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Artigo de método

Modulações Ambientais do número de Midbrain dopamina Neurônios no Adulto Mice

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DOI:

10.3791/52329

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20 de janeiro de 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Florey Institute of Neuroscience and Mental Health, The University of Melbourne

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve duas manipulações ambientais diferentes e um protocolo de infusão cerebral concomitante para estudar as alterações cerebrais induzidas pelo ambiente subjacentes ao comportamento adaptativo e ao reparo cerebral em camundongos adultos.

Resumo

Mudanças duradouras no cérebro ou "plasticidade cerebral" subjazem o comportamento adaptativo e reparação cerebral após doença ou lesão. Além disso, as interações com o meio ambiente pode induzir plasticidade cerebral. Cada vez mais, a pesquisa está tentando identificar quais ambientes estimular a plasticidade cerebral benéfica para o tratamento de desordens cerebrais e comportamentais. Duas modificações ambientais que são descritos aumentar ou diminuir o número de tirosina-hidroxilase imunopositivas (TH +, a enzima limitante da velocidade de dopamina (DA síntese)) neurónios do mesencéfalo do rato adulto. O primeiro inclui o emparelhamento masculino e camundongos fêmeas juntos continuamente durante uma semana, o que aumenta TH mesencéfalo + neurônios em aproximadamente 12% no sexo masculino, mas diminui TH mesencéfalo + neurônios em aproximadamente 12% no sexo feminino. A segunda compreende ratos habitação continuamente por 2 semanas em "ambientes enriquecidos" (EE) contendo rodas de corrida, brinquedos, cordas, material de nidificação, etc., que increases TH mesencéfalo + neurônios em cerca de 14% no sexo masculino. Além disso, um protocolo é descrito por concomitantemente infundindo drogas diretamente no mesencéfalo durante estas manipulações ambientais para ajudar a identificar os mecanismos subjacentes a plasticidade do cérebro por motivos ambientais. Por exemplo, EE-indução de mais TH mesencéfalo + neurônios é abolida pelo bloqueio simultâneo de entrada sináptica em neurônios do mesencéfalo. Juntos, estes dados indicam que a informação sobre o meio ambiente é retransmitida via de entrada sináptica nos neurônios do mesencéfalo para ligar ou desligar a expressão de genes 'da'. Assim, a estimulação ambiental adequada, ou droga segmentação dos mecanismos subjacentes, pode ser útil para o tratamento de distúrbios cerebrais e comportamentais associados com desequilíbrios no mesencéfalo DA (por exemplo, doença de Parkinson, déficit de atenção e hiperatividade, esquizofrenia e dependência de drogas).

Introdução

Sinalização DArgic pelos neurônios na área tegmental ventral (VTA) e substantia nigra pars compacta (SNC) do mesencéfalo é pensado para ser importante para os comportamentos cognitivos, emotivos e motoras motivou-recompensa. No entanto, muita ou pouca sinalização DA mesencéfalo causa muitos sintomas incapacitantes em uma variedade de distúrbios neurológicos (por exemplo, doença de Parkinson, déficit de atenção e hiperatividade, esquizofrenia e dependência de drogas). Drogas que aumentam ou diminuem a sinalização DA aliviar estes sintomas, no entanto, eles também produzem efeitos colaterais atribuíveis à sinalização desregulada e efeitos fora do alvo. A eficácia do fármaco também diminui ao longo do tempo, devido a respostas compensatórias do cérebro. Por isso, o desafio é restaurar a sinalização DA mesencéfalo normal em uma forma mais direccionada e fisiológico, e uma abordagem favorecido é aumentando ou diminuindo o número de neurônios DA mesencéfalo.

A evidência foi acumulando para several décadas que a expressão de genes e proteínas envolvidas no metabolismo e DA tráfico e outras catecolaminas em células de adulto é modificável (revisto em 1). No mesencéfalo, o número de tirosina-hidroxilase imunopositivas (TH +, a enzima limitante da velocidade na síntese de DA), em seguida, diminui, aumenta neurónios após a administração da neurotoxina 2,3, enquanto que o número de TH immunonegative (TH) neurónios mostra o padrão oposto (isto é, aumenta em seguida, diminui 3). Isto é consistente com a perda, em seguida, ganhar do "DA fenótipo 'por algumas células. O número de neurónios TH + TH e SNc também foi mostrado para mudar em direcções iguais mas opostos na sequência de vários tratamentos que alteram a actividade eléctrica destas células 4,5. Por exemplo, a infusão de pequeno-condutância, potássio activados por cálcio (SK) canal antagonista apamina em mesencéfalo durante 2 semanas, diminui o número de TH + e aumentos (pela mesma quantidade) o number de TH SNc neurônios 4,5. Em contraste, a infusão do agonista do canal SK-1 EBIO aumenta o número de TH + e diminui (pela mesma quantidade) o número de neurónios TH SNc 4,5. Alterações semelhantes foram vistos na sequência de uma variedade de tratamentos que visam a atividade neuronal do SNC, incluindo alguns que visava inputs aferentes 4. Esta aparente de regulação do número de neurónios SNc DArgic por actividade neuronal aferente e entrada levanta a possibilidade de que o ambiente ou comportamento pode influenciar o número de neurónios SNc. Na verdade ratos adultos expostos a diferentes ambientes têm mais ou menos mesencéfalo (SNc e VTA) TH + neurônios, e pelo menos algumas dessas mudanças induzidas pelo meio ambiente são abolidas pelo bloqueio simultâneo de entrada sináptica no mesencéfalo 6. Os objectivos desta comunicação são os seguintes: (1) fornecer mais detalhes sobre como implementar nossas manipulações ambientais e infusões de drogas; e (2) fornecer mais dados de apoio a nossa afirmação de que o environment regula o número de neurônios DA mesencéfalo, através da entrada de aferentes.

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Protocolo

NOTA: Todos os procedimentos experimentais em animais foram aprovados pelo Instituto Florey do Comitê de Ética Animal Health Neuroscience & Mental e em conformidade com da Austrália Nacional de Saúde e Pesquisa Médica do Conselho publicou código de boas práticas para o cuidado e uso de animais para fins científicos (7 ª edição, 2004).

1. As manipulações ambientais

  1. O emparelhamento de Gênero
    1. Use sexualmente maduros (> 8 semanas de idade), os ratos machos e fêmeas pareados por idade.
      NOTA: Normalmente usamos camundongos C57BL / 6, mas tiveram os mesmos resultados usando camundongos Swiss neste protocolo. Normalmente usamos n = 8 machos e fêmeas n = 8 para cada experimento, dividido em n = 2 pares macho-macho (n = 4 machos), n = 2 pares fêmea-fêmea (n = 4 mulheres), e n = 4 pares macho-fêmea (n = 4 machos e 4 fêmeas = n).
    2. Após a chegada no animal instalação de detenção, casa-grupo dos camundongos por sexo para> 3 dias para se aclimatar. Aqui e througHout o emparelhamento sexo, manter estímulos ambientais externos (por exemplo, temperatura ambiente, a luz: ciclo escuro, comida, água, manuseio e limpeza) constante ou distribuir igualmente a todos os ratos.
    3. Aleatoriamente atribuir a cada rato a um par macho-macho, um par fêmea-fêmea, ou um par macho-fêmea. Colocar cada par em uma gaiola limpa em isolamento (2 ratos / gaiola) com acesso ad libitum à comida e água, e simplesmente os alojar deste modo continuamente durante 7 dias.
      NOTA: pecuária rotina é OK, durante este período, mas deve ser distribuída igualmente para todos os ratos. Tome cuidado para evitar o emparelhamento da ninhada masculinos e femininos.
  2. Enriquecimento Ambiental
    1. Use sexualmente maduros (> 8 semanas de idade), do sexo masculino ou feminino ratos da mesma idade.
      NOTA: Normalmente usamos n = 18 ratos para cada experimento, divididas em grupo n = 6 / tratamento.
    2. Após a chegada na zona de exploração de animais mantê-los alojados em padrão idêntico alojados em grupo (SH) (por exemplo, Veja abaixo) condições, nesta fase, por> 3 dias para se aclimatar. Aqui e em todo o experimento, manter estímulos ambientais externos (por exemplo, temperatura ambiente, a luz: ciclo escuro, comida, água, manuseio e limpeza) constante ou distribuir igualmente a todos os ratos.
    3. Para começar o enriquecimento ambiental, atribuir aleatoriamente cada mouse para um dos 3 grupos: SH; roda de corrida (RW), ou ambiente enriquecido (EE) e colocar cada grupo de ratinhos em conjunto numa gaiola limpa idêntico com acesso ad libitum a comida e água.
      NOTA: Aqui, maiores gaiolas de retenção de ratos de todos os grupos, medindo 27 cm de largura, 42 cm de comprimento e 16 cm de profundidade foram usados.
      1. Além disso, fornecer as seguintes condições ambientais para cada grupo: SH compreendendo apenas maca (pelotas de papel ou serragem) no chão; RW SH compreendendo mais 2 rodas de correr; EE compreendendo RW além de brinquedos (cordas, escadas, túneis, e objetos como vazios rolos de papel toalha e pedaços de papel de seda) com os quais a explore, brincar, escalar, esconder, e ninho.
      2. Abrigá-los desta forma continuamente por 14 dias.
        NOTA: pecuária rotina é OK, durante este período, mas deve ser distribuída igualmente para todos os ratos.
    4. Camundongos EE sujeita a adicional 'super-enriquecimento' (SE), colocando-os juntos em uma grande gaiola contendo novas brinquedos para uma hora / dia (mesma hora todos os dias), 5 dias / semana.
      NOTA: Aqui, a 46 centímetros de largura, 69 centímetros de comprimento e 40 cm de profundidade banheira de plástico foi utilizado.
      1. Manter a novidade por apresentar um conjunto diferente de brinquedos cada sessão. Brinquedos que são limpos para ser re-apresentado à ratinhos com água e sabão e etanol a 80% para remover odores.
      2. Após cada sessão de SE, retornar os ratos para sua gaiola EE. SH Handle e RW camundongos o mesmo que os ratos SE (exceto para si SE) ao longo deste período (por exemplo, remover e voltar cada SH e RW rato de e para a sua gaiola).

2. Osmótica Bomba de infusão de cérebro e da cânula de infusão da droga para implantes

  1. Preparação
    1. Use bombas osmóticas estéreis e de infusão de cérebro kits, que estão disponíveis comercialmente. O dia antes da implantação, utilizando uma técnica asséptica, primos dos implantes, preenchendo cada bomba, tubo de ligação e de uma cânula com uma solução de droga ou veículo estéril (tal como descrito nas instruções fornecidas com as bombas). Ligá-los juntos e incubar em solução salina estéril durante a noite a 37 ° C. Incubar implantes drogas e cheio de veículos separadamente para evitar a contaminação cruzada.
  2. Cirurgia.
    NOTA: Dependendo do país do experimentador, licenças especiais de experimentação animal ou dos subsídios são necessários para perseguir esses tipos de cirurgia e experiências pós-operatório.
    1. Esterilizar todos os equipamentos cirúrgicos e empregar uma técnica asséptica por toda parte. Anestesiar um mouse (por exemplo, usando 1-2% isoflurano no ar) e colocá-lo em um stereheadframe otaxic. Verifique a profundidade da anestesia durante o processo e administrar mais anestésico como necessário (por exemplo, ausência de retirada do membro de aperto nocivo pata é indicativo de anestesia adequada). Garantir a olhos são protegidos de dessecação por pomada lubrificante ocular, e que a temperatura corporal do rato permanece normal durante todo o procedimento.
    2. Fazer uma incisão na linha média através da pele a partir de entre os olhos e terminada 2cm posterior para a extremidade traseira do crânio. Blunt dissecar a pele longe da fáscia para baixo a parte de trás do mouse para criar uma 'bolsa' subcutânea grande o suficiente para caber confortavelmente a bomba e tubo de ligação uma vez que a cânula é implantado (o tubo que liga não deve ser dobrado após a conclusão). Raspe limpar a fáscia de sobre a face dorsal do crânio.
    3. Usando um diâmetro burr dental aproximadamente 1,5 mm, drill down no crânio no estereotáxica apropriado coordenadas uté uma camada fina, flexível de osso continua. Peel esta camada de distância usando uma pinça fina (isso evita danos a dura-máter subjacente e do cérebro com a rebarba dental). Verifique se o crânio é limpo de quaisquer fragmentos de sangue e osso, e não que haja sangramento ainda mais.
    4. Com a cânula realizada por um detentor de uma cânula, colocar a bomba e tubo de ligação para o 'bolso' subcutâneo que recobre as costas do mouse. Em seguida, posicionar a ponta da cânula nas coordenadas estereotáxicas adequadas e sobre a superfície do cérebro. Baixe cuidadosamente a cânula para o cérebro, mas parar de aproximadamente 1 mm de profundidade necessária.
      NOTA: A profundidade restante será negociado após a aplicação da primeira camada de acrílico dental.
    5. Certifique-se de novo a superfície do crânio está limpa e seca, em seguida, preparar um pequeno volume de acrílico dental e use um palito para alisá-lo em toda a área exposta do crânio, inclusive no burr-buraco no crânio em torno the cânula. Antes do acrílico endurece, abaixe a cânula ponta a profundidade restante no alvo.
    6. Prepare um pequeno volume de acrílico dental e camada esta em relação ao primeiro, bem como sobre o suporte de plástico branco para a cânula, para fixar a cânula no lugar. Repita com camadas adicionais de acrílico como necessário.
    7. Uma vez que o acrílico tem endurecido, retire cuidadosamente o suporte da cânula e cortar o plástico guia cânula removível branco usando uma lâmina de bisturi aquecida com uma chama de gás butano. Por último, suturar a pele fechada durante todo o implante.
  3. O tratamento pós-cirúrgico de Animais
    1. Aplicar pomada anti-séptico para as margens de pele, e administrar um agente anti-inflamatório para o rato (por exemplo meloxicam, 3 mg / kg sc). Remover o mouse do quadro, coloque-o sob uma lâmpada de calor, e observar até que ele recupere a consciência. Não devolva um rato que foi submetido a cirurgia para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado.
      NOTA: Expmanipulações erimental como emparelhamento de gênero e meio ambiente enriquecido pode ser iniciada ou retomada no dia seguinte a cirurgia, no mínimo.
    2. Monitore seu peso corporal, comportamento geral e aparência diária. Trate sinais de infecção (por exemplo, inchaço, vermelhidão, pus) ao redor de incisões cirúrgicas com pomada anti-séptico tópico. Trate quaisquer sinais de doença, dor, stress ou desconforto (por exemplo, perda de> 10% do peso corporal, retraimento social, a falta de preparação, "amaciamento", disfunção do movimento, convulsões) com analgésicos e / ou antibióticos sistêmicos como necessário.
    3. Eutanásia ratos se> 15% de perda de peso ou sintomas da doença, dor, stress ou desconforto são não-reembolsáveis ​​no prazo de 1 semana de tratamento curativo.

3. tecido cerebral preparação, transformação imunohistoquímica, e estereologia

  1. Perfusão
    1. Imediatamente após manipulações / drogas ambientais, preparar o cérebro para o estudo.
      NOTA: Nas experiências relatadas aqui o número de neurónios TH + SNc foram medidos e comparados em cada um dos diferentes grupos de tratamento.
    2. Primeiro administrar uma sobredose de anestésico para matar os ratos (por exemplo, 100 mg / kg ip de sódio pentobarbitona). Uma vez anestesiados, mas antes o coração pára de bater, coloque o mouse sobre as suas costas e gravata ou de definir ambos os membros.
    3. Usando um bisturi de cortar a pele que recobre o tórax, em seguida, uma incisão através do músculo logo abaixo da caixa torácica para dentro da cavidade abdominal. Coloque um grampo no apêndice xifóide da caixa torácica e levante as costelas para cima e longe do fígado expondo o diafragma.
    4. Corte através do diafragma e através das costelas lateralmente em ambos os lados utilizando tesouras grandes até a caixa torácica pode ser dobrada para trás sobre a cabeça para expor os pulmões e coração. Usando uma tesoura fina fazer uma pequena incisão no átrio direito como um ponto de saída de sangue e soluções perfundidos, em seguida, cortar a base do Ventri esquerdacle e colocar uma cânula-se através do ventrículo esquerdo, o átrio esquerdo e na aorta.
    5. Fixar a cânula no lugar depois a bomba quente (37 ° C) heparinizados e 0,1 M de fosfato de solução salina tamponada fisiológica (PBS) através da vasculatura até que a solução que sai do átrio direito é totalmente livre de sangue. Em seguida, a bomba de frio (4 ° C) a solução fixadora (tal como 4% de paraformaldeído em PBS) através da vasculatura, até que todo o rato está bem fixado. Remover o cérebro e o lugar em PBS com 30% de sacarose durante 2-3 dias até os dissipadores cerebrais.
      NOTA: Outros tipos de preparação do tecido pode ser aplicada dependendo da experiência no laboratório correspondente.
  2. Preparação de Cortes congelados de livre flutuação
    1. Corte cortes seriados através das regiões do cérebro de interesse e recolher estes em PBS.
      NOTA: Nós cortamos 40 mm de espessura, utilizando um criostato. Outros tipos de corte de tecido pode ser aplicada dependendo da especialização no correslaboratório ng.
  3. A imuno-histoquímica
    1. Execute imunohistoquímica padrão para proteínas de interesse. Incubar secções em 5% de soro normal de cabra e 0,3% de triton X-100 em PBS à temperatura ambiente durante 30 min, em seguida imunorreagem com anticorpo policlonal de coelho anti-TH (1: 400) a 4 ° C durante 48 hr, em seguida, policlonal biotinilado de cabra anti -rabbit (1: 1000) à temperatura ambiente durante 2 h.
    2. Em seguida, incuba-se avidina-peroxidase (1: 500) à temperatura ambiente durante 1 hora, em seguida, em cobalto-níquel e intensificou-diamino- benzidina (0,5 mg / ml) à temperatura ambiente durante 18-20 min; para a última 3-5 min de incubação a diamino-benzidina adicionar peróxido de hidrogénio (0,01%) para catalisar a precipitação cromagénio. Lave os cortes três vezes para cada 10 min em PBS antes, depois, e entre cada uma das etapas anteriores.
    3. Monte as secções em lâminas de microscópio gelatinizadas, ar secá-las, então Nissl stain (vermelho neutro), desidratar em álcool, claro (X-3B), e lamela.
  4. Estereologia
    1. Estimar o número total de neurônios TH + e TH SNc (LC e VTA) e utilizando métodos estereológicos imparciais. Certifique-se de que o stereologist é cego para o tratamento recebido. Excluir células gliais com base na soma diâmetro <5 um e contam apenas as células com um núcleo visível.
    2. Identificar o SNc (e VTA e LC) pelas localizações espaciais de células TH + e as estruturas anatómicas / limites de acordo com o atlas do cérebro de Paxinos e Watson 7. Contagem de células TH + no interior de um quadro de contagem (55 x 55 mm = 3,025 uM 2) em intervalos pré-determinados regularmente (x = 140 mm, y = 140 uM para SNc; x = 100 um, y = 100 mm para VTA e LC) ao longo de cada núcleo em cada quarta secção.

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Resultados

Ratos adultos submetidos a essas manipulações ambientais alteraram número de mesencéfalo (SNC e VTA), mas não LC, TH + neurônios, e EE mais infusão mesencéfalo simultânea de picrotoxin ou bicuculina (GABA os antagonistas do receptor) abole EE-indução de mais SNc TH + neurônios. Estes dados foram previamente publicados em 6. Os presentes dados foram compilados em experiências duplicadas realizados como parte desse estudo anterior, mas não foram publicados em outros lugares.

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Discussão

Manipulações ambientais

A motivação por trás do design dessas manipulações ambientais (emparelhamento de gênero e de enriquecimento ambiental) foi determinar se o meio ambiente, e / ou comportamento solicitado pelo ambiente, está associado a alterações no número de neurônios DA mesencéfalo. O foco foi, portanto, no fornecimento de ambientes e estimular comportamentos que são propensos a se envolver sinalização DA mesencéfalo. Estes emparelhamento incluído com o sexo oposto, e enriqu...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pelo Projeto do Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica da Austrália (NHMRC) 1022839. AJH é um Australian Research Council (ARC) FT3 Future Fellow (FT100100835). O Instituto Florey de Neurociência e Saúde Mental reconhece o apoio do Subsídio de Apoio à Infraestrutura Operacional do Governo de Victoria.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
IsofluoranoBaxter Healthcare Pty Ltd, Baxter Drive, NSW 2146, AustráliaAHN3640
ALZET Bomba osmótica 1002DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-05300004317
ALZET Kit de infusão cerebral 1DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-05300004760
Suporte de cânula ALZET 1DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-05300008860
Vertex Monomer Self-curing (solvente acrílico dental)Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, Holandan/a
Vertex Self Curing (pó acrílico dental)Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, Holandan/a
METACAM (Meloxicam)Troy Laboratories, 98 long Street, smithfield NSW 2164 AustráliaL10100
Pentobarbitão de sódioLethabarb, Virbac, Milperra, NSW, Austrália571177
Soro de cabra normalchemicon-temecula, CAS26-Litre
Triton X-100Merck Millipore Headquarters, 290 Concord road, Billerica, MA 018211.08603.1000
Coelho policlonal anti-tirosina hidroxilaseMerck Millipore Headquarters, 290 Concord road, Billerica, MA 01821AB152
Cabra biotinilada policlonal anti-coelhoDako Australia Pty. Ltd., Suite 4, Nível 4, 56 Berry street, North Sydney, NSW, Austrália 2060EO432
Avidin peroxidaseSigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AUA3151-1mg
DiaminobenzidinaSigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AUD-5637
Investigador estéreoMicroBrightField Bioscience, 185 Allen Brook Lane, Suite 101, Williston, VT 05495n/a

Referências

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