Introduction
Målet med denne artikkelen er å beskrive i detalj en metode for å generere og karakter humane IgG monoklonale antistoffer hentet fra humane perifere mononukleære blodceller (PBMC).
Interessen for å studere humane antistoffer har vokst i mange ulike forskningsfelt. Spesielt mange forskningsgrupper er interessert i patologi forårsaket av auto-antistoffer 1-3. Vi har klonet og karakterisert patogene autoantistoffer 1. Studiet av auto-antistoffer kan bidra til å identifisere sine mål og utvikle terapeutiske strategier, for eksempel ved å bruke konkurren antistoffer 4. Videre kan studiet av humane antistoffer også være av interesse i andre dvs. innen forskning, for å vurdere immunresponsen etter vaksinering 5, for å karakterisere antistoffprofil av individer som ble eksponert og ble motstandsdyktig mot visse patogener 6, eller for å studere hvilke antistoffer er idet naturlige repertoaret 7,12.
Flere teknikker er blitt utviklet for å generere rekombinante humane monoklonale antistoffer 8-12; De fleste av disse bruke fag-display og B-celle immortalisering. Bruken av fagdisplay har blitt mye brukt for oppdagelsen av nye antistoffer 13. Men den har en stor ulempe, nemlig at de tunge og lette kjede parene av det humane immunoglobulin blir dissosiert i prosessen. Fremstilling av hybridomer med humane B-celler eller EBV-transformasjon overvinner denne ulempe.
Vi bruker infeksjon av tymiske B-celler med EBV i kombinasjon med polyklonale B-celle stimulering via Toll-like receptor 9 (TLR-9) 6,12.
I denne artikkelen beskriver vi i detalj den teknologien som vi bruker for utvikling av IgG humane antistoffer, med en komplett oversikt over alle trinnene fra PBMC isolasjon til in vitro antistoff generasjon. DetteProtokollen kan brukes for analyse av hvilken som helst type av humant IgG-profil. I vårt laboratorium, er B-celler som produserer IgG-antistoffer blitt separert fra resten av PBMC etter sortering. Femti sortert B-celler 8 kan deretter bli sådd ut i multi-brønnplater og udødeliggjort ved EBV og TLR-9-aktivering, for klonal ekspansjon av enkelt B-celler. Som mateceller, har fibroblaster fra human embryonisk lungevev blitt brukt, cellelinje WI38, som muliggjør visualisering av de udødeliggjorte B-celler. Fra disse B-celler, kan sekvensene av de tunge og lette kjeder av immunoglobulin oppnås ved PCR, og de antistoffer gener klonet i immunoglobulin G ekspresjonsvektorer og produsert in vitro. Ved hjelp av denne teknikken kan enkle antistoffer med nøyaktig det samme antistoff-sekvensen befinner seg i samme donor studeres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Informert samtykke ble innhentet fra deltakerne i studien. Studien ble godkjent av den institusjonelle etikkomité.
1. Isolering av perifere mononukleære blodceller (PBMC)
- Sentrifuger 25 ml deltakernes heparinisert blod ved 900 x g i 15 min, så snart som mulig etter at blodet ekstraksjon. Dersom det er mindre blod, skalere ned reagensene tilsvarende. Utføre alle de neste trinnene i en hette.
- Overfør serumet til et rent rør. Den kan brukes i senere trinn for frysing PBMC og i tilfelle av autoimmune pasienter, for å teste auto-antistoffer.
- Fortynn blod med 10 ml RPMI 1640 medium og resuspender cellene ved å pipettere opp og ned.
- Tilsett 15 ml av en oppløsning inneholdende polysucrose og natrium- diatrizoat (1,077 g / ml) til et nytt 50 ml tube.
- Forsiktig lag blodet på toppen av oppløsningen i trinn 1.4 ved å bringe de to åpningene til rørene nær togethenne til de to væskene kommer meget langsomt i kontakt med, og deretter dekantere PBMC-suspensjonen langsomt på toppen av 50 ml tube. Dette trinnet er kritisk å ha en god separasjon av PBMC.
- Sentrifuger røret oppnådd i trinn 1.5 ved 400 x g uten brems ved RT i 20 min.
- Etter sentrifugering, gjenoppretter med pipette den hvite ringen som vises i den midtre del av røret, som inneholder PBMC.
- Vask cellene med 25 ml RPMI 1640 medium.
- Sentrifuger 300 xg ved romtemperatur i 10 min.
- Kast supernatanten og vask av cellene med 10 ml RPMI 1640. Sentrifuge igjen som i trinn 1.9.
- Telle PBMC med Neubauer kammer som tidligere rapportert 14.
- Behandler PBMC som i avsnitt 2 eller lagre dem for senere bruk som følger: 10 millioner PBMC for frysing per kryoampulle rør fortynnet i 1 ml av 10% dimetylsulfoksyd (DMSO) og 90% serum oppnådd i trinn 1.2. Fryse progressivt og for lenge storaseri i flytende nitrogen.
2. Farging PBMC for sortering CD22 + og IgG + av Cell Cytometry
- Plate PBMC i en 25 cm2 cellekulturkolbe med 6 ml komplett RPMI 1640-medium (supplert med L-glutamin, 10 mM HEPES-buffer, 50 U / ml penicillin, 50 ug / ml streptomycin og 10% føtalt bovint serum) og la dem komme O / N i inkubator ved 37 ° C i 5% CO 2.
- Blokker sterile FACS rør med sterilt 4% albumin fosfatbufret saltvann (PBS) oppløsning O / N. Vask rørene to ganger med PBS og fylle dem med 500 ul av fullstendig RPMI 1640 medium. Bruk disse rørene for å utvinne cellene etter sortering.
- Samle PBMC i et rør, og sentrifuger ved 400 xg ved RT i 5 min.
- Suspender cellene i merking buffer (se trinn 2.5 og 2.6) og telle dem 14. Merkingen bufferen er steril 2% føtalt bovint serum og 1 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) i PBS.
- Forbered 3 fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) rør med 10 5 celler hver, og resuspender dem i 100 pl buffer merking. Disse rør vil tjene til å definere portene til sortering.
- I det første rør tilsett 5 ul av anti CD22 antistoff PerCP (anbefalt i produsentens dataark), i det andre røret 20 ul av anti-IgG-PE (anbefalt i produsentens dataark), og ikke noe i det tredje røret. Inkuber på is og i mørke i løpet av 30 min.
- Resuspender 5 millioner celler i 200 ul merking buffer i en FACS tube og legge til 10 mL av anti CD22 PerCP og 40 ul anti IgG PE. Cellene inkuberes på is og mørke i løpet av 30 min. Ved sorteringen av et høyere antall celler er ønsket, skalere opp alle reagenser.
- Sentrifuger cellene ved 400 xg med en lav bremse i 5 min ved RT.
- Dekanter mykt supernatanten.
- Cellene resuspenderes i 500 μl merking buffer. Sentrifuger cellene ved 400 xg med en lav bremse i 5 min ved RT. Gjenta trinn 2.7 og 2.8
- Dekanter mykt supernatanten og resuspender cellene i 300 ul av RPMI komplett medium.
- Passere cellene gjennom et 0,45 mikrometer filter. Cellene er klar til å sortere.
3. Sortering av B-cellene CD22 + og IgG +
- Bruk tre kontrollrørene for å etablere levedyktigheten av cellene. I kontrollgruppen uten flekker, bruker frem og størrelse spredningsdiagram for å definere lymfocytt gating. Kontrollene med CD22 PerCP og anti-IgG PE tjene til å etablere portene og sortering gate. Utfør følgende tidligere rapporterte data 15.
Merk: En gate er et sett av verdigrensene (grenser) som tjener til å isolere en bestemt gruppe cytometriske hendelser, i vårt tilfelle celler fra et stort sett. I tilfelle av en sorterings port verdigrensene tillater utvinning av cytometriske hendelser, celler, som er innvendiggrensene som er definert: CD22 + og IgG +. - Som en samling rør i sortering, bruker de blokkerte rør med 500 mL av komplett RPMI 1640 medium, hentet fra trinn 2.2.
- Fortsett å sortere dobbel positiv 15: CD22 + IgG +. Legg merke til det endelige antall celler i hver tilstand. Plate-celler sortert på toppen av feeder-celler så snart som mulig.
4. Bestråling av Feeder Cells
Merk: Utfør utarbeidelsen av mater celler mellom 1 - 3 dager før sortering. Minst 5000 WI38-celler er nødvendig per brønn i en 96-brønners plate runde. Utfør trinn 4.1, 4.2 og 4.4 i en hette.
- Dyrke WI38-celler ved 37 ° C og 5% CO2 i fullstendig RPMI 1640 medium (samme som for PBMC) inntil det ønskede antall celler er oppnådd.
- Bestråle dem 50 Grays, etter en protokoll beskrevet før 16. Utføre bestråling når de WI38-celler er blitt trypsinisert og resuspendert i complete RPMI medium, eller med WI38 festet til kulturflaske og trypsinert etter bestrålingen. Følg fremgangsmåten for trypsinering angitt av leverandøren av WI38-celler. Bestråle antall celler som er nødvendige for å dekke de brønner som er nødvendig for plette IgG + B-celler (1% av den totale PBMC telles i trinn 1.11).
- Plate 90 ul inneholdende 5000 bestrålt WI38-celler i hver brønn i 96-brønners plate runde. La brønnene i den ytre raden til den tomme platen (fordi de fordamper hurtigere), og bare bruke de 60 brønnene i midten av platen for plating celler. Fyll de ytre brønner som rammer inn plate med 200 mL PBS.
- Plassere dem i en inkubator ved 37 ° C ved 5% CO2, inntil nødvendig.
5. Plating Ordnet PBMC, EBV infeksjon og voksende
- Vanne ut sorterte PBMC, til platen 50 celler i 50 ul RPMI 1640 komplett medium per brønn i 96 runde vel plate (tidligere belagt viddh WI38 bestrålte celler). Utfør trinn i en hette utstyrt for EBV arbeid.
Merk: infeksjon av 50 celler per brønn er optimalisert og øker likehood å produsere et monoklonalt antistoff 8, er det imidlertid anbefalt å bekrefte dette ved PCR som beskrevet før 1,6. - Legg 60 mL av EBV supernatant (inneholdende 3-4 x 10 8 virale kopier / ml) til hver brønn i 96-brønners platen 17 runde. FORSIKTIG bør tas i løpet av EBV arbeid.
- Tilsett 1 ug / ml av CpG (ODN2006) per brønn.
- La cellene i en inkubator ved 37 ° C ved 5% CO2.
- Visuelt overvåke klon vokse under mikroskopet etter en uke.
Merk: Noen eksempler på B cellevekst kan sees nedenfor i resultatene delen. Legg merke til at vekstratene klonene kan variere, og ekstra tid kan være nødvendig å begynne å se noen cellemassen vokser i midten av brønnen. - Etter en st to ukerss monitor klone vokser under lysmikroskop og gå videre til den første media utveksling. Sakte pipettér 90 mL av mediet fra den øvre del av brønnen og samles i en ren 96-brønners plate. (B-celler ligger i bunnen av brønnen, slik at det ikke er noen risiko for å suge dem).
- Legg til hver brønn 100 pl av komplett RPMI 1640 media supplert med 1 ug / ml av CpG (ODN2006) og 50 U / ml IL2. Hvis kloner vokser, analysere denne første media utveksling av ELISA som i trinn 6.
- Overvåk klon vokser og endre medier etter det 3. og 4. uke vokser igjen ved å ta 90 ul media og tilsetning av 100 ul av fullstendig RPMI 1640 medium supplert med 1 ug / ml av CpG (ODN2006) og 50 U / ml IL2. Bruk samles supernatanten for å overvåke IgG-produksjon ved hjelp av ELISA som i trinn 6.
Merk: Etter en måned klone vokser bør være tydelig ved å observere aggregater av runde celler that vanligvis ligge i midten av rund bunn brønnen. - På dette trinnet endrer medier på samme måte som de foregående uker, men bare med fullstendig RPMI 1640 medium. En god indikator å vite riktig tidspunkt for å endre media er media farge, hvis det blir gulaktige cellene trenger en medie utveksling.
- Når 96-brønns plater som inneholder store kloner (ca. 5 x 10 5 celler), overføre dem til en flat brønn i en 24-brønns plate. Tilsett 300 ul av fullstendig RPMI 1640 medium til den nye brønnen. Suspendere 96-brønns voksende klone, ved å pipettere opp og ned flere ganger, og overføre celler til den nye brønnen, distribuere homogent. Legge til nye medier ved behov.
- Når brønnene i 24-brønns plate er fulle av celler (ca. 5 x 10 6 celler), overføring til en flat brønn i en 6-brønns plate. Tilsett 2 ml av komplette RPMI 1640 media til den nye brønnen. Suspender cellene i 24-brønns plate ved å pipettere opp og ned flere ganger, og distribuere dem homogetidig i den nye brønnen.
- Legg til media når det trengs. Dersom cellene ikke er å bli opprettholdt i kultur, pellet cellene ved 400 xg i 5 minutter ved romtemperatur. Oppbevar Supernatantene for ELISA testing. Vask pelleten av celler en gang med 1 x PBS, sentrifuger på nytt ved 400 xg i 5 minutter, og lagret tørt ved -80 ° C inntil RNA-ekstraksjon.
- Når cellene i 6-brønns plate blir sammenflytende (ca. 20 x 10 6 celler), overføring til en 60 mm kulturplate. Tilsett 4 ml komplett RPMI 1640 media til den nye platen. Suspender cellene i seks-brønns plate og overføre dem som gjøres er trinn 5.9 og 5.10.
- Legge til nye medier ved behov. På dette trinnet, fryse-celler ved 10-30 millioner / ml i 90% føtalt kalveserum og 10% DMSO. Hvis større mengder av celler er ønsket, fortsetter ekspansjonen av klonene i større overflateplatene.
6. ELISA for IgG antistoff Detection
- Dispenser 50 ul / brønn i en ELISA-plate of geit F (ab) 2 anti-humant Fc-antistoff fortynnet 1 200 i beleggbuffer. Coating buffer inneholder 50 mM Na 2 CO 3 pH 9,6.
- Forsegl platene med en plast klistremerke, og inkuberes en time ved 37 ° C. Alternativt inkuberes ved 4 ° CO / N.
- Vask hver brønn seks ganger med 200 ul vaskebuffer. Vaskebuffer som inneholder 0,05% Tween-20 i 1 x PBS. Ikke berør eller riper i godt overflaten der antistoff har bundet.
- Blokker med blokkerende buffer, 100 ul / brønn. Blokkeringsbuffer inneholder 4% av ikke-fettholdig tørrmelk i PBS. Forsegl platen og inkuber 1 time ved 37 ° C.
- Ikke vask. Kast blokkering buffer og sleng de plate 3 ganger opp ned på et papir håndkle for å fjerne rester av væske.
- Inkuber kloner 'Supernatantene og standarder.
- For en første test, fortynne klone Supernatantene oppnådd i trinn 5.6 eller 5.7 1/3 i RPMI. For standardene fortynne med RPMI medium human IgG løsning for å få: 1,000 ng /ml, 500 ng / ml, 250 ng / ml, 125 ng / ml 62,5 ng / ml, 31,25 ng / ml, 15,6 ng / ml og blank. Bruke 50 ul / brønn og inkuberes ved 37 ° C i 60 min. Analyser ytterligere fortynninger av klonen "supernatanten for å teste affiniteten av antistoffet, slik som 1/10 og 1/100.
- Vask som gjøres i trinn 6.3.
- Bruke 50 ul / brønn geite-F (ab) 2 anti-humant IgG Fc-peroksidasekonjugert fortynnet 1: 20000 i inkubasjonsbuffer. Inkubasjonsbufferen inneholder 1% BSA og 0,02% Tween 20 i 1 x PBS. Inkuber ved 37 ° C i 60 min.
- Vask som gjøres i trinn 6.3.
- Tilsett 100 ul / brønn substratoppløsning inneholdende 0,1% 3,3 ', 5,5'-tetrametylbenzidin (TMB). Inkuber 10 min inntil en stabil blå farge former i brønnene. Vær forsiktig; ikke vent for lenge!
- Stopp reaksjonen ved å tilsette 50 pl av 2 MH 2 SO 4. Mål absorpsjonen ved 450 nm i løpet av 30 minutter etter at reaksjonen er stoppet.
Merk: Alle klonene 'supernatants med tre standardavvik over blank vil bli vurdert positivt for IgG humane antistoffer. For bekreftelse av de positive kloner denne ELISA bør gjentas minst tre ganger i forskjellige supernatanter av samme klon. Også for å forkaste muligheten for uspesifikk kryssreaktivitet anbefales å sikre at der ikke er noe signal når supernatanter inkuberes i ubelagt, men blokkeres brønnene. På dette trinnet til en deteksjons analysen screene for antigen spesifisitet av antistoffer av interesse kan utføres før å gå videre til kapittel 7.
7. RNA Isolation og First Strand cDNA syntese av de produserende IgG Clones
- Så snart produksjonen av IgG er bekreftet ved hjelp av ELISA, ekstrahere RNA fra klonen.
- For å trekke ut RNA fra celler som vokser i trinn 5,7 eller 5,9, bruker hevet III celler direkte cDNA syntese kit, som gjør det mulig å innhente DNA fra 10 000 celler til en celle.
- For å trekke ut RNA fra LARger mengder av celler, eller fra pelleten lagret i trinn 5.11 bruke høye ren RNA isolering kit. Andre systemer av RNA ekstraksjon kan også være egnet for dette trinnet. Følg instruksjonene fra produsenten.
- For celle tall mellom 1 x 10 6 og 1 x 10 4 bruk revers transkripsjon system, etter instruksjon av produsenten. Andre systemer for første tråd cDNA-syntese kan også benyttes.
8. 1 og 2. PCR for amplifisering av de tunge og lette kjeder av IgG-produserende B-celle kloner
- Med cDNA av cellekloner, oppnådd i trinn 5.6 og 5.7, og positive i den IgG ELISA i trinn 6, utføre PCR med primere som er oppført i tabell 1.
- Sett opp uavhengige PCRs for hver IgG tung, kappa og lambda-kjeden. Lag en stamløsning med forover og bakover primere i like konsentrasjoner. Legg dem til reaksjonen ved 0,4 mikrometer endelig konsentrasjon. </ Li>
- Bruk en ul av cDNA syntesen å utføre en ST PCR. Her utføre 20 mL reaksjoner ved bruk av Takara Taq produsentens instruksjoner. Alternativt kan du bruke andre polymeraser.
- Plasser en st PCR under følgende sykleforhold: 94 ° C i 5 min; (50 sykluser med: 94 ° C i 30 sekunder; 58 ° C i 30 sek, og 72 ° C i 45 sekunder; 72 ° C i 7 minutter, la den avkjøles ved 4 ° C.Include en blank i reaksjonen for å avdekke mulige forurensninger.
- Forbered 1x TBE (89 mM Tris-borat og 2 mM EDTA). I et volum på 100 ml med 1X TBE tilsett 1 g agarose (1% agarosegel). Varm løsningen i mikrobølgeovn i omtrent 1 min, inntil agarose blir oppløst. Deretter legger 4 ul 10 mg / ml etidiumbromid (eller tilsvarende DNA-fargestoff) og bland.
- Hell innholdet i en skuff og vente til blir polymerisert. Kjør 5 ul av PCR-blandingen i gelen for å visualisere båndene. Tung kjede fragments bør være rundt 400-550 bp, mens lette kjeden bør være rundt 300-400 bp. Hvis bandene ikke blir oppdaget, fortsetter på samme måte til 2 nd PCR.
- Bruk 1 mL av det første PCR-blanding for å utføre 2. PCR. Bruk av de samme reagenser som i trinn 8.2, men ved å bruke passende blanding av primere (se tabell 1). For de to nd PCR bruke følgende betingelser: 94 ° C i 5 min; (50 sykluser med: 94 ° C i 30 sekunder; 56,5 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 55 sek); 72 ° C i 7 minutter; la det kjøle seg ned ved 4 ° C. Ta med en blank i reaksjonen, for å avdekke mulige PCR forurensninger.
- Forbered en agarosegel som beskrevet i 8.5. Kjør gelen for å visualisere PCR-produkt som i 8.5.1 Bruk amplifikasjonene som inneholder riktig størrelse fragmenter for kloning i trinn 9, og produsere antistoffer i trinn 10.
- DNA-sekvensen, ved anvendelse av 10 pl reaksjonsinneholdende: 100 ng av 2. PCR, 0.2 uM av primeren eller tennblandingen, 1 ul av terminatoren og 1 mL av bufferen. Utfør sekvenseringsreaksjon under disse betingelser: (25 sykluser med: 96 ° C i 10 sekunder; 50 ° C i 5 sekunder, og til 60 ° C i 4 minutter); 60 ° C i 7 minutter; la det kjøle seg ned ved 4 ° C.
- Rense sekvenseringsreaksjoner med microspin G50 kolonner følgende produsentens instruksjoner. Evaluer sekvenser av ligerings i en automatisk sekvens analysator 18 som beskrevet tidligere. Electropherograms bør være rent og tilsvarer en enkelt immunoglobulin-sekvens.
Merk: Hvis PCR produktene viser uklare eller blandede immunglobulinsekvenser, kan du vurdere å klone dem med TopoTA systemet, for å oppnå isolerte sekvenser, og deretter gå videre til trinn 9.
9. Kloning og sekvensering av de tunge og lette kjeder av de produserende kloner IgG
- Forbered 1 mikrogram av DNA vektorer pFUSE2ss-CLIg-hk, pFUSE2ss-CLIg-HL2 og pFUSEss-CHIg-HG1.
- Fordøye disse vektorene med de passende restriksjonsenzymer. Bruk Eco RI og Bsi WI for pFUSE2ss-CLIg-hk, Eco RI og Avr II for pFUSE2ss-CLIg-HL2, og Eco RI og Nhel for pFUSEss-CHIg-HG1. Bruk 3 enheter av restriksjonsenzym for hver 1 pg av vektor-DNA.
- Fordøye med en enzym og rense produktet spaltet med en PCR Purification Kit. Fordøye med det andre enzymet og rens med en Gel Extraction Kit (i henhold til produsentens protokoll). Skjær fragment av interesse fra agarosegel. Forbered agarosegel som i trinn 8.5.
- Fordøye 2. PCR-produktene fra den produserende klon IgG: Eco RI og Bsi WI til kappakjeden amplifikasjon, Eco RI og Avr II for lambda-kjeden forsterkning, og EcoRI og Nhel for tung kjede forsterkning. Fordøye med en enzym og rense produktet spaltet med en PCR Rensing Kit. Fordøye med det andre enzymet, og rense produktet spaltet med en PCR Purification Kit. Bruk samme enheter av enzymer og DNA mengde som i trinn 9.2.
- Ligere PCR fragmenter innsiden av vektorer med T4 DNA ligase 16 ° CO / N følgende produsentens anbefalinger. Forholdet som brukes bør være 1: 2 (vector: innsats).
- Bruke en ul av ligerings å transformere DH5a bakterier. Følg DH5a produsentens vilkår for transformasjon. Spre bakterier i blasticidin eller zeocin plater, avhengig av hvilken type av vektor anvendes. Inkuber platene O / N ved 37 ° C.
- Grow enkeltkolonier, og trekke ut DNA med en miniprep kit, etter produsentens instruksjoner. Bruk for enkelt koloni vokse og DNA-ekstraksjon produsentens, anbefalinger fra DNA miniprep kit. Analysere dem ved fordøyelse med enzymene som brukes for fremstilling av vektorer og innsatser som i trinn 9.2 og 9.3.
- Sekvens av DNA, ved using 100 ng av vektoren som gjøres i trinn 8,8 og 8,9.
10. produksjonen av antistoffer i HEK-celler
- Grow HEK-celler i Dulbeccos modifiserte Eagle Medium (DMEM) supplert med 10% føtalt kalveserum, 1% L-glukose, 1% penicillin / streptavidin (DMEM +) til en sammenflytning på 75% i en 150 mm cellekulturplate. Opptre i en hette trinn 10.01 til 10.07.
- Før transfeksjon, utveksler mediet til mediet som før, men uten kalvefosterserum.
- For hver tung, lett kjede transfeksjon, forberede en transfeksjon blanding med 2,5 ml DMEM (uten serum), 9 ug av vektoren med den tunge kjede, 6 ug av vektoren med den lette kjede, og 100 ul av polyetylenimin (PEI ) oppløsning (fra en 1 pg / pl lager). Inkuber ved RT i 15 min.
- Tilsett 2,5 ml av transfeksjon blandingen fremstilt i trinn 10.3 til HEK-cellene i platen. Rocke plate å distribuere homogent.
- Icubate cellene i inkubator ved 37 ° C med 5% CO2 i 24 timer.
- Endre kulturmedium til medium uten føtalt kalveserum.
- Samle mediet fra platene 4 dager senere.
Merk: Antistoffene i media kan brukes til å karakterisere deres reaktivitet in vitro og in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sorteringen gating etter farging av CD22 og IgG-positive celler er vist i figur 1. I dette bildet området for de doble positive celler -. B-celler som produserer IgG antistoff - er valgt for å sortere alle disse cellene i et separat rør. I analysen omtrent 1% av de totale PBMC samsvarer med denne doble positive populasjonen. Antallet sorterte cellene som oppnås vil avhenge av antallet av celler oppnådd i avsnitt 1.
De forskjellige resultater etter 5 uker med EBV immortalisering og CpG (ODN2006) stimuli er vist i figur 2 Påvisning av de voksende kloner er lett.; WI38 feeder-celler ha en mer langstrakt form fibroblast, og B-cellekloner fremstå som svært små, runde celler som vokser i klynger i midten av rund multi-brønn plate. På dette stadiet, er det åpenbart at noen kloner begynner å vokse. Imidlertid kan den økende hastigheten være variabel og selvfølgelig noen av brønnene inneholdning immortaliserte celler kan ikke ha noen celler som vokser i det hele tatt.
Supernatanten av de voksende kloner testet i en ELISA for å detektere IgG som vist i tabell 2. I denne ELISA en standardkurve for IgG testes, sammen med supernatanten av klonene og emnene. Et positivt klon blir vurdert når verdien i ELISA er tre standardavvik enn blindverdien. Negative kloner 'verdier er under 3 standardavvik av emnet. For bekreftelse, bør positive kloner være positive i ELISA minst tre ganger i forskjellige supernatanter av samme klon og om mulig bekreftet ved en ytterligere screening-metoden.
Den fullstendige sekvens av et humant IgG-antistoff fremskaffet anvendelse av fremgangsmåten som er beskrevet i dette manuskriptet er vist i figur 3. Denne sekvensen er blitt oppnådd etter kloning av immunoglobulin tung og lambda-kjede fra et par klonalt ekspandert B-celle. Variable ennd konstante områder i den tunge og lette kjede kan karakteriseres med denne teknikken. Etter å ha fått sekvensene kan antistoffer sekvenser klones og produsert in vitro i HEK cellekulturer.
Figur 1. Strømningscytometrisk analyse av CD22 + og IgG + celler fra humane perifere mononukleære blodceller. (A) Valg av befolkningen i levende celler er vist i P1. (B) Forward spredningsdiagram. (C) Størrelse spredningsdiagram. (D) Y-aksen viser cellene adskilt ved hjelp av anti-CD22-PerCP og på x-aksen adskilt av IgG-PE. P4 torget indikerer cellefraksjon som er blitt sortert (CD22 +, IgG +) og gjenvunnet for kultur. Klikk her for å se en større versjon av denne figure.
Figur 2. Representative bilde av B-celle-kloner udødeliggjort i en 96-brønners-platen etter 5 uker med kultur. (A) I denne brønn immortalisering ble observert etter 5 uker, men WI38 bestrålte feeder-celler kan observeres. (B) En langsomt voksende klon ble observert i denne brønnen, med små runde størrelser i midten. (C) Fast voksende klon viser runde aggregater av udødeliggjort B-celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. humant antistoff sekvenser av tung og lett kjede par fra en human udødeliggjort B-celle-klon, F50,2, som indikerer V CDR1, CDR2 og CDR3 sekvenser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| 1 st PCR primere | ||
| Forover (5'-3 ') | Omvendt (3'-5 ') | |
| IgG | 5 'L-VH 1 ACAGGTGCCCACTCCCAGGTGCAG | 3 'Cγ CH1 GGAAGGTGTGCACGCCGCTGGTC |
| 5 'L-VH 3 AAGGTGTCCAGTGTGARGTGCAG | ||
| 5 'L-VH 4/6 CCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAG | ||
| 5 'L-VH 5 CAAGGAGTCTGTTCCGAGGTGCAG | ||
| κ | 5 'L Vκ 1/2 ATGAGGSTCCCYGCTCAGCTGCTGG | 3 'CK 543 GTTTCTCGTAGTCTGCTTTGCTCA |
| 5 'L Vκ 3 CTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAG | 3 'CK 494 GTGCTGTCCTTGCTGTCCTGCT | |
| 5 'L Vκ 4 ATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTG | ||
| 5 'Pan Vκ ATGACCCAGWCTCCABYCWCCCTG | ||
| λ | 5 'L Vλ en GGTCCTGGGCCCAGTCTGTGCTG | 3 'Cn CACCAGTGTGGCCTTGTTGGCTTG |
| 5 'L Vλ to GGTCCTGGGCCCAGTCTGCCCTG | ||
| 5 'L Vλ 3 GCTCTGTGACCTCCTATGAGCTG | ||
| 5 'L Vλ 4/5 GGTCTCTCTCSCAGCYTGTGCTG | ||
| 5 'L Vλ 6 GTTCTTGGGCCAATTTTATGCTG | ||
| 5 'L Vλ 7 GGTCCAATTCYCAGGCTGTGGTG | ||
| 5'L Vλ 8 GAGTGGATTCTCAGACTGTGGTG | ||
| 2 nd PCR primere | ||
| Forover (5'-3 ') | Omvendt (3'-5 ') | |
| AvIgH | 5 'EcoRI VH1 CAACCGGAATTCGCAGGTGCAGCTGG TGCAG | 3 'NheI JH 1,2,4,5 CTGCTAGCTAGCTGAGGAGACGGT GACCAG |
| 5 'EcoRI VH1 til 5 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCTG GTGCAG | 3 'NheI JH 3 CTGCTAGCTAGCTGAGAGACGGTGA CCATTG | |
| 5 'EcoRI VH3 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCTG GTGGAG | 3 'NheI JH 6 CTGCTAGCTAGCTGAGGAGACGGTG ACCGTG | |
| 5 'EcoRI VH3 23 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCT GTTGGAG | ||
| 5 'EcoRI VH4 CAACCGGAATTCACAGGTGCAGCT GCAGGAG | ||
| 5 'EcoRI VH 4 34 CAACCGGAATTCACAGGTGCAGCTAC AGCAGTG | ||
| 5 'EcoRI VH en 18 CTTCCGGAATTCACAGGTTCAGCT GGTGCAG | ||
| 5 'EcoRI VH en 24 CTTCCGGAATTCACAGGTCCAGCT GGTACAG | ||
| 5 'EcoRI VH3 33 CTTCCGGAATTCACAGGTGCAGCT GGTGGAG | ||
| 5 'EcoRIVH 3 9 GATCCGGAATTCAGAAGTGCAGCT GGTGGAG | ||
| 5 'EcoRI VH4 39 GATCCGGAATTCACAGCTGCAGCT GCAGGAG | ||
| 5 'EcoRI VH 6 1 GATCCGGAATTCACAGGTACAGCT GCAGCAG | ||
| κ | 5 'EcoRI Vκ en 5 CAACCGGAATTCAGACATCCAGATGA CCCAGTC | 3 'BsiWI Jκ 1 til 4 GCCACCGTACGTTTGATYTCCACCTTGGTC |
| 5 'EcoR1 Vκ en 9 CTTCCGGAATTCAGACATCCAGTTGAC CCAGTCT | 3 'BsiWI Jκ to GCCACCGTACG TTTGATCTCCAG CTTGGTC | |
| 5 'EcoR1 Vκ 1D 43 CTTGGCGAATTCAGCCATCCGGATGA CCCAGTC | 3 'BsiWI Jκ 3 GCCACCGTACGTTTGATATCCACT TTGGTC | |
| 5 'EcoR1 Vκ to 24 CTTCCGGAATTCAGATATTGTGATGA CCCAGAC | ||
| 5 'EcoR1 Vκ to 28 CTTCCGGAATTCAGATATTGTGATG ACTCAGTC | ||
| 5 'EcoR1 Vκ 2 30 CTTCCGGAATTCAGATGTTGTGATGA CTCAGTC | ||
| 5 'EcoR1 Vκ 3 11 CTTCCGGAATTCAGAAATTGTGTTG ACACAGTC | ||
| 5 'EcoR1 Vκ 3 15 CTTCCGGAATTCAGAAATAGTGATG ACGCAGTC | ||
| 5 'EcoR1 Vκ 3 20 CTTCCGGAATTCAGAAATTGTGTTGA CGCAGTCT | ||
| 5 'EcoR1 Vκ 4 1 CTTCCGGAATTCAGACATCGTGATG ACCCAGTC | ||
| 5 'EcoR1 Vλ en CTTCCGGAATTCACAGTCTGTGCT GACKCAG | 3 'Avrll Jλ 1 til 3 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTSACCT TGGTCCC | |
| 5 'EcoR1 Vλ to CTTCCGGAATTCACAGTCTGCCC TGACTCAG | 3 'Avrll Jλ 4 CTGGTTACCTAGGAAAATGATCAGC TGGGTTCC | |
| 5 'EcoR1 Vλ 3 CTTCCGGAATTCATCCTATGAGC TGACWCAG | 3 'Avrll Jλ 5 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAGC TCGGTCCC | |
| 5 'EcoR1 Vλ 4 til 5 CTTCCGGAATTCACAGCYTGTG CTGACTCA | 3 'Avrll Jλ 6 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAGCT GGGTGCC | |
| 5 'EcoR1 Vλ 6 CTTCCGGAATTCAAATTTTATGC TGACTCAG | 3 'Avrll Jλ 7 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAC TTGGTCCAT | |
| 5 'EcoR1 Vλ 7 til 8 CTTCCGGAATTCACAGRCTGTG GTGACYCAG | ||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | 0,076 | 0.077 | 2,003 | 0.080 | 0.138 | 0.102 | 0,188 | 0,338 | 0,040 | 2,041 | 0,051 | 0.081 |
| B | 2,011 | 0,085 | 0,074 | 0,069 | 0.081 | 0,122 | 0.372 | 2,133 | 0,119 | 0,097 | 0,072 | 0,072 |
| C | 0,068 | 0,179 | 0,091 | 0,073 | 0.077 | 0,097 | 0,606 | 1,882 | 0.081 | 2,071 | 0.094 | 0,075 |
| D | 0,063 | 0,070 | 0,065 | 0,071 | 0,082 | 2,071 | 0,339 | 2,089 | 0,076 | 0,086 | 0,066 | 0,069 |
| E | 1,921 | 0.077 | 0,065 | 0,085 | 0,095 | 1,968 | 1.910 | 0,122 | 0,072 | 0,070 | 0,065 | 0,066 |
| F | 0,113 | 0,068 | 0,066 | 0,082 | 0,088 | 0,090 | 0,460 | 0,070 | 0,079 | 0,952 | 0,098 | 0,065 |
| G | 2,041 | 2,108 | 1,472 | 0,665 | 0,331 | 0,194 | 0,123 | 0.094 | eft "> 0.0800,072 | 0,070 | 0,072 | |
| H | 2,146 | 2,132 | 1,634 | 0,665 | 0,341 | 0,178 | 0,132 | 0.094 | 0,082 | 0.080 | 0,074 | 0,068 |
| Standarder ng / mL | 1000 | 500 | 250 | 125 | 62.5 | 31.25 | 15.6 | 7.8 | 3.9 | 1,95 | 0,975 | 0 |
Tabell 2. Representative resultater av IgG screening av ELISA. Clone Supernatanter er i A1-A10, B1-B10, C1-C10, D1-D10, E1-E10, F1-F10. Blanks er i A11, B11, C11, D11, E11, F11, A12, B12, C12, D12, E12, F12.Standard kurve er duplisert: G1-G12 og H1-H12. Den tilsvarende konsentrasjonen av immunglobuliner i hvert duplikat er vist below.Positive eller IgG-produserende kloner, er vist i mørk grå. Negative eller ikke-IgG-produserende kloner, er vist i lys grå
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette manuskriptet, er alle trinnene for generering av IgG antistoffer fra menneskelige PBMCer presenteres i detalj. Denne protokollen inneholder noen fordeler i forhold til tidligere publiserte teknikker. En av fordelene er at det antistoff som frem holder de tunge og lette kjeder som svarer til den opprinnelige paret i B-celle-klon. Identifiseringen av IgG antistoffer kan gjøres på en hvilken som helst type menneskelig donor, og det er ikke behov for forverring av immunresponsen på grunn av vaksinering 5. Bruken av fibroblastcellelinje WI38 som en mater celle, tillater en mer rask påvisning av de voksende kloner, siden de er morfologisk forskjellige og meget lett å skille, sammenlignet med de som brukes PBMC som mater cellen i tidligere beskrevne arbeid 1,6- 8. Videre har bruken av WI38 som en mater celle favoriserer frysing av store mengder av celle delmengder som lett kan tint og dyrket før hvert eksperiment.
En av de critiCal skritt i denne protokollen er utgangsmaterialet: PBMC. Hvis blod er blitt venter for lenge for sentrifugering, eller etter ekstrahering av PBMC, og lagres ikke i de aktuelle iskaldt forhold; som sådan antallet levedyktige celler vil bli redusert, sammen med nummeret til B-celle-kloner som produserer IgG erholdt. Av den grunn er en tidlig ekstraksjon og en god bevaring av PBMC-er anbefalt for et vellykket resultat. Antallet av IgG-produserende kloner vil være begrenset til antallet av PBMC ved begynnelsen av forsøket. Høyere tall av PBMC vil gi høyere antall IgG-produserende kloner og et mangfold av antistoffproduksjon. En annen kritisk trinn er kloning av PCR-fragmenter av de lette og tunge kjeder av antistoffet. Hvis ligation ikke lykkes etter flere forsøk, er et ekstra trinn for å klone den 2. PCR-produkt i en TopoTA system anbefales. Fordøyelsen av innsatsen med de riktige enzymer kan være letterei TopoTA vektor, for en etterfølgende ligering i pFUSEss ekspresjonsvektorer.
Denne teknikken kan bli overført til alle typer menneskelig vev hvori humane B-celler er anriket 3. Den kan også anvendes for å studere andre typer immunglobuliner, bare ved å endre de merkede antistoffer som brukes for sortering (antistoffer mot IgM, IgE, IgA eller IgD), primeren design for PCR, og de uttrykte vektorer. Studiene av disse immunglobuliner kan være av interesse for å forstå, innledende immunresponser, slimhinner antistoff sekresjon og allergi profiler, blant andre.
Som konklusjon, har vi beskrevet en teknikk for å fremstille humane rekombinante monoklonale IgG-antistoffer som etterlater de tunge og lette kjeder parene av det humane immunoglobulin intakt. Teknikken er nyttig og lett å utføre fra en blodprøve. De monoklonale antistoffene som oppnås gjennom denne fremgangsmåten er potensielt nyttige ved studier av humane immunresponser. Videre kan monoklonale antistoffer fremstilt med denne metoden er et godt utgangspunkt for utvikling av immuno-terapeutiske midler for forskjellige patologiske tilstander.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forskning kontrakt Miguel Servet (ISCIII CD14 / 00 032) til (GN-G.). Fellowship fra Nederland Organisasjonen for Scientific Research "Graduate School of Translasjonell Neuroscience Program" (022005019) til (CH).
Tilskudd fra Prinses Beatrix Fonds (Prosjekt WAR08-12) og Foreningen Française contre les Myopatier til (PM-M.); samt av en Veni Brorskap nederlandske organisasjonen for Scientific Research (916.10.148) et fellesskap av Brain Foundation of the Netherlands (FS2008 (1) -28) og Prinses Beatrix Fonds (Prosjekt WAR08-12) (til ML ).
Vi takker Jozien Jaspers for hennes hjelp i B-celle sortering av flowcytometri.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | solution containing polysucrose and sodium diatrizoate |
| FACSAria II cell sorter | BD Biosciences | ||
| 96 U-bottom micro well plates | Costar | 3799 | |
| Advanced Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco, Life Technologies | 12633-020 | |
| 30% v/v EBV-containing supernatant of the B95-8 cell line | ATCC | CRL-1612 | 3.4 x 108 copies/ml |
| CpG2006 | Invivogen | ODN 7909 | |
| Wi38 cells | Sigma-Aldrich | 90020107 | |
| Interleukin-2 | Roche | 10799068001 | |
| ELISA plates | Greiner Bio-One, Microlon | 655092 | |
| AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific (unconjugated) | Jackson ImmunoResearch | 109-006-008 | |
| 4% non-fat dry milk (Blotting Grade Blocker) | Biorad | 170-6404 | |
| Human IgG | Sigma | I 2511 | HUMAN IgG purified Immunoglobulin, 5.6 mg/ml |
| Goat F(ab)2 antihuman IgG Fcγ (conjugated with peroxidase (PO)) | Jackson ImmunoResearch | 109-036-008 | |
| ELISA reader (Perkin Elmer 2030) | Perkin Elmer | 2030-0050 | |
| Peroxidase-conjugated AffiniPure Rabbit Anti-Human IgM, Fc5µ | Jackson ImmunoResearch | 309-035-095 | |
| SuperScript III Cells Direct cDNA Synthesis System | Invitrogen | 18080-200 | |
| Applied Biosystems (ABI) GeneAm PCR System 2700 | Applied Biosystems | ||
| High Pure RNA Isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| Reverse transcription system kit | Promega | A3500 | |
| Recombinant Taq DNA Polymerase | TAKARA | R001A | |
| Primers (2 μl) | Sigma | ||
| Ultrapure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 100 bp ladder | Invitrogen | 15628-019 | |
| Quantity One 4.5.2 (Gel Doc 2000) | Biorad | 170-8100 | |
| QIAquick PCR purification kit | QIAGEN | 28106 | |
| BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit | Applied Biosystems | 4337455 | |
| 0.1 ml reaction plate (MicroAMP Optical 96-well) | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Genetic analyser ABI300 | Applied Biosystems | 4346906 | |
| DH5α competent cells (E. coli) | Invitrogen | 18263-012 | |
| pFUSEss-CHIg-hG1 (4,493 bp) | Invivogen | pfusess-hchg1 | |
| pFUSEss-CHIg-hG4 (4,484 bp) | Invivogen | pfusess-hchg4 | |
| pFUSE2ss-CLIg-hk (3,875 bp) | Invivogen | pfuse2ss-hclk | |
| pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3,883 bp) | Invivogen | pfuse2ss-hcll2 | |
| SOC medium | Invitrogen | 15544-034 | |
| LB-based agar medium supplemented with Zeocin (Fast-Media Zeo Agar) | Invivogen | fas-zn-s | |
| Terrific Broth (TB)-based liquid medium supplemented with Zeocin (Fast-Media Zeo TB) | Invivogen | fas-zn-l | |
| DNA Miniprep kit | Omega Bio Technology | D6942-02 | |
| Nanodrop (ND1000 Spectrophotometer) | Nanodrop | ||
| LB-based agar medium supplemented with Blasticidin (Fast-Media Blast Agar) | Invivogen | fas-bl-s | |
| Terrific Broth (TB)-based liquid medium supplemented with Blasticidin (Fast-Media Blast TB) | Invivogen | fas-bl-l | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | 20,000 U/ml, in 10x NEBuffer EcoRI |
| NheI | New England Biolabs | R0131S | 10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 2.1 |
| 2-Log DNA ladder | New England Biolabs | N3200S | 0.1-10.0 kb, 1,000 μg/ml |
| XmaI | New England Biolabs | R0180S | 10,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer |
| BsiWI | New England Biolabs | R0553S | 10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 3.1 |
| AvrII | New England Biolabs | R0174S | 5,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase | Thermo Scientific | EF0651 | 1 U/µl, in 10x FastAP Buffer |
| DH5α competent cells | Invitrogen | 18263-012 | |
| PE Mouse Anti-Human IgG | BD Pharmingen | 555787 | |
| anti-CD22, PerCP-Cy5.5, Clone: HIB22 | Fisher scientific | BDB563942 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | |
| BigDye Terminator v3.1 | Applied Biosystems | 4337455 |
References
- Vrolix, K., et al. Clonal heterogeneity of thymic B cells from early-onset myasthenia gravis patients with antibodies against the acetylcholine receptor. J Autoimmun. 52, 101-112 (2014).
- Yamashita, M., Katakura, Y., Shirahata, S. Recent advances in the generation of human monoclonal antibody. Cytotechnology. 55 (2-3), 55-60 (2007).
- Pereira, K. M., Dellavance, A., Andrade, L. E. The challenge of identification of autoantibodies specific to systemic autoimmune rheumatic diseases in high throughput operation: Proposal of reliable and feasible strategies. Clin Chim Acta. 437, 403-410 (2014).
- Losen, M., et al. Treatment of myasthenia gravis by preventing acetylcholine receptor modulation. Ann N Y Acad Sci. 1132, 174-179 (2008).
- Smith, K., et al. Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen. Nat Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).
- Fraussen, J., et al. A novel method for making human monoclonal antibodies. J Autoimmun. 35 (2), 130-134 (2010).
- Traggiai, E., et al. An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat Med. 10 (8), 871-875 (2004).
- Fraussen, J., et al. Autoantigen induced clonal expansion in immortalized B cells from the peripheral blood of multiple sclerosis patients. J Neuroimmunol. 261 (1-2), 98-107 (2013).
- Yamashita, M., et al. Different individual immune responses elicited by in vitro immunization. Cytotechnology. 40 (1-3), 161-165 (2002).
- Hui-Yuen, J., Koganti, S., Bhaduri-McIntosh, S. Human B cell immortalization for monoclonal antibody production. Methods Mol Biol. 1131, 183-189 (2014).
- Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
- Lanzavecchia, A., Corti, D., Sallusto, F. Human monoclonal antibodies by immortalization of memory B cells. Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 523-528 (2007).
- Traggiai, E. Immortalization of human B cells: analysis of B cell repertoire and production of human monoclonal antibodies. Methods Mol Biol. 901, 161-170 (2012).
- Strober, W., et al. Monitoring cell growth. Curr Protoc Immunol / edited by. John E. Coligan ... [et al.]. Appendix 3, Appendix 3A (2001).
- Ibrahim, S. F., van den Engh, G. Flow cytometry and cell sorting. Adv Biochem Eng Biotechnol. 106, 19-39 (2007).
- Leith, J. T., Padfield, G., Faulkner, L. E., Quinn, P., Michelson, S. Effects of feeder cells on the X-ray sensitivity of human colon cancer cells. Radiother Oncol. 21 (1), 53-59 (1991).
- Hui-Yuen, J., McAllister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-McIntosh, S. Establishment of Epstein-Barr virus growth-transformed lymphoblastoid cell lines. J Vis Exp. (57), 3321 (2011).
- Smith, L. M., et al. Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis. Nature. 321 (6071), 674-679 (1986).
