Introduction
この論文の目的は、具体的にヒト末梢血単核細胞（PBMC）から得られたヒトIgGモノクローナル抗体を作製し、特徴づけるための方法を記述することです。
ヒト抗体を研究するための関心は、研究のさまざまな分野に成長しました。特に、多くの研究グループは、自己抗体によって引き起こされる病理1-3に興味を持っています。我々は、クローン化され、1病原性の自己抗体を特徴としています。自己抗体の研究は、競合抗体4を使用して、 例えば 、それらの標的を同定し、治療戦略を開発するのに役立ちます。また、ヒト抗体の研究はまた、露出して特定の病原体6または研究するためにどのに耐性となった個体の抗体プロフィールを特徴付けるために、ワクチン接種後5免疫応答を評価するために、 すなわち 、研究の他の分野に関心のものであることができます抗体がです天然のレパートリー7,12。
いくつかの技術が、組換えヒトモノクローナル抗体8-12を生成するために開発されています。これらのほとんどは、ファージディスプレイおよびB細胞の不死化を使用します。ファージディスプレイの使用は、広範囲に新13抗体の検出に適用されています。しかし、となるヒト免疫グロブリンの重鎖および軽鎖対は、プロセス中に解離していること、すなわち、主要な欠点を有します。ヒトB細胞またはEBV形質転換とハイブリドーマの生産は、この欠点を克服します。
我々は、Toll様受容体9（TLR-9）、6,12を介して、ポリクローナルB細胞刺激と組み合わせたEBVで胸腺B細胞の感染を使用します。
本稿では、in vitroでの抗体生成にPBMC単離からのすべてのステップの完全な概要と、詳細に我々は、IgGヒト抗体の開発のために使用する技術が記載されています。このこのプロトコルは、ヒトIgGのプロファイルのいずれかのタイプの分析のために使用することができます。我々の研究室では、IgG抗体を産生するB細胞が正常にソートした後のPBMCの残りの部分から分離されました。五8は 、マルチウェルプレートに播種し、単一のB細胞のクローン性増殖のために、EBV及びTLR-9活性化によって不死化することができるB細胞を選別しました。フィーダー細胞としては、ヒト胎児肺組織からの線維芽細胞は、不死化B細胞の可視化を容易にする細胞系WI38が、使用されています。これらのB細胞から、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の配列を、PCRにより得ることができる、および抗体」遺伝子は、免疫グロブリンGを発現ベクター中にクローン化し、 インビトロで生成しました。この技術を用いて、ドナーに見られる全く同じ抗体配列を有する単一の抗体を試験することができます。
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Protocol
インフォームドコンセントは、研究の参加者から得ました。研究は施設内倫理委員会によって承認されました。
末梢血単核細胞（PBMC）の単離1。
- 遠心分離機できるだけ早く血液抽出後の15分間、900×gで参加者のヘパリン化血液の25ミリリットル、。少ない血液がある場合は、それに応じて試薬を縮小。フード内のすべての次の手順を実行します。
- きれいなチューブに血清を転送します。これは、自己抗体を試験するために、PBMCを凍結するため、または自己免疫患者の場合には、後の工程で使用することができます。
- RPMI 1640培地10mlで血液を希釈し、ピペッティングにより細胞を再懸濁。
- 新しい50mlチューブにポリスクロースおよびナトリウムジアトリゾエート（1.077グラム/ ml）を含む溶液15mlを加えます。
- 優しくチューブ近いtogetの二つの開口部をもたらすことにより、ステップ1.4において、溶液の上に血を層彼女は、二つの液体が接触するように非常にゆっくりと来て、その後、50mlのチューブの上にゆっくりとPBMC懸濁液をデカントまで。このステップは、PBMCの良好な分離を持っていることが重要です。
- 室温で20分間ブレーキなしで400×gでステップ1.5で得られたチューブを遠心します。
- 遠心分離後、ピペットでのPBMCが含まれているチューブの中央部に表示される白い輪を回復。
- RPMI 1640培地25mlで細胞を洗浄します。
- 10分間室温で300×gでの遠心分離。
- 上清を捨て、ステップ1.9のように再びRPMI 1640遠心の10mlで細胞を洗浄。
- 以前に14を報告したようにノイバウアー室でのPBMCをカウントします。
- 10％のジメチルスルホキシド（DMSO）、ステップ1.2で得られた90％の血清1mlに希釈したクライオバイアルチューブあたり凍結する千万のPBMCを次のようにセクション2とのPBMCを処理または後で使用するためにそれらを保存します。次第に凍結と長いSTOのため液体窒素中で激怒。
2.染色したPBMC細胞サイトメトリーによりCD22 +およびIgG +をソートします
- （L-グルタミン、10mMのHEPES緩衝液、50 U / mlペニシリン、50μg/ mlのストレプトマイシンおよびウシ胎児血清10％を補充した）完全RPMI 1640培地を6 mlの25cm 2の細胞培養フラスコ中のPBMCをプレートそれらは、5％CO 2で37℃のインキュベーター中のO / Nを回復しよう。
- 滅菌4％アルブミンリン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液中のO / Nとの無菌FACSチューブをブロックします。 PBSで2回チューブを洗浄し、完全RPMI 1640培地500μlのでそれらを埋めます。ソートした後、細胞を回収するためのこれらのチューブを使用してください。
- 室温で5分間400×gでチューブと遠心分離機でのPBMCを収集します。
- 標識バッファーで細胞を再懸濁し（ステップ2.5および2.6を参照）、それらに14を数えます。標識化緩衝液は、無菌の、2％ウシ胎児血清および1mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）であるPBS。
- 10 5細胞をそれぞれ3蛍光活性化細胞選別（FACS）のチューブを準備し、標識化緩衝液100μlに再懸濁します。これらのチューブは、ソートのゲートを定義するために役立つであろう。
- 第1のチューブでは第3チューブ内の第二の管20（メーカーのデータシートで推奨）抗IgGのPEのμL、および何もで、（製造業者のデータシートに推奨）抗CD22 PerCPを抗体の5μlを添加します。 30分の間、氷の上で、暗所でインキュベートします。
- FACSチューブ中の標識緩衝液200μl中に再懸濁し500万細胞と抗CD22 PerCPを10μlのと抗IgGのPEの40μlを添加します。 30分の間、氷と暗い上の細胞をインキュベートします。細胞のより多数の選別が必要な場合は、すべての試薬をスケールアップ。
- RTで5分間ローブレーキ400×gで遠心分離細胞。
- そっと上清を除去。
- 500μで細胞を再懸濁標識バッファーのL。 RTで5分間ローブレーキ400×gで遠心分離細胞。繰り返しは2.7と2.8のステップ
- そっと上清を除去し、RPMI完全培地300μlの細胞を再懸濁。
- 0.45μmのフィルターを通して細胞を渡します。細胞は、ソートする準備が整いました。
B細胞CD22 +およびIgGの3ソート+
- 細胞の生存率を確立するために3コントロールチューブを使用してください。染色なしでのコントロールでは、リンパ球のゲーティングを定義するために、順方向および大きさの散布図を使用しています。 CD22 PerCPをと抗IgG PEとコントロールがゲート、およびソートゲートを確立するのに役立ちます。以前に報告されたデータ15次を実行します。
注：ゲートが大規模なセットから、我々の場合細胞において、フローサイトメトリーイベントの特定のグループを分離するのに役立つ値の上限（境界）のセットです。ソートゲート値の制限の場合の内側にあるサイトメトリーイベント、細胞の回収を可能にします定義された境界：CD22 +およびIgG +。 - ソートでコレクションチューブとしては、ステップ2.2から得られた完全RPMI 1640培地500μlの、でブロックチューブを使用しています。
- 15二重陽性をソートするために進んでください：CD22 +のIgG +。各条件における細胞の最終的な数に注意してください。プレートは、できるだけ早くフィーダー細胞の上に細胞を選別しました。
フィーダー細胞の4照射
注：1の間のフィーダー細胞の調製の実行 - ソートする前に、3日。少なくとも5,000 WI38細胞を96ラウンドウェルプレートにウェル当たり必要とされています。手順フードで4.1、4.2および4.4を実行します。
- 細胞の所望の数に達するまで37℃、5％の完全RPMI 1640培地中のCO 2（のPBMCと同じ）でWI38細胞を育成。
- 16前に説明したプロトコルに従って、50グレイでそれらを照射します。 WI38細胞をトリプシン処理し、（c）に再懸濁された後、照射を行いますRPMI培地、または培養フラスコに取り付け、照射後にトリプシン処理WI38とomplete。 WI38細胞の供給業者によって示さトリプシン処理する方法に従ってください。 （全PBMCの1％が、ステップ1.11でカウント）のIgG + B細胞をプレーティングするために必要なウェルをカバーするのに必要な細胞数を照射します。
- 96ラウンドウェルプレートの各ウェルに5,000照射WI38細胞を含有するプレート90μL。 （彼らはより速く蒸発するため）空のプレートの外側の列のウェルのままにして、細胞のみをメッキするためのプレートの中央に60ウェルを使用しています。 200μlのPBSでプレートをフレーミングしている外側のウェルを埋めます。
- 必要になるまで、5％CO 2で37℃のインキュベーター内に配置します。
5.めっきソートPBMCを、EBV感染と成長
- 96ラウンドウェルプレート中のウェル当たりRPMI 1640完全培地（以前メッキウィットの50μl中50細胞をプレーするために、ソートされたPBMCを希釈細胞を照射WI38 H）。 EBVの仕事のために装備フードの手順を実行します。
注：ウェル当たり50細胞の感染は、最適化され、モノクローナル抗体8を製造するための尤度を増加させているが、それは1,6の前に説明したようにPCRによりこれを確認することをお勧めします。 - 96ラウンドウェルプレート17に各ウェルに- （4×10 8ウイルスコピー/ mlの3を含む）EBV上清60μlのを追加します。注意EBV作業中に取られるべきです。
- のCpGを1μg/ mlの（ODN2006）ウェル当たりを追加します。
- 5％CO 2で37℃のインキュベーター中で細胞を残します。
- 視覚的にクローンが1週間後に顕微鏡下で成長して監視します。
注：B細胞増殖のいくつかの例は、結果のセクションで以下に見ることができます。クローンの成長率は変更になる場合があります注意してください、と余分な時間は、ウェルの中央に成長しているいくつかの細胞塊を見て開始する必要があるかもしれません。 - 1 回目 、2週間後ののモニタクローン光顕微鏡下で成長し、最初のメディア交換に進みます。ゆっくりウェルの上部からメディアの90μLをピペットで清潔な96ウェルプレートに収集します。 （B細胞がウェルの底にあるので、それらを吸引するリスクはありません）。
- 各ウェルにするCpG（ODN2006）1μg/ mlのとIL2の50 U / mlを添加した完全RPMI 1640培地100μlのを追加します。クローンが成長している場合は、ステップ6のようにELISAによって、この第1のメディアの交換を分析します。
- 成長クローンを監視し、 第 3とメディアの90μLを取っおよびCpG（ODN2006）1μg/ mlのとの50 U / mlを添加した完全RPMI 1640培地100μlを加えることにより、再び成長の4 週目後にメディアを変更IL2。ステップ6のようにELISAによりIgG産生をモニターするために回収した上清を使用してください。
注：一ヶ月クローンが成長した後、ラウンド細胞股関節の凝集体を観察することによって明らかですtは、通常、ウェル丸底の真ん中にあります。 - このステップでは、同じようにメディアを変更するには、その前の週だけで完全RPMI 1640培地で。それは黄色がかった細胞は、メディア交換が必要になってきている場合は、メディアを変更するには、適切なタイミングを知るための良い指標は、メディアの色です。
- 96ウェルプレートは、大きなクローン（約5×10 5細胞）を含有する場合には、24ウェルプレートの平らなウェルに移します。新しいウェルに完全RPMI 1640培地を300μlを追加します。均一に分散する、新しいウェルに96ウェル成長ピペッティングすることによって、数回ダウンクローン、および転送細胞を再懸濁します。必要なときに新しいメディアを追加します。
- 24ウェルプレートのウェルは、細胞（約5×10 6細胞）に満ちているときは、6ウェルプレートの平らなウェルに移します。新しいウェルに完全RPMI 1640培地2 mlを加え。数回上下にピペッティングすることによって、24ウェルプレート中の細胞を再懸濁し、それらをhomoge配布neously新しいウェル中。
- 必要なときにメディアを追加します。細胞は、培養物中に維持されるべきではない場合、室温で5分間、400×gで細胞をペレット化。 ELISA試験のための上清を保存します。 5分間400×gで再び1×PBS、遠心機で一回、細胞のペレットを洗浄し、RNA抽出まで-80℃で乾燥保存しました。
- ときに、6ウェルプレート中の細胞を、（約20×10 6細胞）60mm培養プレートに移すコンフルエントになります。新しいプレートに完全RPMI 1640培地4mlのを追加します。行われるように5.9と5.10をステップされている6ウェルプレート中の細胞を再懸濁し、それらを転送します。
- 必要なときに新しいメディアを追加します。 90％ウシ胎仔血清および10％DMSO中に3000万/ mlの - このステップでは、10で細胞を凍結します。細胞のより多くの量が求められていた場合は、より大きな表面プレートでクローンの拡大を続けています。
IgGの抗体検出のための6 ELISA
- 50μL/ウェルELISAプレートのOにを分配FヤギFは、（A-B）2抗ヒトFc抗体をコーティング緩衝液で1 200に希釈しました。コーティング緩衝液を50mMのNa 2 CO 3のpH 9.6が含まれています。
- プラスチック製のステッカーとプレートを密封し、37℃で1時間インキュベートします。あるいは、4°CO / Nでインキュベートします。
- 洗浄バッファー200μlで各ウェルを6回洗浄します。洗浄緩衝液は、1×PBS中の0.05％のTween-20が含まれています。抗体が結合したウェル表面に触れたり、傷つけたりしません。
- ブロッキング緩衝液、100μl/ウェルでブロックします。バッファをブロックすると、PBS中脱脂粉乳の4％が含まれています。プレートをシールし、37℃で1時間インキュベートします。
- 洗浄しないでください。ブロッキング緩衝液を捨て、残留液を除去するためにペーパータオルの上に逆さまにプレートを3回平手打ち。
- クローン '上清および標準をインキュベートします。
- 最初のテストでは、RPMIにステップ5.6または5.7 1/3で得られたクローンの上清を希釈します。規格はRPMI培地ヒトIgG溶液で希釈するための取得するには：1,000 NG /mlを、500 ng / mlで、250 ng / mlで、125 ng / mlで、62.5 ng / mlで、31.25 ng / mlで、15.6 ngの/ mlおよびブランク。 50μL/ウェルを使用して、37℃で60分間インキュベートします。このような1/10または1/100などの抗体の親和性をテストするためのクローン '上清の更なる希釈を、分析します。
- ステップ6.3で行われるように洗ってください。
- インキュベーション緩衝液で20,000：50μL/ウェルのヤギFの（AB）1に希釈したコンジュゲート2抗ヒトIgGのFcペルオキシダーゼを使用してください。インキュベーション緩衝液は、1×PBS中の1％BSAおよび0.02％のTween 20を含有します。 60分間37℃でインキュベートします。
- ステップ6.3で行われるように洗ってください。
- 0.1％の3,3 'を含む100μl/ウェルの基質溶液を添加し、5,5'-テトラメチルベンジジン（TMB）。ウェル中の安定した青色が形成されるまで10分インキュベートします。注意してください;あまりにも長い間待っていません！
- 2 MH 2 SO 4を50μlを添加することにより反応を停止させます。反応を停止させた後、30分以内に、450 nmの吸収を測定します。
注：すべてのクローンさんブランクを超える3標準偏差でupernatantsは、IgGヒト抗体について陽性とみなされます。陽性クローンの確認のために、このELISAは、同じクローンの異なる上清中に少なくとも3回繰り返されるべきです。また、非特異的交差反応の可能性を廃棄する上清をコーティングしていない中でインキュベートするが井戸をブロックされているときに信号がないことを保証することをお勧めします。このステップでは、目的の抗体の抗原特異性をスクリーニングするための検出アッセイはセクション7に進む前に行うことができます。
7. RNAの単離および生産のIgGクローンのファーストストランドcDNA合成
- IgGの産生をELISAによって確認されるや否や、クローンのRNAを抽出します。
- 手順5.7または5.9に増殖する細胞からRNAを抽出するための1つのセルに10,000個の細胞からDNAを得ることができ、上付き文字III細胞の直接cDNA合成キットを使用します。
- LARからRNAを抽出するためのステップ5.11に格納されているGER細胞の量、またはペレットから、高い純粋なRNA単離キットを使用しています。 RNA抽出の他のシステムもまた、この段階で適切であり得ます。製造元の指示に従ってください。
- 1×10 6〜1×10 4との間の細胞数については、製造元の指示に従って、逆転写システムを使用しています。第一鎖cDNA合成のための他のシステムを使用することもできます。
8. 第 1およびIgG産生B細胞クローンの重鎖と軽鎖の増幅のための2 回目のPCR
- ステップ6でのIgG ELISAでステップ5.6と5.7とポジティブにして得られた細胞クローンのcDNAを、 表1に記載のプライマーを用いてPCRを行います。
- 各IgG重、κおよびλ鎖のための独立したPCRを設定します。前方にストック溶液を作成し、同じ濃度でリバースプライマー。 0.4μMの最終濃度で反応に追加します。</ LI>
- 1 ST PCRを実行するためにcDNA合成の1μLを使用してください。ここでは、タカラのTaqメーカーの指示を使用して20μlの反応を行います。あるいは、他のポリメラーゼを使用しています。
- 以下のサイクル条件で1 回目のPCRを置き：94℃5分間; （50サイクル：30秒94℃、45秒間、30秒間58℃、72℃、72℃、7分間;それは反応に4°C.Include空白でクールダウンさせ、可能な汚染を検出することができます。
- 1×TBE（89 mMトリス - ホウ酸および2mM EDTA）を準備します。 1×TBEを100mlの容積にアガロース（1％アガロースゲル）1gを加えます。アガロースが溶解されるまで、約1分間、マイクロ波中で溶液を加熱します。その後、10 mg / mlのエチジウムブロマイド（または同等のDNA色素）の4μlを添加し、混合します。
- トレイ内のコンテンツを注ぎ、重合されるまで待ちます。バンドを可視化するためにゲルにPCRミックスの5μLを実行します。重鎖断片400bpの - 軽鎖は約300である必要があり、一方、550 bpの - sが約400である必要があります。バンドが検出されない場合、 第 2のPCRにも同様に進みます。
- 2 回目のPCRを実行するために混ぜ最初のPCRの1μLを使用してください。ステップ8.2が、プライマーの適切な組み合わせを使用して（ 表1を参照）と同じ試薬を使用してください。 2 回目のPCRは、以下の条件を使用します。94℃5分間; ;：（30秒94℃、30秒間56.5℃、55秒間72℃の50サイクル） 7分間72°C;それは4℃で冷却しましょう。可能なPCRの汚染を検出するために、反応中に空白が含まれます。
- 8.5で説明したようにアガロースゲルを準備します。ステップ9でのクローニングのために適切なサイズの断片を含んで増幅を使用して、ステップ10で抗体を産生8.5.1のようにPCR産物を可視化するゲルを実行します。
- 2の100 ngのPCRをND、0：を含む10μlの反応を使用してDNA配列。プライマーまたはプライマーミックスの2μM、ターミネーターの1μlを、バッファの1μlの。 （：、5秒間50℃で、10秒間96℃、4分間60℃の25サイクル：）;これらの条件下で配列決定反応を実行7分60°C;それは4℃で冷却しましょう。
- 製造者の指示に従ってマイクロスピンG50列の配列決定反応を精製します。 18前に説明したように、自動配列解析装置に連結のシーケンスを評価します。電気泳動図は、きれいにし、単一の免疫グロブリン配列に対応する必要があります。
注：PCR産物が不明確または混合免疫グロブリン配列を示している場合は、単離された配列を取得し、ステップ9に進み、TopoTAシステムを使用してそれらのクローンを作成するために検討してください。
生産のIgGクローンの重鎖および軽鎖の9クローニングおよび配列決定
- ベクターの1μgのDNA pFUSE2ss-CLIg-HK、pFUSE2ss-を準備CLIg-HL2とpFUSEss-CHIg-HG1。
- 適当な制限酵素で、これらのベクトルを消化。 pFUSEss-CHIg-HG1のための使用をEco RIおよびBSI WI pFUSE2ss-CLIg-HL2用pFUSE2ss-CLIg-HK、 エコ RIとのAvr IIのための、 および EcoRIとのNheI。ベクターのDNA1μgの各制限酵素の3台を使用してください。
- 一つの酵素で消化し、PCR精製キットを用いて消化生成物を精製。第二の酵素で消化し、ゲル抽出キット（製造業者のプロトコルに従って）で精製します。アガロースゲルから目的のフラグメントをカットします。ステップ8.5のようにアガロースゲルを準備します。
- エコ RIとBSI WIカッパ鎖増幅のため、 エコ RIとのAvr IIラムダ鎖増幅のための、 および EcoRIとのNheI重鎖増幅のための：生産のIgGクローンの2 回目のPCR産物を消化。一つの酵素で消化し、Pで消化生成物を精製CR精製キット。第二の酵素で消化し、PCR精製キットを用いて消化生成物を精製。ステップ9.2のように、酵素とDNA量の同じ単位を使用してください。
- 製造メーカーの推奨事項に従って、CO / N 16°、T4 DNAリガーゼでベクター内のPCR断片を連結。 2（ベクター：インサート）使用率は1でなければなりません。
- DH5α細菌を形質転換するためにライゲーションの1μLを使用してください。形質転換のためのDH5αメーカー「条件に従ってください。使用するベクターの種類に応じて、ブラストサイジンまたはゼオシンプレート中の細菌を広げます。 37℃でプレートO / Nをインキュベートします。
- 製造者の指示に従って、単一のコロニーを育て、そしてミニプレップキットを用いてDNAを抽出します。単一コロニーのために使用します成長し、DNAは、DNAミニプレップキットからメーカーの、提言を抽出。ステップ9.2および9.3のようなベクターおよびインサートを製造するために使用される酵素で消化することにより、それらを分析します。
- usinによる配列のDNA、ステップ8.8と8.9で行ったように、ベクトルgの100 ngの。
HEK細胞における抗体の産生10
- 150ミリメートル細胞培養プレート中で、75％の集密度まで、10％ウシ胎児血清、1％L-グルコース、1％のペニシリン/ストレプトアビジン（DMEM +）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中でHEK細胞を成長させます。フード10.7に10.1を段階的に実行します。
- トランスフェクションの前に、以前のようにあるが、ウシ胎児血清を含まない培地に培地を交換します。
- 各重、軽鎖トランスフェクションのために、DMEM（血清を含まない）の2.5ミリリットル、重鎖ベクターの9μgの、軽鎖とのベクトルの6μgの、およびポリエチレンイミン100μlのトランスフェクションミックスを準備する（PEIを1μg/μlのストックから）の溶液（）。室温で15分間インキュベートします。
- 静かにプレート内のHEK細胞にステップ10.3で調製し、トランスフェクション混合物の2.5ミリリットルを追加します。均一に分配するためにプレートを揺らし。
- で24時間、5％CO 2で37℃のインキュベーター中で細胞をcubate。
- ウシ胎児血清を含まない培地に培地を変更します。
- 4日後、プレートから培地を収集します。
注：培地中の抗体は、in vitroおよびin vivoでそれらの反応性を特徴付けるために使用することができます。
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Representative Results
CD22およびIgG陽性細胞を染色した後の選別ゲートは、 図1に示されているこの画像では二重陽性細胞の面積- 。IgG抗体を産生するB細胞が-別のチューブ内のすべてのこれらの細胞を選別するために選択されます。分析では、全PBMCの約1％が、この二重陽性集団に対応しています。得られた選別された細胞の数は、セクション1で得られた細胞の数に依存します。
EBVの不死化およびCpG（ODN2006）刺激の5週間後に異なる結果を図2に示されている成長しているクローンの検出が容易です。 WI38フィーダー細胞は、より細長い線維芽細胞の形状を有し、B細胞クローンは、丸底、マルチウェルプレートの中央に密集伸長するように非常に小さな丸い細胞現れます。この段階では、いくつかのクローンが成長し始めることが明らかです。しかし、成長速度は、ウェルcontaiのいくつかの変数と当然のものとすることができます寧は、細胞が全く成長している任意のセルを持っていない可能性が不死化。
成長しているクローンの上清を 、 表2に示されるようにIgGを検出するためのELISAで試験する。このELISAでIgGに対する標準曲線はテストされ、一緒にクローンおよびブランクの上清と。陽性クローンをELISAの値がブランク値を超える3標準偏差である場合に考慮されます。負のクローン 'の値は、ブランクの3標準偏差の下にあります。確認のため、陽性クローンは、同じクローンの異なる上清中の少なくとも3倍、ELISAで陽性と追加のスクリーニング方法により検証可能な場合でなければなりません。
本稿で説明した手順を適用して得られたヒトIgG抗体の完全な配列を図3に示す。この配列は、クローン増殖B細胞から免疫グロブリンの重鎖およびラムダ鎖対をクローニングした後に得られました。変数aND重鎖および軽鎖の定常領域は、この技術を用いて特徴付けることができます。配列を得た後、抗体配列をクローニングすることができ、HEK細胞培養インビトロで生産します。
CD22 +およびIgGの図1のフローサイトメトリー解析+ヒト末梢血単核細胞からの細胞（A）生細胞の集団の選択はP1で示されている。（B）前方散乱プロット（C）サイズの散布図（D） Y軸は、抗CD22-PerCPをによっておよびIgG-PEで区切らX軸上で分離した細胞を示します。 P4広場（CD22 +、IgGの+）ソートや文化のために回収された細胞画分を示している。 このFiのの拡大版を表示するには、こちらをクリックしてくださいグレ。
B細胞の図2.代表的画像は、培養の5週間後に96ウェルプレート中のクローンを不死化。このよくない不死化では（A）は、5週間後に観察されたが、WI38照射フィーダー細胞を観察することができる。（B）Aゆっくりと成長しているクローンが真ん中に小さな丸い集合体で、よくこの中で観察された。（C）高速成長しているクローン不死化B細胞の凝集体をラウンド示す。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
ヒト不死化B細胞クローンからの重鎖および軽鎖対の図3のヒト抗体配列、F5V CDR1、CDR2およびCDR3配列を示す.2、。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
| 1 回目のPCRプライマー | ||
| フォワード（5'-3 '） | リバース（3'-5 '） | |
| のIgG | 5 'L-VH 1 ACAGGTGCCCACTCCCAGGTGCAG | 3 'CγCH1 GGAAGGTGTGCACGCCGCTGGTC |
| 5 'L-VH 3 AAGGTGTCCAGTGTGARGTGCAG | ||
| 5 'L-VH 4/6 CCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAG | ||
| 5 'L-VH 5 CAAGGAGTCTGTTCCGAGGTGCAG | ||
| κ | 5 'LVκ1/2 ATGAGGSTCCCYGCTCAGCTGCTGG | 3 'Cκ543 GTTTCTCGTAGTCTGCTTTGCTCA |
| 5 'LVκ3 CTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAG | 3 'Cκ494 GTGCTGTCCTTGCTGTCCTGCT | |
| 5 'LVκ4 ATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTG | ||
| 5 'パンVκATGACCCAGWCTCCABYCWCCCTG | ||
| λ | 5 'LVλ1 GGTCCTGGGCCCAGTCTGTGCTG | 3 'CλCACCAGTGTGGCCTTGTTGGCTTG |
| 5 'LVλ2 GGTCCTGGGCCCAGTCTGCCCTG | ||
| 5 'LVλ3 GCTCTGTGACCTCCTATGAGCTG | ||
| 5 'LVλ4/5 GGTCTCTCTCSCAGCYTGTGCTG | ||
| 5 'LVλ6 GTTCTTGGGCCAATTTTATGCTG | ||
| 5 'LVλ7 GGTCCAATTCYCAGGCTGTGGTG | ||
| 5「LVλ8 GAGTGGATTCTCAGACTGTGGTG | ||
| 2 回目のPCRプライマー | ||
| フォワード（5'-3 '） | リバース（3'-5 '） | |
| のIgH | 5 'にEcoRI VH1 CAACCGGAATTCGCAGGTGCAGCTGG TGCAG | 3 'をNheI JH 1,2,4,5- CTGCTAGCTAGCTGAGGAGACGGT GACCAG |
| 5 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCTGの5 'にEcoRI VH1 GTGCAG | 3 'をNheI JH 3 CTGCTAGCTAGCTGAGAGACGGTGA CCATTG | |
| 5 'にEcoRI VH3 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCTG GTGGAG | 3 'をNheI JH 6 CTGCTAGCTAGCTGAGGAGACGGTG ACCGTG | |
| 5 'にEcoRI VH3 23 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCT GTTGGAG | ||
| 5 'にEcoRI VH4 CAACCGGAATTCACAGGTGCAGCT GCAGGAG | ||
| 5 'にEcoRI VH 4 34 CAACCGGAATTCACAGGTGCAGCTAC AGCAGTG | ||
| 5 'にEcoRI VH 1 18 CTTCCGGAATTCACAGGTTCAGCT GGTGCAG | ||
| 5 'にEcoRI VH 1 24 CTTCCGGAATTCACAGGTCCAGCT GGTACAG | ||
| 5 'にEcoRI VH3 33 CTTCCGGAATTCACAGGTGCAGCT GGTGGAG | ||
| 5 'EcoRIVH 3 9 GATCCGGAATTCAGAAGTGCAGCT GGTGGAG | ||
| 5 'にEcoRI VH4 39 GATCCGGAATTCACAGCTGCAGCT GCAGGAG | ||
| 5 'にEcoRI VH 6 1 GATCCGGAATTCACAGGTACAGCT GCAGCAG | ||
| κ | 5 'のEcoRIVκ1 5 CAACCGGAATTCAGACATCCAGATGA CCCAGTC | 3 'のBsiWIJκ1〜4 GCCACCGTACGTTTGATYTCCACCTTGGTC |
| 5 'のEcoR1Vκ1 9 CTTCCGGAATTCAGACATCCAGTTGAC CCAGTCT | 3 'のBsiWIJκ2 GCCACCGTACG TTTGATCTCCAG CTTGGTC | |
| 5 'のEcoR1Vκ1D 43 CTTGGCGAATTCAGCCATCCGGATGA CCCAGTC | 3 'のBsiWIJκ3 GCCACCGTACGTTTGATATCCACT TTGGTC | |
| 5 'のEcoR1Vκ2 24 CTTCCGGAATTCAGATATTGTGATGA CCCAGAC | ||
| 5 'のEcoR1Vκ2 28 CTTCCGGAATTCAGATATTGTGATG ACTCAGTC | ||
| 5 'のEcoR1Vκ2 30 CTTCCGGAATTCAGATGTTGTGATGA CTCAGTC | ||
| 5 'のEcoR1Vκ3 11 CTTCCGGAATTCAGAAATTGTGTTG ACACAGTC | ||
| 5 'のEcoR1Vκ3 15 CTTCCGGAATTCAGAAATAGTGATG ACGCAGTC | ||
| 5 'のEcoR1Vκ3 20 CTTCCGGAATTCAGAAATTGTGTTGA CGCAGTCT | ||
| 5 'のEcoR1Vκ4 1 CTTCCGGAATTCAGACATCGTGATG ACCCAGTC | ||
| 5 'のEcoR1Vλ1 CTTCCGGAATTCACAGTCTGTGCT GACKCAG | 3 'のAvrIIJλ1〜3 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTSACCT TGGTCCC | |
| 5 'のEcoR1Vλ2 CTTCCGGAATTCACAGTCTGCCC TGACTCAG | 3 'のAvrIIJλ4 CTGGTTACCTAGGAAAATGATCAGC TGGGTTCC | |
| 5 'のEcoR1Vλ3 CTTCCGGAATTCATCCTATGAGC TGACWCAG | 3 'のAvrIIJλ5 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAGC TCGGTCCC | |
| 5 'のEcoR1Vλ4~5 CTTCCGGAATTCACAGCYTGTG CTGACTCA | 3 'のAvrIIJλ6 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAGCT GGGTGCC | |
| 5 'のEcoR1Vλ6 CTTCCGGAATTCAAATTTTATGC TGACTCAG | 3 'のAvrIIJλ7 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAC TTGGTCCAT | |
| 5 'のEcoR1Vλ7~8 CTTCCGGAATTCACAGRCTGTG GTGACYCAG | ||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | 0.076 | 0.077 | 2.003 | 0.080 | 0.138 | 0.102 | 0.188 | 0.338 | 0.040 | 2.041 | 0.051 | 0.081 |
| B | 2.011 | 0.085 | 0.074 | 0.069 | 0.081 | 0.122 | 0.372 | 2.133 | 0.119 | 0.097 | 0.072 | 0.072 |
| C言語 | 0.068 | 0.179 | 0.091 | 0.073 | 0.077 | 0.097 | 0.606 | 1.882 | 0.081 | 2.071 | 0.094 | 0.075 |
| D | 0.063 | 0.070 | 0.065 | 0.071 | 0.082 | 2.071 | 0.339 | 2.089 | 0.076 | 0.086 | 0.066 | 0.069 |
| E | 1.921 | 0.077 | 0.065 | 0.085 | 0.095 | 1.968 | 1.910 | 0.122 | 0.072 | 0.070 | 0.065 | 0.066 |
| F | 0.113 | 0.068 | 0.066 | 0.082 | 0.088 | 0.090 | 0.460 | 0.070 | 0.079 | 0.952 | 0.098 | 0.065 |
| G | 2.041 | 2.108 | 1.472 | 0.665 | 0.331 | 0.194 | 0.123 | 0.094 | EFT "> 0.0800.072 | 0.070 | 0.072 | |
| H | 2.146 | 2.132 | 1.634 | 0.665 | 0.341 | 0.178 | 0.132 | 0.094 | 0.082 | 0.080 | 0.074 | 0.068 |
| 標準ng /μLで | 1000年 | 500 | 250 | 125 | 62.5 | 31.25 | 15.6 | 7.8 | 3.9 | 1.95 | 0.975 | 0 |
ELISAによるIgGスクリーニングの表2代表的な結果。複製した上清は、A1-A10、B1〜B10、C1-C10、D1-D10、E1-E10、F1-F10です。 G1-G12とH1-H12：ブランクはA11、B11、C11、D11、E11、F11、A12、B12、C12、D12、E12、F12.Standard曲線が重複しているしています。各重複中の免疫グロブリンの相当する濃度はbelow.PositiveまたはIgG産生クローンが濃い灰色で表示され示されています。負または非IgGを産生するクローンは薄いグレーで表示されています
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Discussion
本稿では、ヒトPBMCからのIgG抗体の生成のためのすべてのステップを詳細に示します。このプロトコルは、以前に公表された技術を超えるいくつかの利点が含まれています。利点の一つは、産生された抗体は、B細胞クローンの元の対に対応する重鎖および軽鎖を保つことです。 IgG抗体の同定は、ヒトドナーの任意のタイプで行うことができ、ワクチン接種5による免疫応答の悪化を必要としません。それらは形態学的に異なると区別することは非常に容易であるので、フィーダー細胞として線維芽細胞株の使用WI38は、前述の作品にフィーダー細胞として使用したPBMCと比較して、成長しているクローンのより迅速な検出を可能にします1,6- 8。またフィーダー細胞としてWI38の使用が簡単にすべての実験の前に解凍し、培養することができる細胞アリコートの大量の凍結を促進します。
クリティカルの一つこのプロトコルでiCalの手順では、原料である：PBMCを。血液は遠心分離のためにあまりにも長い間待っていた場合、またはPBMCの抽出後、彼らは、適切な凍結条件に保存されません。生存細胞の数は、例えば、得られたクローンを産生するB細胞のIgGの数とともに、減少するように。そのため、初期の抽出およびPBMCの良好な保存が成功した結果をお勧めします。 IgGを産生するクローンの数は、実験の開始時のPBMCの数に限定されます。 PBMCの高い数値は、IgG産生クローンの多様な抗体産生の高い数値が得られます。もう一つの重要なステップは、抗体の軽鎖および重鎖のPCRフラグメントのクローニングです。連結はいくつかの試みの後に成功しない場合、TopoTAシステムにおける2 回目のPCR産物をクローニングする追加のステップが推奨されます。適切な酵素を用いたインサートの消化がより容易にすることができますTopoTAベクトルで、pFUSEss発現ベクターにおけるその後のライゲーションのために。
この技術は、ヒトB細胞が3富化されたヒト組織の任意のタイプに転送することができます。また、単に、PCRのためのプライマーの設計、及び発現するベクター（IgM、IgE、IgAまたはIgDに対する抗体）を選別するために使用される標識抗体を変更することにより、免疫グロブリンの他のタイプの研究に適用することができます。これらの免疫グロブリンの研究は、特に初期の免疫応答、粘膜抗体分泌及びアレルギープロファイルを理解することが重要であることができます。
結論として、我々は、完全なヒト免疫グロブリンの重鎖および軽鎖のペアを残しヒト組換えモノクローナルIgG抗体を産生するための技術を記載しています。技術は、血液サンプルから始まる実行するのに便利で簡単です。この方法によって得られたモノクローナル抗体は、ヒトの免疫の研究に有用である可能性があります回答。さらに、この方法で産生されたモノクローナル抗体は、様々な病理学的状態のための免疫治療薬の開発のための良い出発点であるかもしれません。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係がないことを宣言します。
Acknowledgments
研究契約ミゲルServet（ISCIII CD14 / 00032）から（GN-G。）。 （CH）の科学研究「トランスレーショナル神経科学プログラム研究科 "のオランダ機構（022005019）からフェローシップ。
プリンセスベアトリクスフォン（プロジェクトWAR08-12）と協会フランセーズcontreレミオパシーからの補助金（PM-M。）;ならびに科学研究費オランダ機構（916.10.148）のVeniフェローシップによるオランダの脳財団のフェローシップ（FS2008（1）-28）とプリンセスビアトリクスフォン（プロジェクトWAR08-12）（MLへ）。
我々は、フローサイトメトリーによる選別B細胞の彼女の助けのためJozienヤスパースに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | solution containing polysucrose and sodium diatrizoate |
| FACSAria II cell sorter | BD Biosciences | ||
| 96 U-bottom micro well plates | Costar | 3799 | |
| Advanced Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco, Life Technologies | 12633-020 | |
| 30% v/v EBV-containing supernatant of the B95-8 cell line | ATCC | CRL-1612 | 3.4 x 108 copies/ml |
| CpG2006 | Invivogen | ODN 7909 | |
| Wi38 cells | Sigma-Aldrich | 90020107 | |
| Interleukin-2 | Roche | 10799068001 | |
| ELISA plates | Greiner Bio-One, Microlon | 655092 | |
| AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific (unconjugated) | Jackson ImmunoResearch | 109-006-008 | |
| 4% non-fat dry milk (Blotting Grade Blocker) | Biorad | 170-6404 | |
| Human IgG | Sigma | I 2511 | HUMAN IgG purified Immunoglobulin, 5.6 mg/ml |
| Goat F(ab)2 antihuman IgG Fcγ (conjugated with peroxidase (PO)) | Jackson ImmunoResearch | 109-036-008 | |
| ELISA reader (Perkin Elmer 2030) | Perkin Elmer | 2030-0050 | |
| Peroxidase-conjugated AffiniPure Rabbit Anti-Human IgM, Fc5µ | Jackson ImmunoResearch | 309-035-095 | |
| SuperScript III Cells Direct cDNA Synthesis System | Invitrogen | 18080-200 | |
| Applied Biosystems (ABI) GeneAm PCR System 2700 | Applied Biosystems | ||
| High Pure RNA Isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| Reverse transcription system kit | Promega | A3500 | |
| Recombinant Taq DNA Polymerase | TAKARA | R001A | |
| Primers (2 μl) | Sigma | ||
| Ultrapure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 100 bp ladder | Invitrogen | 15628-019 | |
| Quantity One 4.5.2 (Gel Doc 2000) | Biorad | 170-8100 | |
| QIAquick PCR purification kit | QIAGEN | 28106 | |
| BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit | Applied Biosystems | 4337455 | |
| 0.1 ml reaction plate (MicroAMP Optical 96-well) | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Genetic analyser ABI300 | Applied Biosystems | 4346906 | |
| DH5α competent cells (E. coli) | Invitrogen | 18263-012 | |
| pFUSEss-CHIg-hG1 (4,493 bp) | Invivogen | pfusess-hchg1 | |
| pFUSEss-CHIg-hG4 (4,484 bp) | Invivogen | pfusess-hchg4 | |
| pFUSE2ss-CLIg-hk (3,875 bp) | Invivogen | pfuse2ss-hclk | |
| pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3,883 bp) | Invivogen | pfuse2ss-hcll2 | |
| SOC medium | Invitrogen | 15544-034 | |
| LB-based agar medium supplemented with Zeocin (Fast-Media Zeo Agar) | Invivogen | fas-zn-s | |
| Terrific Broth (TB)-based liquid medium supplemented with Zeocin (Fast-Media Zeo TB) | Invivogen | fas-zn-l | |
| DNA Miniprep kit | Omega Bio Technology | D6942-02 | |
| Nanodrop (ND1000 Spectrophotometer) | Nanodrop | ||
| LB-based agar medium supplemented with Blasticidin (Fast-Media Blast Agar) | Invivogen | fas-bl-s | |
| Terrific Broth (TB)-based liquid medium supplemented with Blasticidin (Fast-Media Blast TB) | Invivogen | fas-bl-l | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | 20,000 U/ml, in 10x NEBuffer EcoRI |
| NheI | New England Biolabs | R0131S | 10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 2.1 |
| 2-Log DNA ladder | New England Biolabs | N3200S | 0.1-10.0 kb, 1,000 μg/ml |
| XmaI | New England Biolabs | R0180S | 10,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer |
| BsiWI | New England Biolabs | R0553S | 10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 3.1 |
| AvrII | New England Biolabs | R0174S | 5,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase | Thermo Scientific | EF0651 | 1 U/µl, in 10x FastAP Buffer |
| DH5α competent cells | Invitrogen | 18263-012 | |
| PE Mouse Anti-Human IgG | BD Pharmingen | 555787 | |
| anti-CD22, PerCP-Cy5.5, Clone: HIB22 | Fisher scientific | BDB563942 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | |
| BigDye Terminator v3.1 | Applied Biosystems | 4337455 |
References
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