie protocol is belangrijk door het afstaan van geïsoleerde reticulospinal axonen verstoken van postsynaptische projecties figuur 2f, maar die toch behouden functionele presynaptische terminals Figuur 4c pt figuur 4d. De afwezigheid van postsynaptische processen tegen de presynaptische terminal maakt directe opname toegang tot de presynaptische vrijlating gezicht membraan aan enkele presynaptische terminals, die eerder niet mogelijk in het centrum va…
The authors have nothing to disclose.
This work has been supported by NINDS, RO1NS52699 and MH84874 to SA.
We would like to thank Dr. Dave Featherstone (Department of Biological Sciences, University for Illinois at Chicago) for providing us with the suture glue used in the immunohistochemistry work. We thank Michael Alpert for his comments and proofreading of the manuscript.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
0.2 µm syringe filter | EMD Millipore | SLGV004SL | |
22×60 mm coverslips | Fisherbrand | 12545J | |
Advasep-7 | Cydex Pharmaceuticals | ADV7 | |
Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | |
Alexa-633 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen/Life Technologies | A21070 | |
Antifreeze | Prestone | ||
Boric acid | Sigma-Aldrich | B7660 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
Bright field light source | Dolan-Jenner | Fiberlite 180 | |
Calcium chloride | Sigma Aldrich | C4901 | |
Collagenase Type IA from Cloristridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9891 | |
Cover slip | Fisher-Scientific | 12-545-J | |
Dextrose | Sigma-Aldrich | D9559 | |
Digital CCD Camera | Hamamatsu | C8484-03G01 | |
Dissection fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
Dissection forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
Dissection microscope | Leica Biosystems | Leica MZ 12 | |
Dissection scissors | Fine Science Tools | 15025-10 | |
Dissection scissors fine | Fine Science Tools | 91500-09 | |
Dissection scissors ultra fine | Fine Science Tools | 15000-08 | |
FM 1-43 | Invitrogen/Life Technologies | T3163 | |
Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | |
High vacuum grease | Dow-Corning | ||
Hydrochloric acid | Fisherbrand | SA-56-500 | |
Immersion oil | Fisher-Scientific | M2000 | |
Industrial grade Nitrogen gas tank | Praxair | UN1066 | |
Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
Liquid suture glue | Braun Veterinary Cair Division | 8V0305 | The suture glue we used in our experiments was provided to us by another lab. It is no longer manufactured. We have sourced a Histoacryl Suture Glue for future use from Aesculap (Ts1050071FP) |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 154903 | |
Non-fat dry milk | Cell Signaling Technology | 9999S | |
P-87 Micropipette puller | Sutter Instruments | ||
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Perfusion pump | Cole-Palmer | Masterflex C/L | |
Petri dish 100×15 mm | Fisher-Scientific | 875712 | |
Petri dish 35×10 mm | Fisher-scientific | 875712 | |
Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1024 | MW > 300000 |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5379 | |
Primary antibodiesR-type calcium channel | Alomone Labs | ACC-006 | |
Protease Type XIV from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | |
Scalpel blades | World Precision Instruments | 500240 | |
Schot Duran Preesure Bottle | Fisher-Scientific | 09-841-006 | |
Silicone tubing for glue application | Cole-Palmer | 07625-26 | |
Slicing base plate | Leica Biosystems | 14046327404 | |
Slicing chamber | Leica Biosystems | 1.4046E+10 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Sodium hydroxide | S8045 | ||
Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763 | |
Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | B3545 | |
Sylgard 160 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD® 160 | To prepare, mix elastomer A and elastomer B 10:1 by weight |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD® 184 | To prepare, mix elastomer and curing agent 10:1 by weight |
Teflon coated forceps | Fine Science Tools | 11626-11 | |
Tricaine methanesulphonate | Sigma-Aldrich | A5040 | |
Vibratome blades | World Precision Instruments | BLADES | |
Xenon lamp | Nikon |