Introduction
O objetivo deste artigo é descrever em detalhe uma metodologia para gerar e caracterizar anticorpos monoclonais IgG humanas obtidas a partir de células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC).
O interesse em estudar anticorpos humanos tem crescido em muitos campos diferentes de pesquisa. Em particular, muitos grupos de pesquisa estão interessados na patologia causada por auto-anticorpos 1-3. Clonámos e caracterizado auto-anticorpos patogénicos 1. O estudo de auto-anticorpos podem ajudar a identificar as suas metas e desenvolver estratégias terapêuticas, por exemplo, utilizando anticorpos concorrente 4. Além disso, o estudo de anticorpos humanos podem também ser de interesse em outras áreas de pesquisa, ou seja, para avaliar a resposta imune após a vacinação 5, para caracterizar o perfil de anticorpos de indivíduos que foram expostos e se tornaram resistentes a patógenos específicos 6 ou para estudar quais Os anticorpos são emo repertório singular 7,12.
Diversas técnicas têm sido desenvolvidas para gerar anticorpos monoclonais humanos recombinantes 8-12; A maioria destes usar exibição em fagos e imortalização de células B. O uso de exibição em fagos tem sido amplamente aplicada para a descoberta de novos anticorpos 13. No entanto, tem um grande inconveniente, isto é, que os pares de cadeia pesada e leve da imunoglobulina humana estão dissociados no processo. A produção de hibridomas com células B humanas ou transformação EBV supera esta desvantagem.
Usamos a infecção das células B timo com EBV em associação com a estimulação das células B policlonais através do receptor Toll-like? 9 (TLR-9) 6,12.
Neste artigo, descreve detalhadamente a tecnologia que nós usamos para o desenvolvimento de anticorpos humanos IgG, com uma visão completa de todos os passos do PBMC isolamento para a geração de anticorpos em vitro. Esteprotocolo pode ser utilizado para a análise de qualquer tipo de perfil de IgG humana. No nosso laboratório, as células B produtoras de anticorpos de IgG têm sido separados com sucesso a partir do resto de PBMC após separação. Cinquenta células B ordenadas 8 podem então ser plaqueadas em placas multi-poços e imortalizadas por EBV e TLR-9 activação, para a expansão clonal de células B individuais. Como células de alimentação, os fibroblastos a partir de tecido de pulmão embrionário humano têm sido utilizados, linha de células WI38, o que facilita a visualização das células B imortalizadas. A partir destas células B, as sequências das cadeias pesada e leve da imunoglobulina pode ser obtido por PCR, e os genes dos anticorpos de imunoglobulina G clonado em vectores de expressão e produzido in vitro. Usando esta técnica, os anticorpos individuais com exactamente a mesma sequência de anticorpo encontradas no dador pode ser estudada.
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Protocol
O consentimento informado foi obtido dos participantes do estudo. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética institucional.
1. Isolamento de Células Mononucleares do Sangue Periférico (PBMC)
- Centrifugar 25 ml de sangue heparinizado dos participantes a 900 xg durante 15 min, o mais rapidamente possível após a extracção de sangue. Se houver menos sangue, reduza os reagentes em conformidade. Execute todos os próximos passos em uma capa.
- Transferir o soro para um tubo limpo. Ele pode ser usado em passos posteriores para a congelação de PBMC ou no caso de doentes auto-imunes, para testar a auto-anticorpos.
- Diluir o sangue com 10 ml de RPMI 1640 e voltar a suspender as células por pipetagem cima e para baixo.
- Adicionar 15 ml de uma solução contendo polissacarose e diatrizoato de sódio (1,077 g / ml) para um novo tubo de 50 ml.
- Suavemente camada do sangue na parte superior da solução no passo 1.4, trazendo as duas aberturas de tubos a fim Togetela até que os dois líquidos chegar muito lentamente em contacto, e, em seguida, decanta-se a suspensão de PBMC lentamente na parte superior do tubo de 50 ml. Este passo é crítico para ter uma boa separação de PBMCs.
- Centrifuga-se o tubo obtido no passo 1.5 a 400 xg sem travão, à TA durante 20 min.
- Após a centrifugação, com a pipeta de recuperar o anel branco que aparece na parte central do tubo, que contém as PBMC.
- Lavam-se as células com 25 ml de meio RPMI 1640.
- Centrifugar a 300 xg à temperatura ambiente durante 10 min.
- Descartar o sobrenadante e lava-se as células com 10 ml de meio RPMI 1640. Centrifugar novamente como no passo 1.9.
- Contar as PBMC com uma câmara de Neubauer conforme relatado anteriormente 14.
- Processar a PBMC como na seção 2 ou armazená-los para uso posterior da seguinte forma: 10 milhões de PBMC para o congelamento por tubo cryovial diluído em 1 ml de 10% de dimetil sulfóxido (DMSO) e 90% de soro obtidas no passo 1.2. Congelar progressivamente e por muito tempo storaiva em nitrogênio líquido.
2. Coloração PBMC para Classificando CD22 + e IgG + por celular Citometria
- Placa as CMSPs em um frasco de cultura 2 de células de 25 cm com 6 ml de meio RPMI 1640 completo (suplementado com L-glutamina, tampão HEPES 10 mM, 50 U / ml de penicilina, 50 ug / ml de estreptomicina e 10% de soro fetal de bovino) e deixá-los recuperar S / N na incubadora a 37 ° C em 5% de CO 2.
- Bloquear tubos de FACS estéreis estéril com 4% de albumina de soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS), solução de O / N. Lavar os tubos duas vezes com PBS e os encher com 500 uL de meio RPMI 1640 completo. Use estes tubos para recuperar as células após separação.
- Recolher os PBMC para um tubo de centrífuga e a 400 xg à temperatura ambiente durante 5 min.
- Volte a suspender as células em tampão de marcação (veja as etapas 2.5 e 2.6) e contá-los 14. O tampão de marcação é estéril 2% de soro fetal bovino e 1 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) em PBS.
- Preparar 3 de separação de células (FACS) tubos activado por fluorescência com 10 células cada 5 e ressuspender-os em 100 ul de tampão de marcação. Estes tubos servirá para definir as portas da classificação.
- No primeiro tubo adicionam-se 5 uL de anticorpo anti-CD22 PerCP (recomendado na folha de dados do fabricante), no segundo tubo 20 ul de IgG anti-PE (recomendado na folha de dados do fabricante), e nada no terceiro tubo. Incubar em gelo e no escuro durante 30 min.
- 5.000.000 Ressuspender as células em 200 ul de tampão de marcação, num tubo de FACS e adicionar 10 ul de anti CD22 PerCP e 40 ul de IgG anti-PE. Incubar as células em gelo e escuro durante 30 min. Se a classificação de um maior número de células é desejado, dimensionar-se todos os reagentes.
- Células centrifugar a 400 xg com um freio de baixa durante 5 min à TA.
- Decantar suavemente o sobrenadante.
- Ressuspender as células em 500 μl de tampão de marcação. Células centrifugar a 400 xg com um freio de baixa durante 5 min à TA. Repita os passos 2.7 e 2.8
- Decantar suavemente o sobrenadante e ressuspender as células em 300 ul de meio completo RPMI.
- Passar as células através de um filtro de 0,45 um. As células estão prontas para classificar.
3. Seleção das células B CD22 + e IgG +
- Use três tubos de controlo para estabelecer a viabilidade das células. No controle sem manchas, use a trama para frente e tamanho de dispersão para definir o gating linfócitos. Os controles com o CD22 PerCP e anti-IgG PE servir para estabelecer as portas eo portão de classificação. Execute seguintes dados relatados anteriormente 15.
Nota: A porta é um conjunto de limites de valor (limites) que servem para isolar um grupo específico de eventos de citometria de, em nossas células de caso, a partir de um grande conjunto. No caso de um portão de triagem dos limites de valor permite a recuperação de acontecimentos de citometria de, células que estão dentro deos limites definidos: CD22 + e + IgG. - Como um tubo de recolha na manipulação, usar os tubos bloqueados com 500 ul de meio completo RPMI 1640, obtidas a partir do passo 2.2.
- Prossiga para classificar dupla positivo 15: CD22 + IgG +. Observe que o número final de células em cada condição. Placa classificados células no topo de células alimentadoras o mais rapidamente possível.
4. A irradiação de células alimentadoras
Nota: Execute a preparação das células alimentadoras entre 1-3 dias antes da ordenação. Pelo menos 5000 células WI38 são necessários por poço numa placa de 96 rodada bem. Realize os passos 4.1, 4.2 e 4.4 em uma capa.
- Cultivar as células WI38, a 37 ° C e 5% de CO 2 em meio completo RPMI 1640 (o mesmo que para as PBMC), até que o número desejado de células é atingido.
- Irradiar-los em 50 Grays, seguindo um protocolo descrito antes de 16. Realizar a irradiação uma vez que as células WI38 foram tripsinizadas e ressuspensas em Complete meio RPMI, com ou WI38 ligado ao frasco de cultura e tripsinizadas após a irradiação. Seguir o método para a tripsinização indicado pelo fornecedor de células WI38. Irradiar o número de células necessárias para cobrir os poços necessários para o plaqueamento de células B de IgG + (1% do total de PBMC contadas no passo 1.11).
- Placa de 90 ul contendo 5,000 irradiadas células WI38 em cada poço da placa 96 rodada bem. Deixar os poços na fila do lado de fora do prato vazio (porque eles evaporam rapidamente), e apenas utilizar os 60 poços no meio da chapa para o plaqueamento das células. Encha as cavidades exteriores que são de moldação da placa com 200 ul de PBS.
- Colocá-los em uma incubadora a 37 ° C em 5% de CO2, até serem necessários.
5. Galvanização Ordenado PBMC, infecção por EBV e Crescer
- Diluir as PBMC ordenadas, a placa 50 células em 50 ul de meio RPMI 1640 completo por poço na placa 96 rodada bem (wit previamente plaqueadash WI38 células irradiadas). Realize os passos em uma capa equipado para o trabalho EBV.
Nota: a infecção da 50 células por poço é optimizada e aumenta a verossimilhança para produzir um anticorpo monoclonal 8, no entanto, recomenda-se a verificar esta por PCR, tal como descrito antes 1,6. - Adicionar 60 ul de sobrenadante de EBV (contendo 3-4 x 10 8 cópias virais / mL) para cada poço na placa de 96 poços 17 rodada. O cuidado deve ser tomado durante o trabalho de EBV.
- Adicionar 1 ug / ml de CpG (ODN2006) por poço.
- Deixar as células em uma incubadora a 37 ° C em 5% de CO 2.
- Clone visualmente monitor de crescimento ao microscópio após uma semana.
Nota: Alguns exemplos de crescimento de células B pode ser visto abaixo, na secção de resultados. Repare que as taxas de crescimento dos clones pode variar, e tempo extra pode ser necessário para começar a ver alguma massa de células em crescimento no meio do poço. - Após o 1º duas semanass monitor de clone crescendo sob o microscópio de luz e avançar para a primeira troca de mídia. Lentamente pipeta 90 ul de meio a partir da parte superior do poço, e em recolher uma placa limpa de 96 poços. (Células B encontram-se na parte inferior do poço, de modo que não existe o risco de aspirar-los).
- Adicionar a cada poço 100 ul de meio RPMI 1640 completo suplementado com 1 ug / ml de CpG (ODN2006) e 50 U / ml de IL2. Se clones estão crescendo, analisar essa primeira troca de mídia por ELISA como na etapa 6.
- Monitorar clone crescente e depois mudar de suporte do 3º e 4º semana de crescimento de novo, tendo 90 ul de meio e adição de 100 ul de RPMI 1640 completo suplementado com 1 ug / ml de CpG (ODN2006) e 50 U / ml de IL2. Utilizar o sobrenadante foi recolhido para monitorizar a produção de IgG por ELISA, tal como no passo 6.
Nota: Depois de um clone mês crescente deve ser evidente através da observação agregados de células redondas de thaT encontram-se geralmente no meio do fundo redondo bem. - Neste passo, mudar de suporte da mesma maneira que as semanas anteriores, mas apenas com meio RPMI 1640 completo. Um bom indicador para saber o momento certo para mudar de mídia é a cor da mídia, se ele está se tornando células amareladas precisar de uma troca de mídia.
- Quando as placas de 96 poços contendo são grandes clones (aproximadamente 5 x 10 5 células), transferi-los para um bem plana de uma placa de 24 poços. Adicione 300 ml de RPMI completo 1640 para o novo bem. Ressuspender o clone 96 poços crescendo, pipetando cima e para baixo várias vezes, e células de transferência para o novo bem, distribuir homogeneamente. Adicionar novos meios de comunicação quando necessário.
- Quando os alvéolos da placa de 24 poços são cheios de células (cerca de 5 x 10 6 células), transferir para um bem plana de uma placa de 6 poços. Adicionar 2 ml de meio RPMI 1640 completo para a nova cavidade. Ressuspender as células na placa de 24 cavidades por pipetagem para cima e para baixo várias vezes, e distribuí-los homogeneamente no novo poço.
- Adicionar mídia quando necessário. Se as células não estão a ser mantidas em cultura, sedimentar as células a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Armazenar os sobrenadantes para teste ELISA. Lava-se a pelete de células uma vez com 1 x PBS, centrifugar novamente a 400 xg durante 5 min, e armazenado seco a -80 ° C até à extracção do ARN.
- Quando as células na placa de 6 poços tornam-se confluentes (aproximadamente 20 x 10 6 células), transferir para uma placa de cultura de 60 mm. Adicione 4 ml de RPMI 1640 completo para a nova placa. Volte a suspender as células em 6 bem-placa e transferi-los como é feito os passos 5.9 e 5.10.
- Adicionar novos meios de comunicação quando necessário. Neste passo, congelar as células em 10-30.000.000 / ml em 90% de soro fetal de vitelo e 10% de DMSO. Se quantidades maiores de células são queria, continuar a expansão dos clones em placas de superfície maiores.
6. ELISA para IgG Detecção de Anticorpos
- Pipetar 50 ul / cavidade em uma placa de ELISA Of cabra F (ab) 2 de anticorpo Fc anti-humano diluído de 1 200 em tampão de revestimento. Tampão de revestimento contém 50 mM de Na 2 CO 3, pH 9,6.
- Selar as placas com um adesivo plástico, e incubar 1 h a 37 ° C. Alternativamente, incuba-se a 4 ° CO / N.
- Lava-se cada poço 6 vezes com 200 ul de tampão de lavagem. Tampão de lavagem contém 0,05% de Tween-20 em 1 x PBS. Não toque nem risque a superfície bem onde o anticorpo se ligou.
- Bloco com tampão de bloqueio, com 100 ul / poço. O tampão de bloqueio contém 4% de leite seco não gordo em PBS. Selar a placa e incubar durante 1 hora a 37 ° C.
- Não lavar. Descarte tampão de bloqueio e tapa a placa 3 vezes de cabeça para baixo sobre um papel toalha para remover o líquido residual.
- Incubar sobrenadantes e normas 'clones.
- Para um primeiro ensaio, diluir sobrenadantes de clones obtidos no passo 5.6 ou 5.7 1/3 em meio RPMI. Para os padrões dilui-se com solução de IgG humana meio RPMI para obter: 1,000 ng /ml, 500 ng / ml, 250 ng / ml, 125 ng / ml, 62,5 ng / ml, 31,25 ng / ml, 15,6 ng / ml e em branco. Utilizar 50 ul / poço e incubar a 37 ° C durante 60 min. Analisar outras diluições do sobrenadante do clone "para testar a afinidade de anticorpos, tais como 1/10 ou 1/100.
- Lave como foi feito no passo 6.3.
- Utilizar 50 ul / poço de cabra F (ab) 2 anti-humano conjugado com peroxidase de IgG Fc diluída 1: 20000 em tampão de incubação. Tampão de incubação contém 1% de BSA e 0,02% de Tween 20 em PBS 1x. Incubar a 37 ° C durante 60 min.
- Lave como foi feito no passo 6.3.
- Adicionar / solução bem substrato 100 ul contendo 0,1% de 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB). Incubar 10 min, até que uma cor azul formas estáveis nos poços. Seja cuidadoso; não espere muito tempo!
- Parar a reacção por adição de 50 ul de 2 H 2 SO 4. Medir a absorção a 450 nm, dentro de 30 minutos após a paragem da reacção.
Nota: Todos os clones 'supernatants com 3 desvios-padrão sobre o branco será considerado positivo para anticorpos humanos IgG. Para a confirmação dos clones positivos de ELISA este deve ser repetido pelo menos três vezes em diferentes sobrenadantes do mesmo clone. Também para descartar a possibilidade de reactividade cruzada não específica é recomendado para assegurar que não há nenhum sinal quando sobrenadantes são incubadas em poços não revestidos, mas bloqueados. Neste passo, um ensaio de detecção para o rastreio de a especificidade antigénica dos anticorpos de interesse pode ser realizada antes de avançar para a secção 7.
7. Isolamento de ARN e First Strand cDNA Synthesis dos Clones IgG Produtores
- Logo que a produção de IgG é confirmada por ELISA, extrair o ARN do clone.
- Para extracção de RNA das células que crescem em passos de 5,7 ou 5,9, utilizar o sobrescrito kit de síntese de ADNc de células III directa, o que permite a obtenção de DNA a partir de 10000 células a uma célula.
- Para a extração de RNA do larger quantidades de células, ou a partir do sedimento armazenado no passo 5.11 utilizar o kit de isolamento de ARN puro alta. Outros sistemas de extracção de ARN, também pode ser adequado a esta etapa. Siga as instruções do fabricante.
- Para o número de células entre 1 x 10 6 e 1 x 10 4 uso do sistema de transcrição reversa, seguindo as instruções do fabricante. Outros sistemas para a síntese da primeira cadeia de cDNA também pode ser utilizado.
8. 1 º e 2 º PCR para amplificação do cadeias pesadas e leves das IgG-produzindo clones de células B
- Com o ADNc dos clones de células, obtidas na etapa 5.6 e 5.7 e positiva no ELISA de IgG no passo 6, realizar PCR com os iniciadores listados na Tabela 1.
- Configure PCRs independentes para cada pesado, kappa e lambda cadeia IgG. Faça uma solução estoque com iniciadores directos e inversos, em concentrações iguais. Adicione-os a reacção a 0,4 uM de concentração final. </ Li>
- Use 1 ul da síntese de cDNA para realizar a PCR 1 ST. Aqui, realizar 20 reações ul utilizando as instruções do fabricante Takara Taq. Em alternativa, utilize outras polimerases.
- Coloque a 1 r de PCR sob as seguintes condições de ciclos: 94 ° C durante 5 min; (50 ciclos de: 94 ° C durante 30 seg; 58 ° C durante 30 segundos e 72 ° C durante 45 seg; 72 ° C durante 7 min, deixe-o arrefecer a 4 ° C.Include um espaço em branco na reacção, para detectar possíveis contaminações.
- Prepare TBE 1x (89 mM Tris-borato e EDTA 2 mM). Num volume de 100 ml de 1x TBE adicionar 1 g de agarose (1% de gel de agarose). Aquece-se a solução no forno de microondas durante cerca de 1 min, até a agarose se dissolve. Em seguida, adicionar 4 mL de 10 mg mL de brometo de (corante de ADN ou equivalente) / etídio e misturar.
- Despeje o conteúdo em uma bandeja e esperar até que se polimerizado. Executar 5 ul de mistura de PCR em gel de visualizar as bandas. Fragmento de cadeia pesadas deve ser em torno de 400-550 pb, enquanto cadeia leve deve ser em torno de 300-400 pb. Se as bandas não são detectados, proceder de igual modo com 2 nd PCR.
- Use um ul da primeira mistura de PCR para executar a 2ª PCR. Use os mesmos reagentes que no passo 8.2, mas utilizando a mistura apropriada de iniciadores (ver Tabela 1). Para os 2 nd usam PCR nas seguintes condições: 94 ° C durante 5 min; (50 ciclos de: 94 ° C durante 30 seg; 56,5 ° C durante 30 seg e 72 ° C durante 55 seg); 72 ° C durante 7 min; deixe-o arrefecer a 4 ° C. Incluir um branco na reacção, para detecção de possíveis contaminações de PCR.
- Preparar um gel de agarose como descrito em 8.5. Execute o gel para visualizar o produto PCR como em 8.5.1 Use as amplificações que contêm os fragmentos de tamanho certo para clonagem na etapa 9 e produzir os anticorpos na etapa 10.
- Sequência do DNA, usando 10 reação l contendo: 100 ng do 2º PCR, 0.2 | iM do iniciador ou mistura de iniciadores, 1 ul do terminador e um l do tampão. Realizar a reacção de sequenciação sob estas condições: (25 ciclos de: 96 ° C durante 10 segundos; 50 ° C durante 5 seg; e a 60 ° C durante 4 min); 60 ° C durante 7 min; deixe-o arrefecer a 4 ° C.
- Purifica-se as reacções de sequenciação com colunas G50 Microspin seguindo as instruções do fabricante. Avaliar as sequências da ligadura em um analisador de seqüência automática como descrito anteriormente 18. Electroferogramas deve ser limpo e correspondem a uma sequência de imunoglobulina.
Nota: Se os produtos de PCR mostrar sequências de imunoglobulina pouco claras ou mistos, por favor considere a cloná-los usando o sistema TopoTA, para obter sequências isoladas e, em seguida, vá para o passo 9.
9. clonagem e sequenciação das cadeias pesadas e leves dos clones produtores de IgG
- Prepare 1 mg de DNA de vetores pFUSE2ss-clig-hk, pFUSE2ss-Clig-hl2 e pFUSEss-Chig-HG1.
- Digerir estes vectores com as enzimas de restrição apropriadas. Use Eco RI e BsiWI para pFUSE2ss-clig-hk, Eco RI e Avr II para pFUSE2ss-clig-hl2, e Eco RI e Nhe I para pFUSEss-Chig-HG1. Use três unidades de cada enzima de restrição durante 1 ug de ADN do vector.
- Digerir com uma enzima e purifica-se o produto digerido com um kit de purificação de PCR. Digerir com a segunda enzima e purifica-se com um kit de extracção de Gel (de acordo com o protocolo do fabricante). Cortar o fragmento de interesse a partir do gel de agarose. Prepare gel de agarose como no passo 8.5.
- Digerir os 2 nd PCR produtos do clone IgG produzindo: Eco RI e BsiWI para a amplificação da cadeia kappa, Eco RI e Avr II para a amplificação da cadeia lambda, e Eco RI e Nhe I para a amplificação da cadeia pesada. Digerir com uma enzima e purifica-se o produto digerido com um PKit de Purificação CR. Digerir com a segunda enzima e purifica-se o produto digerido com um kit de purificação de PCR. Usar as mesmas unidades de enzimas e quantidade de DNA como no passo 9.2.
- Ligar os fragmentos de PCR dentro dos vectores com DNA ligase de T4 recomendações 16 ° CO / N seguintes do fabricante. A razão utilizada deve ser de 1: 2 (vector: inserto).
- Use um ul da ligação para transformar bactérias DH5a. Siga condições DH5ct do fabricante para a transformação. Espalhe bactérias em placas de blasticidina ou zeocina, dependendo do tipo de vector utilizado. Incubar as placas de O / N a 37 ° C.
- Crescer colónias individuais, e extrair DNA com um kit miniprep, seguindo as instruções do fabricante. Use para única colônia crescer e Extração de DNA, as recomendações do fabricante do kit miniprep DNA. Analisá-las por digestão com as enzimas utilizadas para a preparação de vectores e inserções como nos passos 9.2 e 9.3.
- Sequência do DNA, por using 100 ng do vector, tal como feito nos passos 8.8 e 8.9.
10. Produção de anticorpos em células HEK
- Cultivar células HEK em Modified Eagle Médium da Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de vitelo, 1% de L-glicose, 1% de penicilina / estreptavidina (DMEM +) até uma confluência de 75% numa placa de 150 mm de cultura de células. Execute em uma capa passos 10,1-10,7.
- Antes da transfecção, trocar o meio para meio como antes, mas sem soro de vitelo fetal.
- Para cada pesada, cadeia leve de transfecção, preparar uma mistura de transfecção com 2,5 ml de DMEM (sem soro), 9 ug do vector com a cadeia pesada, 6 ug do vector com a cadeia leve, e 100 ul de polietilenimina (PEI solução) (a partir de um estoque de 1 ug / mL). Incubar à temperatura ambiente durante 15 min.
- Suavemente adicionar 2,5 ml da mistura de transfecção, preparado no passo 10.3 para as células HEK na placa. Balance a placa para distribuir de forma homogênea.
- EmCubate as células na incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 24 horas.
- Mudar o meio de cultura para meio sem soro fetal de vitelo.
- Recolhe-se o meio das placas de 4 dias mais tarde.
Nota: Os anticorpos, os meios podem ser utilizados para caracterizar a sua reactividade in vitro e in vivo.
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Representative Results
O gate de triagem após coloração das células positivas de CD22 e IgG é mostrado na Figura 1 Nesta imagem da área das células duplamente positivas -. Células B produtoras de anticorpos IgG - é seleccionado para classificar todas essas células em um tubo separado. Na análise, cerca de 1% do total de PBMC correspondem a esta população positiva dupla. O número de células classificadas obtidos dependerá do número de células obtidas na secção 1.
Os diferentes resultados após 5 semanas de imortalização por EBV e CpG (ODN2006) estímulos são apresentados na Figura 2 A detecção dos clones em crescimento é fácil.; WI38 células alimentadoras de fibroblastos tem uma forma mais alongada, e os clones de células B se tornam células redondas como muito pequenas crescendo agrupados no meio da parte inferior da placa multi-poços rodada. Nesta fase, é evidente que alguns clones de começar a crescer. No entanto, a velocidade de crescimento pode ser variável e, claro, alguns dos poços containing células imortalizadas podem não ter quaisquer células que crescem em tudo.
O sobrenadante de clones em crescimento são testados num ensaio ELISA para a detecção de IgG, como mostrado na Tabela 2. Na presente uma curva padrão de ELISA para IgG é testada, juntamente com o sobrenadante dos clones e os espaços em branco. Um clone positivo é considerado quando o valor no teste ELISA é mais de três desvios padrão o valor do branco. Os valores dos clones negativos estão sob os três desvios-padrão do branco. Para confirmação, clones positivos devem ser positivos no ELISA, pelo menos, três vezes em diferentes sobrenadantes do mesmo clone e se possível verificada por meio de um método de rastreio adicional.
A sequência completa de um anticorpo IgG humano obtido aplicando os passos descritos neste manuscrito é mostrado na Figura 3. Esta sequência foi obtido após clonagem do par de imunoglobulina de cadeia pesada e de lambda a partir de uma célula B clonalmente expandidas. Uma variávelND regiões constantes da cadeia pesada e leve podem ser caracterizados com esta técnica. Após a obtenção das sequências, as sequências de anticorpos podem ser clonados e produzidos in vitro em culturas de células HEK.
Figura 1. Análise de fluxo citométrico de células + a partir de células mononucleares de sangue periférico humano CD22 + e IgG. (A) Selecção da população de células vivas é mostrado em P1. (B) para a frente gráfico de dispersão. (C) Tamanho de dispersão (D). O eixo Y mostra células separadas por anti-CD22-PerCP e no eixo X separados por IgG-PE. Praça P4 indica a fracção de células que tenha sido classificada (CD22 +, IgG +) e recuperado para a cultura. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Imagem representativa de células B imortalizadas em clones de 96 poços de placa após 5 semanas de cultura. (A) Neste bem imortalização não foi observada após 5 semanas, mas WI38 irradiado células de alimentação pode ser observado. (B) Um clone de crescimento lento foi observada neste poço, com agregados redondos minúsculos no meio. (C) crescimento rápido clone mostrando rodada agregados de células B imortalizadas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. sequências de anticorpos humanos de par cadeia pesada e leve a partir de um clone de células humanas imortalizadas B, F50,2, indicando V CDR1, CDR2 e CDR3. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| 1 st iniciadores de PCR | ||
| Adiante (5'-3 ') | Reverso (3'-5 ') | |
| IG G | 5 'G-VH 1 ACAGGTGCCCACTCCCAGGTGCAG | 3 'Cy CH1 GGAAGGTGTGCACGCCGCTGGTC |
| 5 'G-VH 3 AAGGTGTCCAGTGTGARGTGCAG | ||
| 5 'G-VH 4/6 CCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAG | ||
| 5 'G-VH 5 CAAGGAGTCTGTTCCGAGGTGCAG | ||
| κ | 5 'G VK 1/2 ATGAGGSTCCCYGCTCAGCTGCTGG | 3 'Ck 543 GTTTCTCGTAGTCTGCTTTGCTCA |
| 5 'G VK 3 CTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAG | 3 'Ck 494 GTGCTGTCCTTGCTGTCCTGCT | |
| 5 'G VK 4 ATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTG | ||
| 5 'Pan VK ATGACCCAGWCTCCABYCWCCCTG | ||
| λ | 5 'G Vλ 1 GGTCCTGGGCCCAGTCTGTGCTG | 3 'Cλ CACCAGTGTGGCCTTGTTGGCTTG |
| 5 'G Vλ 2 GGTCCTGGGCCCAGTCTGCCCTG | ||
| 5 'G Vλ 3 GCTCTGTGACCTCCTATGAGCTG | ||
| 5 'G Vλ 4/5 GGTCTCTCTCSCAGCYTGTGCTG | ||
| 5 'G Vλ 6 GTTCTTGGGCCAATTTTATGCTG | ||
| 5 'G Vλ 7 GGTCCAATTCYCAGGCTGTGGTG | ||
| 5'L Vλ 8 GAGTGGATTCTCAGACTGTGGTG | ||
| 2 nd iniciadores de PCR | ||
| Adiante (5'-3 ') | Reverso (3'-5 ') | |
| IG h | 5 'EcoRI VH1 CAACCGGAATTCGCAGGTGCAGCTGG TGCAG | 3 'NheI JH 1,2,4,5 CTGCTAGCTAGCTGAGGAGACGGT GACCAG |
| 5 'EcoRI VH1 a 5 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCTG GTGCAG | 3 'NheI JH 3 CTGCTAGCTAGCTGAGAGACGGTGA CCATTG | |
| 5 'EcoRI VH3 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCTG GTGGAG | 3 'NheI JH 6 CTGCTAGCTAGCTGAGGAGACGGTG ACCGTG | |
| 5 'EcoRI VH3 23 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCT GTTGGAG | ||
| 5 'EcoRI VH4 CAACCGGAATTCACAGGTGCAGCT GCAGGAG | ||
| 5 'EcoRI VH 34 4 CAACCGGAATTCACAGGTGCAGCTAC AGCAGTG | ||
| 5 'EcoRI VH 1 18 CTTCCGGAATTCACAGGTTCAGCT GGTGCAG | ||
| 5 'EcoRI VH 1 24 CTTCCGGAATTCACAGGTCCAGCT GGTACAG | ||
| 5 'EcoRI VH3 33 CTTCCGGAATTCACAGGTGCAGCT GGTGGAG | ||
| 5 '3 9 EcoRIVH GATCCGGAATTCAGAAGTGCAGCT GGTGGAG | ||
| 5 'EcoRI VH4 39 GATCCGGAATTCACAGCTGCAGCT GCAGGAG | ||
| 5 'EcoRI VH 6 1 GATCCGGAATTCACAGGTACAGCT GCAGCAG | ||
| κ | 5 'EcoRI VK 1 5 CAACCGGAATTCAGACATCCAGATGA CCCAGTC | 3 'BsiWI Jκ 1-4 GCCACCGTACGTTTGATYTCCACCTTGGTC |
| 5 'a sequência Vk EcoR1 1 9 CTTCCGGAATTCAGACATCCAGTTGAC CCAGTCT | 3 'BsiWI Jκ 2 GCCACCGTACG TTTGATCTCCAG CTTGGTC | |
| 5 'a sequência Vk EcoR1 1D 43 CTTGGCGAATTCAGCCATCCGGATGA CCCAGTC | 3 'BsiWI Jκ 3 GCCACCGTACGTTTGATATCCACT TTGGTC | |
| 5 'a sequência Vk EcoR1 2 24 CTTCCGGAATTCAGATATTGTGATGA CCCAGAC | ||
| 5 'a sequência Vk EcoR1 2 28 CTTCCGGAATTCAGATATTGTGATG ACTCAGTC | ||
| 5 'a sequência Vk EcoR1 2 30 CTTCCGGAATTCAGATGTTGTGATGA CTCAGTC | ||
| 5 'EcoR1 a sequência Vk 3 11 CTTCCGGAATTCAGAAATTGTGTTG ACACAGTC | ||
| 5 'EcoR1 a sequência Vk 3 15 CTTCCGGAATTCAGAAATAGTGATG ACGCAGTC | ||
| 5 'EcoR1 a sequência Vk 3 20 CTTCCGGAATTCAGAAATTGTGTTGA CGCAGTCT | ||
| 5 'a sequência Vk EcoR1 4 1 CTTCCGGAATTCAGACATCGTGATG ACCCAGTC | ||
| 5 'EcoR1 Vλ 1 CTTCCGGAATTCACAGTCTGTGCT GACKCAG | 3 'Avrll Jλ 1-3 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTSACCT TGGTCCC | |
| 5 'EcoR1 Vλ 2 CTTCCGGAATTCACAGTCTGCCC TGACTCAG | 3 'Avrll Jλ 4 CTGGTTACCTAGGAAAATGATCAGC TGGGTTCC | |
| 5 'EcoR1 Vλ 3 CTTCCGGAATTCATCCTATGAGC TGACWCAG | 3 'Avrll Jλ 5 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAGC TCGGTCCC | |
| 5 'EcoR1 Vλ 4-5 CTTCCGGAATTCACAGCYTGTG CTGACTCA | 3 'Avrll Jλ 6 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAGCT GGGTGCC | |
| 5 'EcoR1 Vλ 6 CTTCCGGAATTCAAATTTTATGC TGACTCAG | 3 'Avrll Jλ 7 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAC TTGGTCCAT | |
| 5 'EcoR1 Vλ 7-8 CTTCCGGAATTCACAGRCTGTG GTGACYCAG | ||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| UMA | 0,076 | 0,077 | 2.003 | 0,080 | 0,138 | 0,102 | 0,188 | 0,338 | 0,040 | 2.041 | 0,051 | 0,081 |
| B | 2,011 | 0,085 | 0,074 | 0,069 | 0,081 | 0,122 | 0,372 | 2.133 | 0,119 | 0,097 | 0,072 | 0,072 |
| C | 0,068 | 0,179 | 0,091 | 0,073 | 0,077 | 0,097 | 0,606 | 1.882 | 0,081 | 2.071 | 0,094 | 0,075 |
| D | 0,063 | 0,070 | 0,065 | 0,071 | 0,082 | 2.071 | 0,339 | 2.089 | 0,076 | 0,086 | 0,066 | 0,069 |
| E | 1.921 | 0,077 | 0,065 | 0,085 | 0,095 | 1.968 | 1.910 | 0,122 | 0,072 | 0,070 | 0,065 | 0,066 |
| F | 0,113 | 0,068 | 0,066 | 0,082 | 0,088 | 0,090 | 0.460 | 0,070 | 0,079 | 0,952 | 0,098 | 0,065 |
| G | 2.041 | 2.108 | 1.472 | 0,665 | 0,331 | 0,194 | 0,123 | 0,094 | EFT "> 0,0800,072 | 0,070 | 0,072 | |
| H | 2.146 | 2.132 | 1.634 | 0,665 | 0,341 | 0,178 | 0,132 | 0,094 | 0,082 | 0,080 | 0,074 | 0,068 |
| Padrões ng / ul | 1000 | 500 | 250 | 125 | 62,5 | 31.25 | 15,6 | 7.8 | 3.9 | 1.95 | 0,975 | 0 |
Tabela 2. Os resultados representativos de rastreio de IgG por ELISA. A Clone sobrenadantes são em A1-A10, B1-B10, C1-C10, D1-D10, E1-E10, F1-F10. Blanks estão em A11, B11, C11, D11, E11, F11, A12, B12, C12, D12, E12, curva F12.Standard é duplicado: G1-G12 e H1-H12. A concentração correspondente de imunoglobulinas em cada duplicado é mostrado below.Positive ou IgG clones produtores são mostradas a cinzento escuro. Clones produtores negativos ou não-IgG são mostrados a cinzento claro
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Discussion
Neste texto, todos os passos para a geração de anticorpos IgG a partir de PBMC humanas são apresentados em detalhe. Este protocolo inclui algumas vantagens em relação às técnicas anteriormente publicados. Uma das vantagens é que o anticorpo produzido mantém as cadeias pesada e leve correspondentes ao par original no clone de células B. A identificação de anticorpos IgG pode ser feito em qualquer tipo de dador humano, e não há necessidade de exacerbação da resposta imunitária devido à vacinação 5. A utilização da linha celular de fibroblastos WI38 como uma célula de alimentação, permite uma mais rápida detecção dos clones que crescem, uma vez que são morfologicamente muito diferentes e é fácil diferenciar, em comparação com as PBMC utilizadas como células de alimentação em obras anteriormente descrito 1,6- 8. Além disso, a utilização de uma célula WI38 como alimentador favorece o congelamento de grandes quantidades de aliquotas de células que podem ser facilmente cultivadas e descongeladas antes de cada experiência.
Um dos critpassos iCal no presente protocolo é o material de partida: o PBMC. Se o sangue foi esperar muito tempo para a centrifugação, ou após a extracção do PBMC, eles não são armazenados em condições de congelação apropriados; como tal, o número de células viáveis irá ser reduzida, juntamente com o número de células B de IgG a produção de clones obtidos. Por essa razão, uma extracção inicial e uma boa preservação da PBMC são recomendadas para um resultado positivo. O número de clones produtores de IgG será limitado ao número de PBMC no início da experiência. Números mais altos de PBMC se dar números mais elevados de IgG produzindo clones e uma produção de anticorpos diversos. Um outro passo crucial é a clonagem dos fragmentos de PCR com as cadeias leves e pesadas do anticorpo. Se a ligação não for bem sucedida depois de várias tentativas, recomenda-se um passo extra de clonagem do produto de PCR 2 nd num sistema TopoTA. A digestão da inserção com as enzimas apropriadas possam ser mais fácilno vector TopoTA, para uma ligação subsequente nos vectores de expressão pFUSEss.
Esta técnica pode ser transferido para qualquer tipo de tecido humano no qual as células B humanos são enriquecidos 3. Também pode ser aplicada ao estudo de outros tipos de imunoglobulinas, apenas mudando os anticorpos marcados utilizados para triagem (anticorpos contra IgM, IgE, IgA ou IgD), a concepção de iniciadores para a PCR, e os vectores que expressam. Os estudos destas imunoglobulinas podem ser de interesse para compreender, respostas imunes iniciais, a secreção de anticorpos mucosa e perfis de alergia, entre outros.
Em conclusão, nós descrevemos uma técnica para produzir anticorpos monoclonais humanos recombinantes IgG que deixa a cadeia pesada e leve pares de imunoglobulina humana intacta. A técnica é útil e fácil de realizar a partir de uma amostra de sangue. Os anticorpos monoclonais obtidos através deste método são potencialmente úteis em estudos sobre imune humanorespostas. Além disso, os anticorpos monoclonais produzidos com este método pode ser um bom ponto de partida para o desenvolvimento de imuno-terapêuticas para diferentes condições patológicas.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Contrato de investigação Miguel Servet (ISCIII CD14 / 00032) a (GN-G.). Fellowship da Organização Holandesa para Pesquisa "Graduate School of Translational Programa de Neurociência" Scientific (022005019) para (CH).
Concessões do Prinses Beatrix Fonds (Project WAR08-12) ea Association Française contre les Myopathies para (PM-M.); bem como por um Veni Fellowship da Organização Holandesa para Pesquisa Científica (916.10.148) uma bolsa da Fundação Cérebro dos Países Baixos (FS2008 (1) -28) eo Prinses Beatrix Fonds (Project WAR08-12) (a ML ).
Agradecemos Jozien Jaspers por sua ajuda na triagem de células B por citometria de fluxo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | solution containing polysucrose and sodium diatrizoate |
| FACSAria II cell sorter | BD Biosciences | ||
| 96 U-bottom micro well plates | Costar | 3799 | |
| Advanced Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco, Life Technologies | 12633-020 | |
| 30% v/v EBV-containing supernatant of the B95-8 cell line | ATCC | CRL-1612 | 3.4 x 108 copies/ml |
| CpG2006 | Invivogen | ODN 7909 | |
| Wi38 cells | Sigma-Aldrich | 90020107 | |
| Interleukin-2 | Roche | 10799068001 | |
| ELISA plates | Greiner Bio-One, Microlon | 655092 | |
| AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific (unconjugated) | Jackson ImmunoResearch | 109-006-008 | |
| 4% non-fat dry milk (Blotting Grade Blocker) | Biorad | 170-6404 | |
| Human IgG | Sigma | I 2511 | HUMAN IgG purified Immunoglobulin, 5.6 mg/ml |
| Goat F(ab)2 antihuman IgG Fcγ (conjugated with peroxidase (PO)) | Jackson ImmunoResearch | 109-036-008 | |
| ELISA reader (Perkin Elmer 2030) | Perkin Elmer | 2030-0050 | |
| Peroxidase-conjugated AffiniPure Rabbit Anti-Human IgM, Fc5µ | Jackson ImmunoResearch | 309-035-095 | |
| SuperScript III Cells Direct cDNA Synthesis System | Invitrogen | 18080-200 | |
| Applied Biosystems (ABI) GeneAm PCR System 2700 | Applied Biosystems | ||
| High Pure RNA Isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| Reverse transcription system kit | Promega | A3500 | |
| Recombinant Taq DNA Polymerase | TAKARA | R001A | |
| Primers (2 μl) | Sigma | ||
| Ultrapure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 100 bp ladder | Invitrogen | 15628-019 | |
| Quantity One 4.5.2 (Gel Doc 2000) | Biorad | 170-8100 | |
| QIAquick PCR purification kit | QIAGEN | 28106 | |
| BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit | Applied Biosystems | 4337455 | |
| 0.1 ml reaction plate (MicroAMP Optical 96-well) | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Genetic analyser ABI300 | Applied Biosystems | 4346906 | |
| DH5α competent cells (E. coli) | Invitrogen | 18263-012 | |
| pFUSEss-CHIg-hG1 (4,493 bp) | Invivogen | pfusess-hchg1 | |
| pFUSEss-CHIg-hG4 (4,484 bp) | Invivogen | pfusess-hchg4 | |
| pFUSE2ss-CLIg-hk (3,875 bp) | Invivogen | pfuse2ss-hclk | |
| pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3,883 bp) | Invivogen | pfuse2ss-hcll2 | |
| SOC medium | Invitrogen | 15544-034 | |
| LB-based agar medium supplemented with Zeocin (Fast-Media Zeo Agar) | Invivogen | fas-zn-s | |
| Terrific Broth (TB)-based liquid medium supplemented with Zeocin (Fast-Media Zeo TB) | Invivogen | fas-zn-l | |
| DNA Miniprep kit | Omega Bio Technology | D6942-02 | |
| Nanodrop (ND1000 Spectrophotometer) | Nanodrop | ||
| LB-based agar medium supplemented with Blasticidin (Fast-Media Blast Agar) | Invivogen | fas-bl-s | |
| Terrific Broth (TB)-based liquid medium supplemented with Blasticidin (Fast-Media Blast TB) | Invivogen | fas-bl-l | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | 20,000 U/ml, in 10x NEBuffer EcoRI |
| NheI | New England Biolabs | R0131S | 10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 2.1 |
| 2-Log DNA ladder | New England Biolabs | N3200S | 0.1-10.0 kb, 1,000 μg/ml |
| XmaI | New England Biolabs | R0180S | 10,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer |
| BsiWI | New England Biolabs | R0553S | 10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 3.1 |
| AvrII | New England Biolabs | R0174S | 5,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase | Thermo Scientific | EF0651 | 1 U/µl, in 10x FastAP Buffer |
| DH5α competent cells | Invitrogen | 18263-012 | |
| PE Mouse Anti-Human IgG | BD Pharmingen | 555787 | |
| anti-CD22, PerCP-Cy5.5, Clone: HIB22 | Fisher scientific | BDB563942 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | |
| BigDye Terminator v3.1 | Applied Biosystems | 4337455 |
References
- Vrolix, K., et al. Clonal heterogeneity of thymic B cells from early-onset myasthenia gravis patients with antibodies against the acetylcholine receptor. J Autoimmun. 52, 101-112 (2014).
- Yamashita, M., Katakura, Y., Shirahata, S. Recent advances in the generation of human monoclonal antibody. Cytotechnology. 55 (2-3), 55-60 (2007).
- Pereira, K. M., Dellavance, A., Andrade, L. E. The challenge of identification of autoantibodies specific to systemic autoimmune rheumatic diseases in high throughput operation: Proposal of reliable and feasible strategies. Clin Chim Acta. 437, 403-410 (2014).
- Losen, M., et al. Treatment of myasthenia gravis by preventing acetylcholine receptor modulation. Ann N Y Acad Sci. 1132, 174-179 (2008).
- Smith, K., et al. Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen. Nat Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).
- Fraussen, J., et al. A novel method for making human monoclonal antibodies. J Autoimmun. 35 (2), 130-134 (2010).
- Traggiai, E., et al. An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat Med. 10 (8), 871-875 (2004).
- Fraussen, J., et al. Autoantigen induced clonal expansion in immortalized B cells from the peripheral blood of multiple sclerosis patients. J Neuroimmunol. 261 (1-2), 98-107 (2013).
- Yamashita, M., et al. Different individual immune responses elicited by in vitro immunization. Cytotechnology. 40 (1-3), 161-165 (2002).
- Hui-Yuen, J., Koganti, S., Bhaduri-McIntosh, S. Human B cell immortalization for monoclonal antibody production. Methods Mol Biol. 1131, 183-189 (2014).
- Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
- Lanzavecchia, A., Corti, D., Sallusto, F. Human monoclonal antibodies by immortalization of memory B cells. Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 523-528 (2007).
- Traggiai, E. Immortalization of human B cells: analysis of B cell repertoire and production of human monoclonal antibodies. Methods Mol Biol. 901, 161-170 (2012).
- Strober, W., et al. Monitoring cell growth. Curr Protoc Immunol / edited by. John E. Coligan ... [et al.]. Appendix 3, Appendix 3A (2001).
- Ibrahim, S. F., van den Engh, G. Flow cytometry and cell sorting. Adv Biochem Eng Biotechnol. 106, 19-39 (2007).
- Leith, J. T., Padfield, G., Faulkner, L. E., Quinn, P., Michelson, S. Effects of feeder cells on the X-ray sensitivity of human colon cancer cells. Radiother Oncol. 21 (1), 53-59 (1991).
- Hui-Yuen, J., McAllister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-McIntosh, S. Establishment of Epstein-Barr virus growth-transformed lymphoblastoid cell lines. J Vis Exp. (57), 3321 (2011).
- Smith, L. M., et al. Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis. Nature. 321 (6071), 674-679 (1986).
