Introduction
Dendritische cellen (DCs) zijn essentiële mediatoren van het aangeboren en adaptieve immuunsysteem. Zij functioneren primaire immuunreacties induceren en de ontwikkeling van immunologische geheugen vergemakkelijken. Deze cellen zijn primair verantwoordelijk voor antigen capture, migratie en T-cel stimulatie en worden derhalve aangeduid als professionele antigeen presenterende cellen (APC's) 1 .Manipulation van DCs kan worden gebruikt in een breed scala aan onderzoeksgebieden en de klinische setting voor de behandeling van verschillende ontstekingsziekten zoals HIV 6,7, 8 kanker, auto-immuunziekten 9 en allergische reacties 10. DC's worden ook gebruikt voor drugsmisbruik onderzoek om onbekende mechanismen en paden, zoals die in verband met afhankelijkheid van alcohol 11-14, drugsverslaving 13,15, en de combinatie van HIV-infectie en drugsmisbruik 16-19 op te lossen. Deze lopende studies en toekomstig onderzoek studies in het gebied van immunologie maken vitro generatie DCs van groot belang voor onderzoek. Er zijn echter een aantal problemen van de isolatie DCs uit menselijk bloed zij slechts 0,1 uitmaken - 1% van de totale mononucleaire cellen 20.
Tot op heden enkele gevestigde werkwijzen voor het genereren van DCs in vitro uit kunststof of glas hechting van monocyten 21,22, dichtheid gradiënt centrifugatie 23 specifieke merker gebaseerde scheiding zoals magnetische geactiveerde celsortering 22, fluorescent geactiveerde celsortering 24, positieve selectie van CD14 + monocyten met behulp van dextran beklede magnetische nanodeeltjes 25 en snelle isolatie van sterk gezuiverde monocyten met behulp van volledig geautomatiseerde negatieve celselectie 26. De beste methode van keuze blijft controversieel. Daarom DC generatietechnieken verbeteren, zijn verschillende methoden ontwikkeld waarbijde zuiverheid van deze cellen sterk vergroten door differentiatie van gezuiverde CD34 + progenitor cellen en monocyten geïsoleerd uit perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) 27. Zoals voorafgaand genoemd, een veel gebruikte en populaire werkwijze voor het genereren van monocyten afgeleide dendritische cellen (MDDCs) is het vermogen van monocyten hechten aan glas of kunststof (hechting methode) 21,22,27 verkennen. De hechting werkwijze is een snelle en eenvoudige methode die het gebruik van complexe apparatuur vereist. Echter enige nadelen van deze werkwijze omvatten lymfocyt besmetting geringe flexibiliteit en monocyt voorbijgaande manipulatie 28. Een alternatieve methode om de hechting methode is de magnetische isolatie van monocyten van totaal PBMC's, met name het gebruik van een menselijke monocyt verrijking kit, die is ontworpen om monocyten uit PBMC geïsoleerd door negatieve selectie 26. Tijdens deze procedure worden ongewenste cellen gericht te verwijderen met tetrameerantilichaamcomplexen en dextran-beklede magnetische deeltjes. Het voordeel van deze isolatiewerkwijze is dat de ongewenste gemerkte cellen worden gescheiden met een magneet terwijl doelcellen vrij kan worden afgegoten in een nieuwe buis zonder de noodzaak voor kolommen. Tot op heden, door de beschikbaarheid van specifieke monoklonale antilichamen die unieke celpopulaties kunnen etiketteren, de magnetische scheidingstechniek is geworden, niet alleen een extra methode, maar een noodzaak voor het isoleren van zeldzame cellen op het gebied van immunologie. Bijvoorbeeld technieken zoals magnetische celsortering met een commercieel verkrijgbare paramagnetische MACS-nanodeeltjes hebben de ontwikkeling mogelijk van nieuwe benaderingen voor onderzoek en klinische toepassingen 22,29. Bovendien hebben recente studies vergelijken DC generatie van monocyten hechting en MACS technologie methoden een hogere DC zuiverheid en levensvatbaarheid aangetoond met behulp van MACS gescheiden monocyten 22,30.
De huidige studie presenteerteen vergelijking tussen twee werkwijzen voor het genereren van humane DCs van monocyten geïsoleerd uit PBMC: 1) isolatie van monocyt aanhechting en 2) monocyt isolatie door negatieve selectie met behulp van een commerciële kit menselijke monocyt verrijking. Deze studie geeft aanwijzingen dat de negatieve selectie magnetische scheidingswerkwijze om monocyten te isoleren genereert de hoogste opbrengst van monocyten geen significant verschil in de levensvatbaarheid van monocyten in vergelijking met monocyten geïsoleerd door hechting methode. Op zijn beurt, na zeven dagen, de monocyten geïsoleerd door magnetische scheiding onderverdeeld in MDDCs duidelijk hogere prolifereren en grotere hoeveelheid cellen die dubbel positief (CD11c + / CD14 +) fenotype zonder dat MDDC levensvatbaarheid. Kortom, de huidige studie verschilt van de vorige studies bovengenoemde aangezien toont het vermogen van beide technieken gelijktijdig genereren monocyten die kunnen prolifereren en differentiëren tot zijn CD11c +MDDCs (> 70%) na zeven dagen in de cultuur, zonder afbreuk te doen aan de levensvatbaarheid. Daarnaast is de huidige benadering voorziet voor het eerst karakterisatie van verschillende CD11c / CD14 MDDCs populaties door beeldvorming flowcytometrie.
Kortom, omdat DCs een brandpunt rol ten aanzien van onderzoek op het gebied van de immunologie spelen, verschillende parameters moet rekening worden gehouden bij het overwegen van hoe ze worden afgeleid en welke methoden worden gebruikt voor het isoleren en kweken ze in vitro. Daarom is deze studie heeft tot doel inzicht te verschaffen over twee verschillende methoden van monocyten isolatie en hoe deze methoden differentieel invloed monocyten levensvatbaarheid en de opbrengst uiteindelijk van invloed zijn dendritische levensvatbaarheid van de cellen, proliferatie en fenotype. Deze bevindingen sterk zal bijdragen aan het gebied van immunologie en zal een gedetailleerd protocol van DC isolatie, zuivering en karakterisatie verschaffen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Over het algemeen menselijk bloed studies zijn beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Review Board (IRB) van FIU, IRB protocol goedkeuring # IRB-13-0440 goedgekeurd. Human leukopaks werden gekocht van de gemeenschap bloedbank in Miami, FL.
1. Isolatie van PBMC door Standard Density Gradient Technique
- Voer een 1: 1 verdunning van bloed met 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing in een T75 kolf.
- Pipetteer 15 ml van dichtheidsgradiënt oplossing in 50 ml centrifugebuizen en voorzichtig laag (25 - 30 ml / tube) van het verdunde bloed over dit verloop.
- Centrifugeer gedurende 20 minuten bij 1200 xg bij versnelling van 1 en vertraging van 0.
- Na centrifugeren, verzamel de grensvlaklaag (witte bloedcellen) in een nieuwe 50 ml centrifugebuis en wassen cellen tweemaal in PBS (3 min bij 1080 x g). Gooi supernatant elke keer.
- Behandel cellen met ammonium-chloride-kalium lyseren (ACK) buffer (om rode bloedcellen te lyseren). Voeg 10 ml buffer encubate gedurende 15 min bij 4 ° C.
- Was de cellen tweemaal met PBS, centrifugeer gedurende 3 min bij 1080 x g en verwijder het supernatant elke keer.
- Sla de korrel, die de PBMC's zal bevatten.
- Doorgaan met monocyt zuiveringswerkwijze van keuze.
2. monocyten Zuivering door Adherence Method
- Bereid volledige celcultuur medium dat L-glutamine (300 mg / ml) en aangevuld met penicilline (50 U / ml) -streptomycin (50 ug / ml) en 10% foetaal runderserum.
- Sta PBMC te houden gedurende ongeveer 2 uur door ze te kweken in een T75 kolf bij een concentratie van 5 x 10 7 cellen per 10 ml compleet medium bij 37 ° C en 5% CO2 in een bevochtigde incubator.
- Na incubatie verwijdert niet-hechtende cellen van drijvende kweekfles en voorzichtig te wassen hechtende cellen tweemaal met PBS.
- Incubeer hechtende cellen volledig celkweekmedium aangevuld met 2 pl / ml humaan granulocyt-macrophage-koloniestimulerende factor (GM-CSF) en interleukine 4 (IL-4) opgeslagen bij een voorraad concentratie van 10 ug / ml.
- Verander de helft van het medium en vul cytokines elke 48 uur.
- Laat 5-7 dagen voor de differentiatie van monocyten in MDDCs.
3. monocyten Zuivering door magnetische scheidingswerkwijze
- Verzamelen PBMC van standaard dichtheidsgradiënt techniek, giet in een 5 ml polystyreen buis en resuspendeer in PBS buffer bij een concentratie van cellen / ml.
- Voeg menselijke monocyt verrijkingscocktail gebruik 50 ul / ml cellen, goed mengen en incuberen bij 4 ° C gedurende 10 minuten.
- Na incubatie voeg magnetische deeltjes middels 50 ul / ml cellen, goed mengen en incuberen bij 4 ° C gedurende 5 minuten.
- Breng celsuspensie tot een totaal volume van 2,5 ml door toevoeging van PBS buffer, meng goed door en neer te pipetteren 2-3 keer.
- Plaats de polystyreen buis zonder kap in het magnetisch apparaat en weggezet bij kamertemperatuur 2.5 minuten.
- Na incubatie en in één vloeiende beweging, halen de magneet en giet de gewenste gezuiverde monocyten fractie in een schone 50 ml centrifugebuis.
- Incubeer hechtende cellen volledig celkweekmedium aangevuld met 2 pl / ml humaan granulocyt-macrofaag-koloniestimulerende factor (GM-CSF) en interleukine 4 (IL-4) opgeslagen bij een voorraad concentratie van 10 ug / ml.
- Elke 48 uur, veranderen de helft van het medium, spin down bij 1.080 xg gedurende 5 minuten en resuspendeer pellet met nieuwe media (CRPMI) en cytokines.
- Laat 5-7 dagen voor de differentiatie van monocyten in MDDCs.
4. trypanblauwexclusie levensvatbaarheid Assay
Opmerking: Gebruik deze techniek om de cel opbrengst en de levensvatbaarheid van PBMCs, monocyten en MDDCs verkrijgen.
- Oogst cellen met standaard trypsine-EDTA en voer wassen van de kolven en de celpellet middels PBS. Afhankelijk van de grootte van de pellet, reschorsen 5-10 ml PBS om de pellet op te lossen.
- In een micro-centrifugebuis Voer een 1: 1 verdunning van trypan blauw reagens verdund celpellet.
- Vanuit deze mix, aliquot 10 pi in een cel tellen glijbaan en lezen resultaten met behulp van een geautomatiseerde celgetalmeter volgens het protocol van de fabrikant. Als een geautomatiseerde celgetalmeter niet beschikbaar is, een soortgelijke cellen is mogelijk met een hemocytometer of handmatige teller.
5. MTT assay
- Plaat cellen bij een concentratie van 4 x 10 4/100 gl volledig medium in elk putje in een 96-well plaat. Laat 24 uur voor de cellen aan te passen aan de cultuur.
- Incubeer en uitvoeren aflezingen bij respectievelijk 0 (dag 0), 36 (dag 3) en 84 (dag 7) uur.
- Bij voltooiing van de gewenste incubatie, verwijder de media en te vervangen door 100 ul van PBS alleen.
- Bereid 3- (4,5-dimethyl-2-yl) -2,5-difenyl tetrazolium bromide oplossing (MTT) (5 mg / ml) door toevoeging van 10 ml dimethyl sulfoxide (DMSO) aan 1 g natriumdodecylsulfaat (SDS).
- Voeg 10 ul (5 mg / ml) MTT-oplossing aan elk putje en incubeer bij 37 ° C gedurende 2 extra uren.
- Na incubatie, verwijder supernatanten die PBS en onbekeerde MTT mengsel (geel-kleur oplossing) bevatten.
- Voeg 100 pl SDS-DMSO oplossing in elk putje en incubeer gedurende een extra uur.
- Lees absorptie bij 540 nm met een microplaat reader.
6. celoppervlak kleuring Analyse door Imaging flowcytometrie
- Na 7 dagen differentiatie van gezuiverde monocyten, afzien 1x10 6 cellen hoeveelheden van de van monocyten afgeleide dendritische cellen in het juiste aantal 1,5 ml buizen.
- Start celoppervlak kleuring blokkeert cellen middels 50 pl door hitte geïnactiveerd (HI) humaan serum, incuberen bij 4 ° C gedurende 10 minuten.
- Na incubatie Centrifugeer cellen bij 720 g gedurende 5 min, gooi supernatant.
- Om pelle celt, voeg respectieve fluorochroom-geconjugeerde antilichamen (bijvoorbeeld anti-CD 11 c of anti-CD14) en incuberen bij 4 ° C gedurende 20 minuten beschermd tegen licht. In afzonderlijke buizen, bereiden single-fluorochroom gekleurde samples / ml), omdat ze nodig zijn voor compensatie.
- Na incubatie, wassen cellen tweemaal in 1 ml PBS buffer en centrifugeer telkens bij 720 xg gedurende 5 minuten.
- Het houden van cellen beschermd tegen licht, opnieuw te schorten in PBS buffer bij een concentratie van cellen / 100 pl voor flowcytometrie-analyse.
- Om hek aan levensvatbare cellen, voeg 1 pl DAPI aan elke buis vóór het verwerven van de cellen op de cel imaging flowcytometrie instrument volgens de instructies van de fabrikant.
7. Statistische analyse
- Input alle gegevens in een spreadsheet.
- Vergelijk resultaten middels t-test van de student en / of one-way ANOVA waar nodig.
- Beschouw verschillen statistisch significant als p <0,05 is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Monocyten Yield door magnetische scheiding is hoger in vergelijking met monocyten Yield door Adherence Method
Gegevens in Figuur 1 tonen PBMC en monocyten celtellingen door de trypan blauw exclusie werkwijze op de dag van isolatie van PBMC en scheiding van monocyten. Gemiddeld monocyten geïsoleerd door hechting werkwijze voor ongeveer 6,2 procent van de totale PBMCs terwijl monocyten geïsoleerd door magnetische scheiding goed voor maximaal 25 procent van PBMC. Statistische analyse toonde dat het percentage monocyten opgeleverd door magnetische scheiding significant hoger (≥ 4 maal). Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD van ten minste drie onafhankelijke experimenten. Statistische analyse onder toepassing van t student-test toonde een significant verschil van monocyt rendement bij het vergelijken van beide methoden (p ≤ 0,0005).
_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> monocyten Isolation door Adherence en door magnetische scheiding hebben geen invloed op de levensvatbaarheid van monocytenNa isolatie van monocyten door de twee verschillende technieken hierboven beschreven, werden levensvatbaarheid assays uitgevoerd om te waarborgen dat de gebruikte werkwijzen waren niet cytotoxisch en die de levensvatbaarheid van de cellen. De gegevens in figuur 2 tonen het gemiddelde van het percentage van levensvatbare monocyten geïsoleerd door ofwel aanhechting methode of door magnetische scheiding. Levensvatbare cellen werden geteld met behulp van de trypan blauw exclusie werkwijze op de dag van isolatie. Vergelijking procent levensvatbaarheid van monocyten tussen de twee isolatiemethoden bleek dat het verschil tussen beide groepen was niet statistisch significant. Bovendien, het gemiddelde van het percentage van levensvatbare monocyten geïsoleerd door hechting was 91,75 ± 1,66% en het gemiddelde van het percentage van levensvatbare monocyten geïsoleerd door magneTIC scheiding was 87,4% ± 2.75. De levensvatbaarheid werd bepaald uit ten minste drie onafhankelijke experimenten. Statistische significantie werd bepaald onder toepassing van t-test van Student.
Cellen afkomstig van monocyten geïsoleerd door magnetische scheiding Toon een aanzienlijke stijging van de Cell Proliferation Vergeleken met cellen afkomstig van monocyten overgenomen door Adherence Method
MTT werd gebruikt als een colorimetrische assay voor celproliferatie te meten. In levende cellen, is de gele kleur van tetrazool MTT teruggebracht tot paars formazan die gemakkelijk wordt gemeten met een spectrofotometer. De in figuur 3 gegevens tonen dat beide processen van isolatie monocyten leidt tot hogere celproliferatie gedurende 7 dagen zoals gemeten door een toename in absorptie op dag 0 (hechting methode: 0,22 ± 0,02 vs. magnetische methode: 0,38 ± 00,02), dag 3 (therapietrouw methode: 0,28 ± 0,02, magnetische methode: 0,55 ± 0,05) en dag 7 (therapietrouw methode: 0,36 ± 0,01, magnetische = 0,66 ± 0,006). Anders dan de XTT assay (gegevens niet getoond), de MTT assay toonde een significante toename van celproliferatie van MDDCs van monocyten geïsoleerd door magnetische scheiding opzichte MDDCs van monocyten verkregen door hechting werkwijze op dag 0 (p = 0,003), dag 3 (p = 0,006), en dag 7 (p = 0,002). Celproliferatie werd vastgesteld significant verschillend tussen dag 0 en 3 (p = 0,003) te zijn, en tussen 0 en dag 7 (p <0,001) binnen de groep MDDCs van monocyten gezuiverd door middel van magnetische scheiding. Bovendien is een significant verschil in celproliferatie tussen dag 0 en dag 7 in MDDCs van monocyten gezuiverd met adhesie (p = 0,008) waargenomen. MTT assay werd uitgevoerd met MDDCs verkregen uit drie verschillende experimenten. Statistische significantie werd bepaald met ANOVA en t-test van Student, p ≤ 0,05 wals significant beschouwd, en p-waarden worden genoteerd op de grafiek, tenzij er geen statistische significantie werd gevonden.
Karakterisering van MDDCs door CD 11 c en CD14 celoppervlak kleuring
Na het kweken van monocyten gedurende zeven dagen met IL-4 en GM-CSF, MDDCs verkregen monocyten geïsoleerd door hechting en magnetische isolatiemethoden werden gekarakteriseerd in figuur 4. Karakterisatie onthulde lage enkelvoudige CD14 + / CD11c- fenotype of zuiver monocytische populatie in beide methoden, hechting = 1% ± 1,0 versus magnetische = 1% ± 0,0 en hoge totale CD11c + fenotype, hechting = 72% ± 11 versus magnetische = 79% ± 19. wanneer de totale CD14 + populatie werd verder geanalyseerd, er een hoge opbrengst van cellen dubbele positief voor CD 11 c en CD14 in beide methoden met magnetische scheiding geven van een hoger aantal CD 11 c en CD14 dubbel positiefpopulatie vergeleken met de hechting werkwijze hechting = 49% ± 7 versus magnetische = 73% ± 15. Hoewel, was er een hogere opbrengst aan MDDCs met dubbele positieve fenotype via magnetische scheiding, de CD11c positieve en CD14 negatieve populatie MDDCs hoger was in de hechting methode; hechting = 23% ± 7 versus magnetische = 6% ± 7. In figuur 4B, de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) van elke afzonderlijke marker werd gekeken in de gesloten populatie en toonde een hoge intensiteit van CD14 op CD14 + populatie, dezelfde intensiteit van beide CD 11 c en CD14 in de dubbele positieve populatie en hoge CD11c intensiteit in CD11c + en CD14- bevolking. Kortom, hoewel magnetische isolatie geeft een hoger percentage CD11c + / CD14 + -cellen, die kunnen vroege stadium gesplitste MDDCs die nog de monocyt marker (CD14) zijn gedaald, de hechting werkwijze geeft een hoger percentage CD11c + / CD14-, die kan een laat stadium gedifferentieerde MDDC bevolking. in Addition, DAPI kleuring werd uitgevoerd levensvatbaarheid resultaten te bevestigen en te zorgen karakterisering werd uitgevoerd op levende MDDCs. Het percentage DAPI negatieve / levende cellen (therapietrouw = 76 ± 7 versus magnetische = 67 ± 1) zijn niet significant verschillend tussen de twee methoden te bevestigen beide methoden hebben geen invloed op de levensvatbaarheid van het MDDCs na zeven dagen in de cultuur.
Figuur 1. monocyten vangst in Magnetic Separation is hoger dan monocyten vangst in Adherence methode. Ongeveer 6,2% van de monocyten werden geïsoleerd uit PBMC met de hechting werkwijze terwijl ~ 25% van de monocyten werden verkregen met de magnetische scheidingswerkwijze. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD van ten minste drie onafhankelijke experimenten. t-test statistische analyse met student vertoonde een significant verschil van monocyt rendement bij het vergelijken van beide methoden(p = 0. 00005). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Isolatie van monocyten Hechting en Magnetic Separation Niet invloed monocyten Levensvatbaarheid. Het gemiddelde van het percentage van levensvatbare monocyten geïsoleerd door hechting was 91,75 ± 1,66% en het gemiddelde van het percentage van levensvatbare monocyten geïsoleerd door magnetische scheiding was 87,4% ± 2.75. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD percentage van levensvatbare cellen van ten minste drie onafhankelijke experimenten. Geen significant verschil werd waargenomen in de levensvatbaarheid van de cellen bij het vergelijken van beide zuiveringsmethoden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. cellen afkomstig van monocyten geïsoleerd door magnetische scheiding Toon een aanzienlijke stijging van de Cell Proliferation Vergeleken met cellen afkomstig van monocyten overgenomen door Adherence methode. Een significante toename in absorptie werd waargenomen voor beide methoden zowel op dag 3 en dag 7 bij het vergelijken van de waarden tegen zijn respectieve controles op dag 0. Voorts ANOVA en student t-test toonde een significant verschil in absorptie van MTT opname bij het vergelijken van beide methoden (p ≤ 0,05). De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD van drie onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
96 / 54296fig4.jpg "/>
Figuur 4. Karakterisering van MDDCs door CD 11 c en CD14 celoppervlak kleuring. A) Bar grafiek die de verschillende populaties (% gated uit enkele cellen). Eerst werden DAPI- (levend) cellen gated uit totaal enkele cellen. Dan, CD14 + / CD11c-, CD 11 c +, CD 11 c + / CD14 + en CD11c + / CD14- werden afgesloten van DAPI- (levend) bevolking. CD 11 c + bevolking is de optelling van de twee regio's CD11c + / CD14 + en CD11c + / CD14-. B) Vertegenwoordiger grafieken die de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) waarden voor zowel CD 11 c en CD14 in elke subpopulatie van cellen. C) Vertegenwoordiger scatter plots van cellen gelabeld met CD11c-APC en CD14-APCcy7 gated op DAPI negatief (levend) celpopulatie voor zowel magnetische en therapietrouw methoden. Representatief beeld galerie van enkele cellen (geselecteerd in het blauw in de scatter plots) die behoren tot elke sub-populatie van cellen, CD 11 c + / CD14- (gated in oranje), CD 11 c + / CD14 + (gatedin rood), en CD14 + (gated in paars). In de fotogalerij van enkele cellen, de rode kleur vertegenwoordigt CD11c gelabeld met APC en gele kleur vertegenwoordigt CD14 gelabeld met APCcy7. In de scatter plots, de gekozen om de poort van de bevolking kleuren zijn willekeurig en komen niet overeen met de werkelijke cel beelden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gebaseerd op de bekende problemen isoleren en het genereren MDDCs uit humaan bloed, deze studie gericht op een uitgebreide vergelijking van twee gevestigde werkwijzen voor het genereren van MDDCs verschaffen. De eerste methode vergeleken is een gevestigde traditionele werkwijze voor het MDDCs door gebruik van het vermogen van monocyten hechten aan glas of kunststof (hechting methode) 21,22,27. De hechting werkwijze is snel en kostenbesparend, en niet het gebruik van ingewikkelde apparatuur. Echter, een aantal nadelen van dit proces zijn onder lymfocyt contaminatie, geringe flexibiliteit, monocyten voorbijgaande manipulatie 22,30,31. De tweede alternatieve werkwijze vergeleken is de magnetische isolatie van monocyten van totale perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) met een menselijke monocyt verrijking kit 26, die is ontworpen om monocyten uit PBMC geïsoleerd door negatieve selectie. Het voordeel van deze isolatiewerkwijze is dat de ongewenste cellenworden gelabeld en gescheiden met een magneet terwijl de doelcellen vrij worden afgegoten in een nieuwe buis zonder kolommen en zonder direct gericht op de cellen met antilichamen. Ongeacht monocyt isolatiewerkwijze (versus hechtende magnetische scheiding), nadat beide procedures een van de cruciale stappen in het protocol is de in vitro stimulatie van de monocyten met granulocyt macrofaag kolonie-stimulerende factor (GM-CSF) en interleukine-4 ( IL-4), die moeten MDDCs genereren. Dit is een veel voorkomende en gevestigde protocol om MDDCs van mononucleaire bloedcellen te genereren, zonder afbreuk te doen aan antigeen invangen en verwerkingscapaciteit karakteristiek van onrijpe MDDCs 32. Een van de belangrijkste beperkingen van de technieken die gewoonlijk gebruikt voor de in vitro generatie van DCs is de lage opbrengst van voorlopercellen, zoals monocyten. Zoals hierboven gemeld, monocyten geïsoleerd door de aanhechting methode goed voor ongeveer 6,2 procent van de totale PBMCS, terwijl monocyten geïsoleerd door magnetische scheiding goed voor maximaal 25 procent van PBMC. Volgens de literatuur, bereiken voor differentiële witte bloedcellen van normale volwassenen voor monocyten 2-1% van de totale mononucleaire cellen 20-10% 31 terwijl slechts 0,1 DCs vormen. Derhalve kan de hoge opbrengst van monocyten (~ 25%) verkregen na magnetische scheiding te wijten aan onzuiverheid van celpopulatie en het ontbreken van antilichaam en / of magnetische deeltjes binden aan ongewenste cellen.
Om een hoge opbrengst en zuiverheid van het geïsoleerde monocyten dienen alle kritische stappen in het protocol zorgvuldig gevolgd. Tijdens isolatie van PBMC's uit bloed door middel van standaard dichtheidsgradiënt centrifugatie, zijn er enkele kritische stappen. Ten eerste, pipetteren en zorgvuldig gelaagdheid van bloed over dichtheidsgradiënt oplossing in 50 ml centrifugebuizen is een stap die praktijk vereist omdat pipetteren hard kan het mengen van deze oplossing en het bloed,die kan leiden tot een zwak PBMC laag die moeilijk te isoleren, of het kan leiden tot een totale mengsel van rode bloedcellen met PBMC. In deze stap is het belangrijk om een constante en relatief langzame stroom van pipetteren behouden om een welbepaalde laag van bloed bij een aanzienlijk PBMC laag hebben. Tweede centrifugatie in de volgende stap acceleratie en deceleratie 1 0 is zeer kritisch. Als deze instellingen niet worden gebruikt voor de eerste centrifugatie stap zal leiden tot het mengen van het bloed met de dichtheidsgradiënt oplossing vertoont en niet de PBMC gescheiden van de rest van de bloedcomponenten. Ten derde is het belangrijk om de PBMC met ammonium-chloride-kalium (ACK) lysisbuffer geïncubeerd maximaal de geoptimaliseerde tijd (10-15 minuten) sinds langere incubatie met ACK kan leiden tot vermindering van levensvatbare PBMC met rode bloedcellen . Daarnaast is het ook belangrijk de PBS wast na ACK incubatie uit te voeren. Indien de rode bloedcellen niet gelyseerd met de eersteACK stap en ze nog blijven verschijnen na wasbeurten, is een nieuwe ronde van ACK lyserende sterk aanbevolen.
Na isolatie van de witte bloedcellen, zijn er een paar kritische stappen in gedachten te houden bij het uitvoeren van de hechting methode om monocyten te genereren. Ten eerste, het wassen van de drijvende lymfocyten na twee uur incubatie van PBMC's is erg belangrijk omdat de aanwezigheid van drijvende lymfocyten veroorzaken minder monocyten te houden en kan ook resulteren in lagere MDDC zuiverheid. Hoewel deze wasstappen zijn kritisch, overdreven en harde wassen (meer dan de aanbevolen, dat wil zeggen, tweemaal) kunnen wassen te leiden uit de hechtende monocyten, wat resulteert in lagere monocyten opbrengst. Ten tweede, het incuberen van de cellen met compleet medium en cytokinen kritisch daar de cytokinen verantwoordelijk zijn voor differentiatie van monocyten in MDDCs. Daarnaast, veranderende media en aanvulling van de cytokinen elke 48 uur is belangrijk voor differentiatie en overleving van de cellen. Terwijl veranderende media, is het ook belangrijk om de drijvende MDDCs slaan en terug te geven weer in kweek met vers medium en cytokinen omdat er een aantal MDDCs die los van het oppervlak tijdens het differentiatieproces. Ook belangrijk om ervoor te zorgen dat de monocyten worden gezaaid in de aanbevolen concentratie bevestigd en dicht bij elkaar, omdat ze cel tot cel contact nodig hebben om te groeien. Bij het uitvoeren van de magnetische scheidingswerkwijze monocyten genereren, zijn er enkele kritische stappen om een goede opbrengst en hoge zuiverheid van monocyten krijgen. Ten eerste is het essentieel om de celconcentratie aanbevolen door de fabrikant handhaven. Het is ook belangrijk om de polystyreen buis niet storen wanneer geplaatst in de magneet, aangezien het kan leiden tot geringere opbrengst en mindere zuiverheid. Zoals hierboven weergegeven, deze techniek leidt tot een aanzienlijk hogere opbrengst monocyt (figuur 1) vergeleken met de hechting werkwijze, die kan worden gerelateerd aan de aanwezigheid van andere cells. Wanneer verder de cellen werden gekarakteriseerd door doorstroomcytometrie, de magnetische werkwijze geeft een hoger percentage dubbel positieve cellen (CD 11 c + / CD14 +), die correleren met de aanwezigheid van andere cellen of kunnen ook door de aanwezigheid van verschillende stadia van MDDC differentiatie.
Een ander belangrijk aspect van in vitro MDDC genereren ongeacht opbrengst en zuiverheid is het vermogen om levensvatbare en proliferatieve MDDCs genereren. De huidige studie geeft bewijzen dat beide zuiveringswerkwijzen induceren proliferatie van MDDCs (figuur 3) zoals blijkt uit de toename in cel metabolische activiteit gedurende zeven dagen in kweek. Bovendien, het genereren van MDDCs van monocyten gezuiverd door magnetische scheiding vertoonden een significant hogere proliferatie te vergelijken MDDCs gegenereerd uit monocyten gezuiverd door hechting (figuur 3). Deze bevindingen zijn in overeenstemming met eerdere literatuur waaruit blijkt dat gENERATIE van DCs uit CD34 + cellen een proliferatief proces door de aanwezigheid van proliferatieve DC voorlopers in menselijk bloed 27, 33. Er zijn echter controversieel bevindingen blijkt dat monocyten ook differentiëren in dendritische zonder enig bewijs van proliferatie 34,35. Het is van belang erop te wijzen dat er veel controverse over de in vitro generatie van DCs en over de vraag of DC gegenereerd uit prolifererende voorlopers of differentiatie van monocyten. Zo hebben in vitro productie van DC van vreemde perifere bloedcellen bleek ook verrijken in stamcellen die in staat zijn proliferatie na blootstelling aan GM-CSF 27 zijn en er is ook bewijs dat aantoont dat de opbrengst van DCs verkregen in aanwezigheid van GM-CSF en IL-4 kan niet worden uitgebreid dan het aantal start monocyten 33. Over het algemeen, de huidige studie toont een verhoogde proliferatie van Monocytic cellen in cultuur die door zeven dagen resulteren in een totale MDDCs populatie met> 70% CD 11 c + fenotype (hechting = 72% ± 11 versus magnetische = 79% ± 19). Het is van belang erop te wijzen dat bij verdere fenotypische analyse uitgevoerd, hoewel niet significant, monocyten geïsoleerd door het magnetische scheidingswerkwijze geleid MDDCs met een hogere dubbele positieve fenotype (hechting = 49% ± 7 CD11c + / CD14 + en magnetische = 73% ± 15 CD11c + / CD14 +), terwijl de monocyten geïsoleerd door adhesie resulteerde in MDDCs met een hogere enkel positief fenotype (therapietrouw = 23% ± 7 CD11c + / CD14- versus magnetische = 6% ± 7 CD11c + / CD14-). MDDCs met een hogere dubbele positieve fenotype (CD 11 c + / CD14 +) kunnen onder vroege stadia van differentiatie, terwijl MDDCs met een hogere enkel positief fenotype kan onder late stadia van differentiatie.
Kortom, deze studie levert het bewijs ter ondersteuning van dat de negatieve selectie magnetische scheiding procedure monocyten geïsoleerd genereert de hoogste opbrengst van monocyten geen significant verschil in de levensvatbaarheid van monocyten in vergelijking met monocyten geïsoleerd door hechting methode. Op zijn beurt, na zeven dagen, de monocyten geïsoleerd door magnetische scheiding onderverdeeld in MDDCs duidelijk hogere prolifereren en grotere hoeveelheid cellen die dubbel positief (CD11c + / CD14 +) fenotype zonder dat MDDC levensvatbaarheid. Bij het vergelijken van beide werkwijzen werden de bevindingen van het vermogen van beide technieken gelijktijdig genereren monocyten die in staat zijn proliferatie (figuur 3) en differentiëren (figuur 4) in CD11c + MDDCs na zeven dagen in kweek zijn aangezien beide methoden leverden> 70% CD 11 c + MDDCs aangetoond . Echter, een nadere analyse te kijken naar de rijping markers nuttig zijn voor het volledig karakteriseren van de functionele MDDC bevolking. Concluderend, beide werkwijzen zijn voordelig alternatief voor het isoleren van CD 11 c + MDDCs en provide voldoende rendement voor onderzoekstoepassingen en kunnen ook bruikbaar zijn voor toekomstige klinische toepassingen. Het laboratorium is momenteel gericht op het genereren van MDDCs om de effecten van alcoholmisbruik en andere stoffen van inhoud op het aangeboren afweersysteem, in het bijzonder het vermogen van deze stoffen om MDDC fenotype en functie te wijzigen. Daarom zal de huidige studie een basislijn van MDDC karakterisering geven en het vermogen om te gaan met verdere experimenten om de moleculaire mechanismen bemiddelende-monocyten afgeleide dendritische celfunctie in het kader van verslaving helderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-5442-03 | Must be used at RT |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Life Technologies | 10010-023 | |
| ACK Lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 22400-089 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Life Technologies | 15240-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| RoboSep buffer | StemCell | 20104 | |
| EasySep Human monocyte enrichment kit | StemCell | 19059 | |
| TC20 Automated cell counter | Bio-Rad | 145-0101 | |
| FITC-Dextran | Sigma Aldrich | FD4-100MG | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | |
| Synergy 2 multi-mode reader | Biotek | 7131000 | |
| XTT Sodium salt bioreagent (XTT) | Sigma Aldrich | X4626-100MG | |
| Dimethyl sulfoxide bioreagent (DMS) | Sigma Aldrich | D8418-500ML | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT) | Sigma Aldrich | m5655-500MG | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Bio-Rad | 161-0302 | |
| Phenazine Methosulfate (DMSO) | Sigma Aldrich | P9626-1G | |
| Inactivated (HI) Human Serum | Chemicon | S1-100ML | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | BD Accuri | 653119 | |
| FlowSight Amnis Flow Cytometer | EMD Millipore | 100300 |
References
- Cella, M., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Origin maturation and antigen presenting function of dendritic cells. Curr Opin Imunol. 9, 10-16 (1997).
- Banchereau, J., et al.
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Kaouther, M., Ridha, O.
- Steinman, R., Gutchinov, B., Witmer, M., Nussenzweig, M. Dendritic cells are the principal stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice. J Exp Med. 157, 613-627 (1983).
- Nair, M. N., et al. RNAi-directed inhibition of DC-SIGN by dendritic cells: Prospects for HIV-1 therapy. AAPS J. 7, E572-E578 (2005).
- Agudelo, M., et al. Chapter 10. Dendritic Cells: Types, Life Cycles and Biological Functions. , Nova Publishers. 167-177 (2010).
- Kajihara, M., Takakura, K., Ohkusa, T., Koido, S. The impact of dendritic cell-tumor fusion cells on cancer vaccines - past progress and future strategies. Immunotherapy. , (2015).
- Suwandi, J., Toes, R., Nikolic, T., Roep, B. Inducing tissue specific tolerance in autoimmune disease with tolerogenic dendritic cells. Clin Exp Rheumatol. 33, 0097-0103 (2015).
- Gorelik, M., Frischmeyer-Guerrerio, P. A. Innate and adaptive dendritic cell responses to immunotherapy. Curr Opin Allergy Immunol. 15, 575-580 (2015).
- Zwolak, A., et al. Peripheral blood dendritic cells in alcoholic and autoimmune liver disorders. Hum Exp Toxicol. 31, 438-446 (2012).
- Agudelo, M., et al. Differential expression and functional role of cannabinoid genes in alcohol users. Drug Alcohol Depend. 133, 789-793 (2013).
- Nair, M. P., Figueroa, G., Casteleiro, G., Muñoz, K., Agudelo, M. Alcohol Versus Cannabinoids: A Review of Their Opposite Neuro-Immunomodulatory Effects and Future Therapeutic Potentials. J Alcohol Drug Depend. 3, 184 (2015).
- Boukli, N. M., et al. Implications of ER Stress, the Unfolded Protein Response, and Pro- and Anti-Apoptotic Protein Fingerprints in Human Monocyte-Derived Dendritic Cells Treated With Alcohol. Alcohol Clin Exp Res. 34, 2081-2088 (2010).
- Nair, M. N., Mahajan, S., Sykes, D., Bapardekar, M., Reynolds, J. Methamphetamine Modulates DC-SIGN Expression by Mature Dendritic Cells. J Neuroimmune Pharmacol. 1, 296-304 (2006).
- Napuri, J., et al. Cocaine Enhances HIV-1 Infectivity in Monocyte Derived Dendritic Cells by Suppressing microRNA-155. PLoS ONE. 8, e83682 (2013).
- Nair, M. P. N., Saiyed, Z. M. Effect of methamphetamine on expression of HIV coreceptors and CC-chemokines by dendritic cells. Life Sciences. 88, 987-994 (2011).
- Nair, M. P. N., et al. Cocaine Modulates Dendritic Cell-Specific C Type Intercellular Adhesion Molecule-3-Grabbing Nonintegrin Expression by Dendritic Cells in HIV-1 Patients. J Immunol. 174, 6617-6626 (2005).
- Reynolds, J. L., Mahajan, S. D., Sykes, D. E., Schwartz, S. A., Nair, M. P. N. Proteomic analyses of methamphetamine (METH)-induced differential protein expression by immature dendritic cells (IDC). Biochem Biophys Acta. 1774, 433-442 (2007).
- Van Voorhis, W., Hair, L., Steinman, R., Kaplan, G. Human dendritic cells. Enrichment and characterization from peripheral blood. J Exp Med. 155, 1172-1187 (1982).
- Davis, G. The Mac-1 and p150,95 beta 2 integrins bind denatured proteins to mediate leukocyte cell-substrate adhesion. Exp Cell Res. 200, 242-252 (1992).
- Delirezh, N., Shojaeefar, E. Phenotypic and functional comparison between flask adherent and magnetic activated cell sorted monocytes derived dendritic cells. Iran J Immunol. 9, 98-108 (2012).
- Lehner, M., Holter, W. Endotoxin-Free Purification of Monocytes for Dendritic Cell Generation via Discontinuous Density Gradient Centrifugation Based on Diluted Ficoll-Paque Plus®. Int Arch Allergy Immunol. 128, 73-76 (2002).
- Van Brussel, I., et al. Fluorescent activated cell sorting: An effective approach to study dendritic cell subsets in human atherosclerotic plaques. J. Immunol Methods. 417, 76-85 (2015).
- Mucci, I., et al. The methodological approach for the generation of humandendritic cells from monocytes affects the maturation state of the resultant dendritic cells. Biologicals. 37, 288-296 (2009).
- Yuan, N., et al. The American Association of Immunologists (AAI). , AAI. Miami Beach, FL. (2007).
- Romani, N., et al. Proliferating dendritic cell progenitors in human blood. J Exp Med. 180, 83-93 (1994).
- Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. J Leukoc Biol. 56, 236-240 (1994).
- Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A, 643-647 (2010).
- El-Sahrigy, S. A., Mohamed, N. A., Talkhan, H. A., Rahman, A. M. A. Comparison between magnetic activated cell sorted monocytes and monocyte adherence techniques for in vitro generation of immature dendritic cells: an Egyptian trial. Cent Eur J Immunol. 40, 18-24 (2015).
- Curry, C. V. Differential Blood Count. , http://emedicine.medscape.com/article/2085133-overview (2015).
- Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179, 1109-1118 (1994).
- Cavanagh, L. L., Saal, R. J., Grimmett, K. L., Thomas, R. Proliferation in Monocyte-Derived Dendritic Cell Cultures Is Caused by Progenitor Cells Capable of Myeloid Differentiation. Blood. 92, 1598-1607 (1998).
- Ardeshna, S. M., et al. Monocyte-derived dendritic cells do not proliferate and are not susceptible to retroviral transduction. Br J Haematol. 108, 817-824 (2000).
- Chapuis, F., et al. Differentiation of human dendritic cells from monocytes in vitro. Eur J Immunol. 27, 431-441 (1997).
- Zhou, L. J., Tedder, T. F. CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells. Proc Natl Acad Sci. 93, 2588-2592 (1996).
- Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180, 1841-1847 (1994).
- Caux, C., et al. Activation of human dendritic cells through CD40 cross-linking. J Exp Med. 180, 1263-1272 (1994).
- Fujii, S. i, Liu, K., Smith, C., Bonito, A. J., Steinman, R. M. The Linkage of Innate to Adaptive Immunity via Maturing Dendritic Cells In Vivo Requires CD40 Ligation in Addition to Antigen Presentation and CD80/86 Costimulation. J Exp Med. 199, 1607-1618 (2004).
- Mohammadi, A., Mehrzad, J., Mahmoudi, M., Schneider, M., Haghparast, A. Effect of culture and maturation on human monocyte-derived dendritic cell surface markers, necrosis and antigen binding. Biotech Histochem. 90, 445-452 (2015).
