Introduction
Dendritiska celler (DC) är viktiga mediatorer för de medfödda och adaptiva immunsystem. De fungerar att inducera primära immunsvar och underlätta utvecklingen av immunologiskt minne. Dessa celler är primärt ansvariga för antigeninfångnings, migration och T-cellstimulering och därför hänvisas till som professionella antigenpresenterande celler (APC) en .Manipulation av DC: er skulle kunna användas inom ett stort antal olika forskningsområden och inom klinisk miljö för att behandla olika inflammatoriska sjukdomar såsom hiv 6,7, cancer 8, autoimmuna sjukdomar 9, och allergiska reaktioner 10. DCs används också för substansmissbruk forskning för att lösa okända mekanismer och vägar såsom de som förknippas med alkoholberoende 11-14, narkotikamissbruk 13,15, och kombinationen av HIV-infektion och missbruk 16-19. Dessa pågående studier och framtida studier forskning jagn området immunologi gör in vitro generation av DCs extremt viktigt för forskning. Emellertid finns det flera svårigheter som är förknippade med isolering av DC: er från humant blod som de bara utgör 0,1-1% av de totala mononukleära blodceller 20.
Hittills några av de väl etablerade metoder för generering av DC: er in vitro består av plast eller glas vidhäftning av monocyter 21,22, densitetsgradientcentrifugering 23, specifik markör baserad separation, såsom magnetisk aktiverad cellsortering 22, fluorescensaktiverad cellsortering 24 positiv selektion av CD14 + monocyter använder dextran-belagda magnetiska nanopartiklar 25, och snabb isolering av höggradigt renade monocyter med fullt automatiserad negativ cellselektion 26. Men den bästa metoden för val förblir kontroversiell. Därför, för att förbättra DC generationens teknik, har flera metoder utvecklats i vilkarenheten hos dessa celler kan ökas avsevärt genom differentiering från renade CD34 + progenitorceller och monocyter isolerade från perifert blod mononukleära celler (PBMC) 27. Såsom nämnts tidigare, är en allmänt använd och populär metod för att generera som härstammar från monocyter dendritiska celler (MDDCs) för att undersöka förmågan hos monocyter att vidhäfta till glas eller plast (vidhäftning metod) 21,22,27. Vidhäftningen metoden är en snabb och enkel metod som inte kräver användning av komplicerad utrustning. Men några nackdelar med denna process inkluderar lymfocyter föroreningar, låg flexibilitet, och monocyt gående manipulation 28. En alternativ metod för att vidhäftningen metod är den magnetiska isolering av monocyter från de totala PBMC, särskilt med användning av en human monocyt anrikning kit, som är utformad för att isolera monocyter från PBMC genom negativ selektion 26. Under denna procedur, är oönskade celler riktade bort med tetramerantikroppskomplex och dextran-belagda magnetiska partiklar. Fördelen med denna isoleringsmetoden är att de oönskade märkta celler separeras med användning av en magnet medan målceller kan fritt hälldes av in i ett nytt rör utan behov av kolumner. Hittills med tillgängligheten av specifika monoklonala antikroppar som kan märka unika cellpopulationer har den magnetiska separationstekniken blir inte bara ytterligare en metod, utan en nödvändighet för isolering av sällsynta celler inom immunologi. Till exempel, tekniker såsom magnetisk cellsortering med kommersiellt tillgängliga paramagnetiska MACS-nanopartiklar har underlättat utvecklingen av nya metoder för forskning och kliniska tillämpningar 22,29. Dessutom har de senaste studier som jämför DC generationen från monocytvidhäftning och Mac teknikmetoder visade en högre DC renhet och livskraft med hjälp av MACS separerade monocyter 22,30.
Den aktuella studien presenteraren jämförelse mellan två metoder för generering av humana DCs från monocyter isolerade från PBMC: 1) monocyt isolering genom vidhäftning och 2) monocyt isolering genom negativ selektion med användning av en kommersiell mänsklig monocyt anrikning kit. Denna studie ger belägg för att den negativa selektions magnetiska separationsförfarande för att isolera monocyter genererar den högsta avkastningen av monocyter med inga signifikanta skillnader i monocyt livsduglighet jämfört med monocyter isolerade genom vidhäftning metod. I sin tur, efter sju dagar, monocyterna som isolerats genom magnetisk separation differentieras till MDDCs med signifikant högre proliferativ kapacitet och större mängd celler som uttrycker dubbla positiva (CD11c + / CD14 +) fenotyp utan att påverka MDDC viabilitet. Sammantaget skiljer den aktuella studien från tidigare studier som refereras ovan, eftersom det visar förmågan hos båda teknikerna samtidigt generera monocyter som kan tillväxa och differentiera till CD11c +MDDCs (> 70%) efter sju dagar i kultur utan att kompromissa deras livskraft. Dessutom ger den nuvarande strategin för första gången karakterisering av olika CD11c / CD14 MDDCs populationer av avbildning flödescytometri.
Sammanfattningsvis, eftersom DCs spelar en central roll när det gäller forskning inom immunologi, olika parametrar måste beaktas när man överväger hur de kommer och vilka metoder som används för att isolera och kultur dem in vitro. Därför syftar denna studie för att ge insikter om två olika metoder för monocyt isolering och hur dessa metoder differentiellt påverka monocyt lönsamhet och avkastning på sikt påverkar dendritiska celler livskraft, tillväxt, och fenotyp. Dessa fynd kommer att bidra mycket till området immunologi och kommer att ge ett detaljerat protokoll av DC isolering, rening, och karakterisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Generellt studier humanblod har granskats och godkänts av Institutional Review Board (IRB) av FIU, IRB protokoll godkännande # IRB-13-0440. Mänskliga leukopaks köptes från samhället blodbank i Miami, FL.
1. Isolering av PBMC från Standard densitetsgradient Technique
- Utföra en 1: 1 spädning av blod med 1x-fosfatbuffrad saltlösning i en T75-flaska.
- Pipett 15 ml av densitetsgradient lösning i 50 ml centrifugrör och noggrant skikt (25 - 30 ml / rör) av det utspädda blodet över denna gradient.
- Centrifugera i 20 min vid 1200 xg med acceleration av en och retardation 0.
- Efter centrifugering uppsamlades den gränsyteskiktet (vita blodkroppar) in i ett nytt 50 ml centrifugrör och tvätta cellerna två gånger i PBS (3 min vid 1080 xg). Kassera supernatanten varje gång.
- Behandla celler med ammonium-klorid-kalium lysera (ACK) buffert (för att lysera röda blodkroppar). Tillsätt 10 ml buffert och icubate under 15 min vid 4 ° C.
- Tvätta cellerna två gånger med PBS, centrifugera i 3 min vid 1080 xg och kassera supernatanten varje gång.
- Spara pelleten, som kommer att innehålla PBMC.
- Fortsätt med monocyt reningsmetoden val.
2. monocyt Rening genom vidhäftning metod
- Förbereda fullständigt cellodlingsmedium innehållande L-glutamin (300 mg / ml) och kompletterat med penicillin (50 U / ml) -streptomycin (50 | j, g / ml) och 10% fetalt bovint serum.
- Tillåt PBMC vidhäfta under approximativt 2 h genom odling dem i en T75-flaska vid en koncentration av 5 x 10 7 celler per 10 ml komplett medium vid 37 ° C och 5% CO2 i en fuktad inkubator.
- Efter inkubation, avlägsna icke-vidhäftande flytande celler från odlingskolv och försiktigt tvätta vidhäftande cellerna två gånger med PBS.
- Inkubera vidhäftande celler i fullständigt cellodlingsmedium kompletterat med 2 | j, l / ml av human granulocyt-macrophage-kolonistimulerande faktor (GM-CSF) och interleukin 4 (IL-4) lagras vid en stamkoncentration av 10 pg / ml.
- Ändra hälften av mediet och fylla cytokiner varje 48 timmar.
- Låt 5 - 7 dagar för differentieringen av monocyter i MDDCs.
3. monocyt Rening genom magnetisk separationsmetod
- Samla PBMC från standard densitetsgradient-teknik, häll i en 5 ml polystyrenrör och återsuspendera i PBS-buffert vid en koncentration av celler / ml.
- Lägg humant monocyt anrikningscocktail med användning av 50 | j, l / ml celler, blanda väl och inkubera vid 4 ° C under 10 min.
- Efter inkubationen, till magnetiska partiklar med användning av 50 | j, l / ml celler, blanda väl och inkubera vid 4 ° C under 5 min.
- Bringa cellsuspensionen upp till en total volym av 2,5 ml genom tillsats av PBS-buffert, blanda väl genom pipettering upp och ned 2 - 3 gånger.
- Placera polystyren röret utan ett lock i den magnetiska anordningen och sattes åt sidan vid rumstemperatur under 2.5 min.
- Efter inkubation och i en kontinuerlig rörelse, plocka upp magneten och häll den önskade renade monocytfraktionen i en ren 50 ml centrifugrör.
- Inkubera vidhäftande celler i fullständigt cellodlingsmedium kompletterat med 2 | j, l / ml av human granulocyt-makrofag-kolonistimulerande faktor (GM-CSF) och interleukin 4 (IL-4) lagras vid en stamkoncentration av 10 pg / ml.
- Varje 48 timmar, ändra hälften av mediet, spinn ner vid 1080 xg under 5 min och återsuspendera pelleten med nya medier (cRPMI) och cytokiner.
- Låt 5 - 7 dagar för differentieringen av monocyter i MDDCs.
4. trypanblåttexklusion Viability Assay
Obs: Använd den här tekniken för att få cellutbytet och livskraft PBMC, monocyter och MDDCs.
- Harvest celler med användning av standard-trypsin-EDTA, och utföra tvättningar i kolvarna och cellpelleten med PBS. Beroende på storleken av pelleten, resuspendera i 5 till 10 ml PBS för att lösa upp pelleten.
- I en mikro-centrifugrör, utför en 1: 1-spädning av trypanblått reagens med utspädd cellpelleten.
- Från denna blandning lika stora 10 pl i en cell räknar bild och läsa resultaten med hjälp av en automatiserad cellräknare enligt tillverkarens protokoll. Om en automatiserad cellräknare inte är tillgänglig, är det möjligt en liknande cellräkning med en hemocytometer eller en manuell disk.
5. MTT-analys
- Platt celler vid en koncentration av 4 x 10 4/100 | il av fullständigt medium i varje brunn i en 96-brunnsplatta. Tillåt 24 h för celler att anpassa sig till kulturen.
- Inkubera och utför avläsningar vid 0 (dag 0), 36 (dag 3) och 84 (dag 7) hr respektive.
- Vid slutförandet av önskad inkubation, ta bort media och ersätt med 100 pl PBS enbart.
- Förbereda 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid-lösning (MTT) (5 mg / ml) genom att tillsätta 10 ml dimethyl sulfoxid (DMSO) till 1 g av natriumdodecylsulfat (SDS).
- Tillsätt 10 ^ il (5 mg / ml) av MTT-lösning till varje brunn och inkubera vid 37 ° C under ytterligare 2 timmar.
- Efter inkubation, avlägsna supernatanter som innehåller PBS och icke omvandlad MTT blandning (gul-färglösning).
- Tillsätt 100 pl av SDS-DMSO-lösning till varje brunn och inkubera under en ytterligare timme.
- Läs absorbans vid 540 nm med användning av en mikroplattläsare.
6. Cell ytfärgning Analys med Imaging Flow Cytometry
- Efter 7 dagars differentiering från renade monocyter, dispensera 1x10 6 celler alikvoter av monocythärledda dendritiska celler in i ett lämpligt antal av 1,5 ml rör.
- Starta cellytan färgning genom blockerande celler med användning av 50 ul av värmeinaktiverad (HI) humant serum, inkubera vid 4 ° C under 10 min.
- Efter inkubation centrifug cellerna vid 720 xg under 5 min, kassera supernatanten.
- Till cell pellet, lägga respektive fluorokromkonjugerade antikroppar (t.ex., anti-CD11c eller anti-CD14) och inkubera vid 4 ° C under 20 minuter skyddade från ljus. I separata rör, förbereda enstaka fluorokrom-färgade prover / ml) eftersom de behövs för ersättning.
- Efter inkubation, tvätta cellerna två gånger i 1 ml PBS-buffert och centrifugera varje gång vid 720 x g under 5 min.
- Hålla celler skyddade från ljus, återsuspendera i PBS-buffert vid en koncentration av celler / 100 | il för flödescytometrianalys.
- I syfte att grinden på viabla celler, tillsätt 1 pl av DAPI till varje rör före förvärva cellerna på den enda cell imaging flödescytometri instrument enligt tillverkarens instruktioner.
7. Statistisk analys
- Mata in alla data i ett kalkylblad.
- Jämför resultat med hjälp av t-test och / eller enkelriktad ANOVA så är lämpligt.
- Överväga skillnaderna vara statistiskt signifikant om p <0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Monocyt Utbyte av magnetisk separation är högre jämfört med monocyt Yield genom vidhäftning metod
Data som presenteras i figur 1 display PBMC och monocyt kroppar av trypanblått uteslutningsmetoden på dagen för isolering av PBMC och separation av monocyter. I genomsnitt, monocyter isolerade av följsamhet metoden svarade för cirka 6,2 procent av den totala PBMC medan monocyter isolerade genom magnetisk separation stod för upp till 25 procent av PBMC. Statistisk analys visade att andelen monocyter som uppkommer genom magnetisk separation var betydligt högre (≥ 4 gånger). Data uttrycks som medelvärden ± standardavvikelse för minst tre oberoende experiment. Statistisk analys med användning av studentens t-test visade en signifikant skillnad av monocyt utbyte när man jämför båda metoderna (p ≤ 0,0005).
_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> monocyt Isolering genom vidhäftning och magnetisk separation Påverka inte monocyt livskraftEfter monocyt isolering av de två olika tekniker som beskrivits ovan, viabilitetsanalyser utförs för att se till att de metoder som används var inte cytotoxiska och påverkar cellernas viabilitet. De data som presenteras i figur 2 display genomsnittet av procent av livsdugliga monocyter isolerade genom antingen vidhäftning metod eller genom magnetisk separation. Viabla celler räknades med användning av trypanblått-uteslutningsmetoden på dagen för isolering. Jämföra procent viabilitet av monocyter mellan de två isoleringsmetoder avslöjade att skillnaden mellan de båda grupperna var inte statistiskt signifikant. Dessutom, genomsnittet av procent av livsdugliga monocyter isolerade genom vidhäftning var 91,75% ± 1,66 och medelvärdet för den procentuella viabla monocyter isolerades genom magnetic separation var 87,4% ± 2,75. Dessa data viabilitet bedömdes från åtminstone tre oberoende experiment. Statistisk signifikans bestämdes med användning av Students t-test.
Celler från Monocyter isolerades genom magnetisk separation Visa en betydande ökning i cellproliferation Jämfört med celler från Monocyter Förvärvade genom anslutning metod
MTT användes som en kolorimetrisk analys för att mäta cellproliferation. I levande celler, är den gula tetrazol färgen MTT reduceras till lila formazan, som lätt mäts med användning av en spektrofotometer. De data som presenteras i Figur 3 visar att de båda processerna av monocyt isolering leda till högre cellproliferation under en period av 7 dagar, mätt med en ökad i absorbans vid dag 0 (vidhäftning metod: 0,22 ± 0,02 vs. magnetisk metod: 0,38 ± 00,02), dag 3 (vidhäftning metod: 0,28 ± 0,02, magnetisk metod: 0,55 ± 0,05) och dag 7 (anslutning metod: 0,36 ± 0,01, magnetisk = 0,66 ± 0,006). Men till skillnad från XTT-analys (data ej visade) avslöjade MTT-analysen en signifikant ökning av cellproliferation av MDDCs från monocyter isolerade genom magnetisk separation jämfört med MDDCs från monocyter som förvärvats genom vidhäftning metod vid dag 0 (p = 0,003), dag 3 (p = 0,006), och dag 7 (p = 0,002). Cell spridning konstaterades också att vara signifikant skillnad mellan dag 0 och 3 (p = 0,003), och mellan dag 0 och 7 (p <0,001) inom gruppen MDDCs från monocyter renade genom magnetisk separation. Vidare har en signifikant skillnad i celltillväxt mellan dag 0 och dag 7 i MDDCs från monocyter renas genom adhesion (p = 0,008) observerades. MTT-analysen utfördes med användning MDDCs förvärvats från tre olika experiment. Statistisk signifikans bestämdes med användning av ANOVA och t-test, p ≤ 0,05 wsom anses vara betydande, och p-värden noteras i diagrammet inte någon statistisk signifikans hittades.
Karakterisering av MDDCs genom CD11c och CD14 Cell Surface Färgning
Efter odling monocyter för sju dagar med IL-4 och GM-CSF, MDDCs erhållits från monocyter isolerade genom vidhäftning och magnetisk isoleringsmetoder karakteriserades i figur 4. Karakteriseringen avslöjade låg enda CD14 + / CD11c- fenotypen eller renodlat monocytisk befolkningen i båda metoderna, vidhäftning = 1% ± 1,0 jämfört med magnetisk = 1% ± 0,0 och hög total CD11c + fenotypen, vidhäftning = 72% ± 11 mot magnetisk = 79% ± 19. Men när den totala CD14 + populationen analyserades ytterligare, fanns ett högt utbyte av celler dubbla positiva för CD11c och CD14 i båda metoderna med magnetisk separation ger ett större antal CD11c och CD14 dubbel positivbefolkning jämfört med följsamhet metoden vidhäftning = 49% ± 7 mot magnetisk = 73% ± 15. Även om det fanns ett högre utbyte av MDDCs med dubbel positiv fenotyp via magnetisk separation, den CD11c positiva och CD14 negativ befolknings av MDDCs var högre i vidhäftning metoden; vidhäftning = 23% ± 7 mot magnetisk = 6% ± 7. I figur 4B, den genomsnittliga fluorescensintensiteten (MFI) för varje enskild markör har tittat på i gated befolkningen och visade hög intensitet CD14 i CD14 + populationen, motsvarande intensitet både CD11c och CD14 i dubbel positiv befolknings och hög CD11c intensitet i CD11c + och CD14- befolkning. Sammanfattningsvis, även om magnetisk isolering ger en högre procentandel av CD11c + / CD14 + celler, som kan vara ett tidigt skede differentierade MDDCs som ännu inte har sjunkit den monocytiska markör (CD14), ger följsamhet metoden en större andel av CD11c + / CD14-, som kan vara ett sent skede differentierade MDDC befolkning. i additjon, var DAPI färgning utfördes för att bekräfta livskraft resultat och för att säkerställa karakterisering utfördes på levande MDDCs. Procentandelen DAPI negativ / levande celler (vidhäftning = 76 ± 7 mot magnetisk = 67 ± 1) är inte signifikant olika mellan de två metoderna som bekräftar båda metoderna inte påverkar livsduglighet MDDCs efter sju dagar i odling.
Figur 1. Monocyt Utbyte genom magnetisk separation är högre jämfört med monocyt Utbyte av Adherence Method. Om 6,2% av monocyter isolerades från PBMC med användning av vidhäftningen, medan metoden att ~ 25% av monocyter erhölls med användning av den magnetiska separationsmetoden. Data uttrycks som medelvärden ± standardavvikelse för minst tre oberoende experiment. Statistisk analys med användning av Students t-test visade en signifikant skillnad av monocyt utbyte när man jämför båda metoderna(p = 0. 00005). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Monocyt Isolering av Vidhäftning och genom magnetisk separation Påverka inte monocyt Viability. Genomsnittet av procent av livsdugliga monocyter isolerade genom vidhäftning var 91,75% ± 1,66 och medelvärdet för den procentuella viabla monocyter isolerade genom magnetisk separation var 87,4% ± 2,75. Data uttrycks som medelvärde ± SD procentsats av livsdugliga celler av åtminstone tre oberoende experiment. Ingen signifikant skillnad observerades i cellviabilitet när man jämför de båda reningsmetoder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. celler från Monocyter isolerades genom magnetisk separation Visa en betydande ökning i cellproliferation Jämfört med celler från Monocyter förvärvade genom vidhäftning metod. En betydande ökning i absorbans observerades för båda metoderna både dag 3 och dag 7 när man jämför de värden mot sina respektive kontroller på dagen 0. Dessutom ANOVA och t-test visade också en signifikant skillnad i absorbans av MTT upptaget när man jämför båda metoderna (p ≤ 0,05). Data uttrycks som medelvärde ± SD av tre oberoende försök. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
96 / 54296fig4.jpg "/>
Figur 4. Karaktärisering av MDDCs av CD11c och CD14 cellytan Färgning. A) stapeldiagram som representerar de olika populationer (% gated av enskilda celler). Först var DAPI- (levande) celler gated från total enstaka celler. Därefter var CD14 + / CD11c-, CD11c +, CD11c + / CD14 + och CD11c + / CD14- gated från DAPI- (levande) befolkningen. CD11c + -populationen är summan av två regioner CD11c + / CD14 + och CD11c + / CD14-. B) Representativa kurvor som visar den genomsnittliga fluorescensintensiteten (MFI) värden för både CD11c och CD14 i varje subpopulation av celler. C) Representant spridningsdiagram av celler märkta med CD11c-APC och CD14-APCcy7 gated på DAPI negativa (levande) cellpopulationen för både magnetiska och vidhäftningsmetoder. Representativ bild galleri av enskilda celler (vald i blått i spridningsdiagram) som tillhör varje subpopulation av celler, CD11c + / CD14- (gated i orange), CD11c + / CD14 + (gatedi rött) och CD14 + (gated i lila). I bildgalleriet av enskilda celler, den röda färgen representerar CD11c märkt med APC och gul färg representerar CD14 märkt med APCcy7. I scatter tomter, de färger som valts till gate befolkningen är slumpmässiga och inte korrelerar med de faktiska cellbilder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
den aktuella studien bygger på de kända svårigheterna att isolera och generera MDDCs från humant blod, som syftar till att ge en omfattande jämförelse av två väletablerade metoder för generering av MDDCs. Den första metoden jämfört är en känd traditionell metod för att generera MDDCs genom att utnyttja förmågan hos monocyter att vidhäfta till glas eller plast (vidhäftning metod) 21,22,27. Vidhäftningen Metoden är snabb och kostnadseffektiv, och inte kräver användning av komplicerad utrustning. Men några nackdelar med denna process inkluderar lymfocyter föroreningar, låg flexibilitet, monocyt gående manipulation 22,30,31. Den andra alternativa metoden jämfört är den magnetiska isolering av monocyter från de totala perifera mononukleära blodceller (PBMC) med användning av en human monocyt anrikning kit 26, som är utformad för att isolera monocyter från PBMC genom negativ selektion. Fördelen med denna isolering metod är att oönskade cellerär märkta och separerades med användning av en magnet medan målcellerna fritt hälldes av in i ett nytt rör utan behov av kolonner och utan direkt inriktning av cellerna med antikropparna. Oavsett monocyt isoleringsmetod (vidhäftande mot magnetisk separation), efter båda förfarandena, är en av de kritiska stegen i protokollet stimulering av monocyter med granulocyt makrofag-kolonistimulerande faktor in vitro (GM-CSF) och interleukin-4 ( IL-4), som krävs för att generera MDDCs. Detta är en vanlig och väl etablerade protokoll för att generera MDDCs från mononukleära blodceller utan att kompromissa med antigen fånga och bearbetningskapacitet kännetecknande för omogna MDDCs 32. En av de största begränsningarna hos de tekniker som vanligen används för generering av DC: er in vitro är det låga utbytet av prekursorceller sådana som monocytema. Som rapporterats ovan, monocyter isolerade av följsamhet metoden svarade för cirka 6,2 procent av den totala PBMCs, medan monocyter isolerade genom magnetisk separation stod för upp till 25 procent av PBMC. Enligt litteraturen varierar för differentialräkning av vita blodkroppar i normala vuxna för monocyter är 2-10% 31 medan DCs endast utgör 0,1-1% av den totala mononukleära blodceller 20. Därför kunde det höga utbytet av monocyter (~ 25%) erhölls efter magnetisk isolering bero på förorening av cellpopulationen och brist på antikroppen och / eller magnetisk partikel bindning till oönskade celler.
För att uppnå en hög avkastning och renhet av de isolerade monocyter, bör alla kritiska steg i protokollet följas noggrant. Under isolering av PBMC från blod genom standard densitetsgradientcentrifugering, finns det några kritiska steg. För det första är pipettering och noggrant skiktning av blodet över densitetsgradient lösningen i 50 ml centrifugrör ett steg som kräver övning eftersom pipettering hårt kan orsaka blandning av denna lösning och blodet,vilket kan leda till en svag PBMC skikt som är svårt att isolera, eller det kan resultera i den kompletta blandningen av röda blodkroppar med PBMC. I detta steg är det viktigt att upprätthålla en konstant och relativt långsamt flöde av pipettering för att ha en väl definierad skikt av blod och en distinkt PBMC skikt. För det andra är centrifugering i nästa steg med accelerations 1 och retardation 0 mycket kritisk. Om dessa inställningar inte används för det första centrifugeringssteget, kommer det att leda till att blanda blodet med densitetsgradientlösningen oförutsägbart och kommer inte att separera PBMC från resten av blodkomponenterna. För det tredje är det viktigt att inkubera PBMC med ammonium-klorid-Kalium (ACK) lyserande buffert för längre än den optimerade tid (10-15 min) eftersom längre inkubation med ACK kan leda till en minskning av livsdugliga PBMC tillsammans med röda blodkroppar . Dessutom är det också viktigt att utföra PBS tvättar efter ACK inkubation. Om emellertid de röda blodkropparna inte lyseras med den förstaACK steg och de fortsätter att visas efter tvättar, är ytterligare en runda av ACK lyser rekommenderas.
Efter isolering av vita blodkroppar, finns det några viktiga steg att tänka på när du utför den följsamhet metod för att generera monocyter. För det första är mycket viktigt att tvätta bort de flytande lymfocyter efter två timmar av PBMC inkubation eftersom närvaron av flytande lymfocyter kan orsaka färre monocyter att vidhäfta och kan också resultera i lägre MDDC renhet. Även om dessa tvättsteg är kritiska, överdriven och hårda tvätt (mer än rekommenderat, det vill säga två gånger) kan orsaka tvätta bort de vidhäftande monocyter också, vilket resulterar i lägre monocyt utbyte. För det andra, inkubation av cellerna med komplett medium och cytokiner är kritisk eftersom cytokinerna är ansvariga för differentieringen av monocyter i MDDCs. Dessutom, föränderliga medie och fylla cytokinerna varje 48 timmar är viktig för differentiering och överlevnad av cellerna. Medan föränderliga medie, är det också viktigt att spara flytande MDDCs och returnera dem tillbaka till kulturen tillsammans med färskt medium och cytokiner eftersom det finns vissa MDDCs som kan lossna från ytan under differentieringsprocessen. Det också viktigt att se till att monocyterna sås vid den rekommenderade koncentrationen, fäst och tätt åtskilda eftersom de behöver cell till cell kontakten för att kunna växa. Vid utförande av den magnetiska separationsmetoden för att generera monocyter, finns det några viktiga steg i syfte att få ett bra utbyte och hög renhet av monocyter. För det första är det viktigt att bibehålla cellkoncentrationen som rekommenderas av tillverkaren. Det är också viktigt att inte störa polystyrenrör när den placeras i magneten, eftersom det kan leda till mindre utbyte och lägre renhet. Enligt presentationen ovan, leder denna teknik för att en signifikant högre monocyt utbyte (figur 1) i jämförelse med den följsamhet metoden, som kan vara relaterade till närvaron av andra calnar. När vidare cellerna karakteriserades med flödescytometri, visar den magnetiska metoden en högre procentandel av dubbelpositiva celler (CD11c + / CD14 +), som kan korrelera med närvaron av andra celler eller kan också vara på grund av förekomsten av olika etapper i MDDC differentiering.
En annan viktig aspekt av in vitro MDDC generation oavsett utbyte och renhet är förmågan att generera livskraftiga och proliferativa MDDCs. Den aktuella studien ger bevis för att de båda reningsmetoder inducera proliferation av MDDCs (Figur 3) som visas genom ökningen i cell metabolisk aktivitet under sju dagar i odling. Dessutom generationen MDDCs från monocyter renade genom magnetisk separation visade en signifikant högre frekvens av proliferation jämfört med MDDCs genereras från monocyter renade genom vidhäftning (Figur 3). Dessa upptäckter är i enlighet med tidigare litteratur visar att generation av DC: er från CD34 + celler är en proliferativ process på grund av närvaron av proliferativa DC progenitorer i humant blod 27, 33. Men det finns kontroversiella fynd visar att monocyter även kan differentiera till DC utan några tecken på spridning 34,35. Det är relevant att påpeka att det finns en hel del kontroverser om generering av DC in vitro och om huruvida utvecklingsländerna genereras från prolifererande prekursorer eller differentiering av monocyter. Till exempel har in vitro-produktion av DC från adherenta perifera blodceller visat sig också berika för progenitorceller som är kapabla av proliferation efter exponering för GM-CSF 27 och det finns också bevis som visar att utbytet av DC: er härledda i närvaro av GM-CSF och IL-4 kan inte utökas utöver antalet utgångs monocyter 33. Sammantaget visar den aktuella studien en ökad i proliferation av månocytic celler i odling som med sju dagar resulterar i en total MDDCs population med> 70% CD11c + fenotyp (vidhäftning = 72% ± 11 mot magnetisk = 79% ± 19). Det är relevant att påpeka att när ytterligare fenotypisk analys utfördes, men inte signifikant, monocytema isolerade av den magnetiska separationsmetoden resulterade i MDDCs med en högre dubbel positiv fenotyp (vidhäftning = 49% ± 7 CD11c + / CD14 + kontra magnetisk = 73% ± 15 CD11c + / CD14 +), medan monocyter isolerade genom vidhäftning resulterade i MDDCs med högre enda positiv fenotyp (vidhäftning = 23% ± 7 CD11c + / CD14- mot magnetisk = 6% ± 7 CD11c + / CD14-). MDDCs med högre dubbel positiv fenotyp (CD11c + / CD14 +) kan vara under tidiga stadier av differentiering medan MDDCs med högre enda positiv fenotyp kan vara under sena stadier av differentiering.
Sammanfattningsvis tillhandahåller denna studie bevis till stöd att det negativa urvalet magnetisk separering procedure för att isolera monocyter genererar den högsta avkastningen av monocyter med inga signifikanta skillnader i monocyt livsduglighet jämfört med monocyter isolerade genom vidhäftning metod. I sin tur, efter sju dagar, monocyterna som isolerats genom magnetisk separation differentieras till MDDCs med signifikant högre proliferativ kapacitet och större mängd celler som uttrycker dubbla positiva (CD11c + / CD14 +) fenotyp utan att påverka MDDC viabilitet. När man jämför de båda metoderna, har resultaten visat förmåga båda teknikerna samtidigt generera monocyter som kan tillväxa (Figur 3) och differentiering (Figur 4) till CD11c + MDDCs efter sju dagar i kultur sedan båda metoderna gav> 70% CD11c + MDDCs . Emellertid kan ytterligare analys tittar på mognadsmarkörer vara användbar för att fullständigt karaktärisera den funktionella MDDC befolkningen. Sammanfattningsvis båda metoder är fördelaktiga alternativ för isolering av CD11c + MDDCs och provide en tillräcklig avkastning för forskningsansökningar och kan även vara användbar för framtida kliniska tillämpningar. Labbet fokuserar för närvarande på generering av MDDCs att studera effekterna av alkoholmissbruk och andra missbrukssubstanser på det medfödda immunförsvaret, i synnerhet förmågan hos dessa ämnen att ändra MDDC fenotyp och funktion. Därför kommer den aktuella studien ger en baslinje MDDC karakterisering och öka förmågan att gå vidare med ytterligare experiment för att belysa de molekylära mekanismer som förmedlar monocyt-härledda dendritiska cellernas funktion i samband med missbruk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-5442-03 | Must be used at RT |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Life Technologies | 10010-023 | |
| ACK Lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 22400-089 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Life Technologies | 15240-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| RoboSep buffer | StemCell | 20104 | |
| EasySep Human monocyte enrichment kit | StemCell | 19059 | |
| TC20 Automated cell counter | Bio-Rad | 145-0101 | |
| FITC-Dextran | Sigma Aldrich | FD4-100MG | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | |
| Synergy 2 multi-mode reader | Biotek | 7131000 | |
| XTT Sodium salt bioreagent (XTT) | Sigma Aldrich | X4626-100MG | |
| Dimethyl sulfoxide bioreagent (DMS) | Sigma Aldrich | D8418-500ML | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT) | Sigma Aldrich | m5655-500MG | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Bio-Rad | 161-0302 | |
| Phenazine Methosulfate (DMSO) | Sigma Aldrich | P9626-1G | |
| Inactivated (HI) Human Serum | Chemicon | S1-100ML | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | BD Accuri | 653119 | |
| FlowSight Amnis Flow Cytometer | EMD Millipore | 100300 |
References
- Cella, M., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Origin maturation and antigen presenting function of dendritic cells. Curr Opin Imunol. 9, 10-16 (1997).
- Banchereau, J., et al.
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Kaouther, M., Ridha, O.
- Steinman, R., Gutchinov, B., Witmer, M., Nussenzweig, M. Dendritic cells are the principal stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice. J Exp Med. 157, 613-627 (1983).
- Nair, M. N., et al. RNAi-directed inhibition of DC-SIGN by dendritic cells: Prospects for HIV-1 therapy. AAPS J. 7, E572-E578 (2005).
- Agudelo, M., et al. Chapter 10. Dendritic Cells: Types, Life Cycles and Biological Functions. , Nova Publishers. 167-177 (2010).
- Kajihara, M., Takakura, K., Ohkusa, T., Koido, S. The impact of dendritic cell-tumor fusion cells on cancer vaccines - past progress and future strategies. Immunotherapy. , (2015).
- Suwandi, J., Toes, R., Nikolic, T., Roep, B. Inducing tissue specific tolerance in autoimmune disease with tolerogenic dendritic cells. Clin Exp Rheumatol. 33, 0097-0103 (2015).
- Gorelik, M., Frischmeyer-Guerrerio, P. A. Innate and adaptive dendritic cell responses to immunotherapy. Curr Opin Allergy Immunol. 15, 575-580 (2015).
- Zwolak, A., et al. Peripheral blood dendritic cells in alcoholic and autoimmune liver disorders. Hum Exp Toxicol. 31, 438-446 (2012).
- Agudelo, M., et al. Differential expression and functional role of cannabinoid genes in alcohol users. Drug Alcohol Depend. 133, 789-793 (2013).
- Nair, M. P., Figueroa, G., Casteleiro, G., Muñoz, K., Agudelo, M. Alcohol Versus Cannabinoids: A Review of Their Opposite Neuro-Immunomodulatory Effects and Future Therapeutic Potentials. J Alcohol Drug Depend. 3, 184 (2015).
- Boukli, N. M., et al. Implications of ER Stress, the Unfolded Protein Response, and Pro- and Anti-Apoptotic Protein Fingerprints in Human Monocyte-Derived Dendritic Cells Treated With Alcohol. Alcohol Clin Exp Res. 34, 2081-2088 (2010).
- Nair, M. N., Mahajan, S., Sykes, D., Bapardekar, M., Reynolds, J. Methamphetamine Modulates DC-SIGN Expression by Mature Dendritic Cells. J Neuroimmune Pharmacol. 1, 296-304 (2006).
- Napuri, J., et al. Cocaine Enhances HIV-1 Infectivity in Monocyte Derived Dendritic Cells by Suppressing microRNA-155. PLoS ONE. 8, e83682 (2013).
- Nair, M. P. N., Saiyed, Z. M. Effect of methamphetamine on expression of HIV coreceptors and CC-chemokines by dendritic cells. Life Sciences. 88, 987-994 (2011).
- Nair, M. P. N., et al. Cocaine Modulates Dendritic Cell-Specific C Type Intercellular Adhesion Molecule-3-Grabbing Nonintegrin Expression by Dendritic Cells in HIV-1 Patients. J Immunol. 174, 6617-6626 (2005).
- Reynolds, J. L., Mahajan, S. D., Sykes, D. E., Schwartz, S. A., Nair, M. P. N. Proteomic analyses of methamphetamine (METH)-induced differential protein expression by immature dendritic cells (IDC). Biochem Biophys Acta. 1774, 433-442 (2007).
- Van Voorhis, W., Hair, L., Steinman, R., Kaplan, G. Human dendritic cells. Enrichment and characterization from peripheral blood. J Exp Med. 155, 1172-1187 (1982).
- Davis, G. The Mac-1 and p150,95 beta 2 integrins bind denatured proteins to mediate leukocyte cell-substrate adhesion. Exp Cell Res. 200, 242-252 (1992).
- Delirezh, N., Shojaeefar, E. Phenotypic and functional comparison between flask adherent and magnetic activated cell sorted monocytes derived dendritic cells. Iran J Immunol. 9, 98-108 (2012).
- Lehner, M., Holter, W. Endotoxin-Free Purification of Monocytes for Dendritic Cell Generation via Discontinuous Density Gradient Centrifugation Based on Diluted Ficoll-Paque Plus®. Int Arch Allergy Immunol. 128, 73-76 (2002).
- Van Brussel, I., et al. Fluorescent activated cell sorting: An effective approach to study dendritic cell subsets in human atherosclerotic plaques. J. Immunol Methods. 417, 76-85 (2015).
- Mucci, I., et al. The methodological approach for the generation of humandendritic cells from monocytes affects the maturation state of the resultant dendritic cells. Biologicals. 37, 288-296 (2009).
- Yuan, N., et al. The American Association of Immunologists (AAI). , AAI. Miami Beach, FL. (2007).
- Romani, N., et al. Proliferating dendritic cell progenitors in human blood. J Exp Med. 180, 83-93 (1994).
- Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. J Leukoc Biol. 56, 236-240 (1994).
- Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A, 643-647 (2010).
- El-Sahrigy, S. A., Mohamed, N. A., Talkhan, H. A., Rahman, A. M. A. Comparison between magnetic activated cell sorted monocytes and monocyte adherence techniques for in vitro generation of immature dendritic cells: an Egyptian trial. Cent Eur J Immunol. 40, 18-24 (2015).
- Curry, C. V. Differential Blood Count. , http://emedicine.medscape.com/article/2085133-overview (2015).
- Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179, 1109-1118 (1994).
- Cavanagh, L. L., Saal, R. J., Grimmett, K. L., Thomas, R. Proliferation in Monocyte-Derived Dendritic Cell Cultures Is Caused by Progenitor Cells Capable of Myeloid Differentiation. Blood. 92, 1598-1607 (1998).
- Ardeshna, S. M., et al. Monocyte-derived dendritic cells do not proliferate and are not susceptible to retroviral transduction. Br J Haematol. 108, 817-824 (2000).
- Chapuis, F., et al. Differentiation of human dendritic cells from monocytes in vitro. Eur J Immunol. 27, 431-441 (1997).
- Zhou, L. J., Tedder, T. F. CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells. Proc Natl Acad Sci. 93, 2588-2592 (1996).
- Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180, 1841-1847 (1994).
- Caux, C., et al. Activation of human dendritic cells through CD40 cross-linking. J Exp Med. 180, 1263-1272 (1994).
- Fujii, S. i, Liu, K., Smith, C., Bonito, A. J., Steinman, R. M. The Linkage of Innate to Adaptive Immunity via Maturing Dendritic Cells In Vivo Requires CD40 Ligation in Addition to Antigen Presentation and CD80/86 Costimulation. J Exp Med. 199, 1607-1618 (2004).
- Mohammadi, A., Mehrzad, J., Mahmoudi, M., Schneider, M., Haghparast, A. Effect of culture and maturation on human monocyte-derived dendritic cell surface markers, necrosis and antigen binding. Biotech Histochem. 90, 445-452 (2015).
