Introduction
Dendritik hücreler (DC), doğal ve adaptif bağışıklık sistemlerinin temel aracılarıdır. Onlar primer immün yanıtları teşvik ve immünolojik hafıza gelişimini kolaylaştırmak için çalışır. Bu hücreler, antijen tutma, taşıma ve T hücre uyarılması için esas olarak sorumlu olan ve bu nedenle, DClerin .Manipulation farklı tedavi etmek için araştırma alanları çok çeşitli boyunca ve klinik ortamda yararlanılabilir 1 profesyonel antijen sunan hücreler (APC'ler) olarak adlandırılır HIV 6,7, kanser 8 gibi enflamatuvar hastalıklar, oto-bağışıklık hastalıkları 9 ve alerjik tepkiler 10. DH'ler ayrıca literatürde alkol bağımlılığı 11-14, ilaç bağımlılığı 13,15 ve HIV enfeksiyonu ve madde kötüye kullanımı, 16-19 kombinasyonu ile ilişkili bilinmeyen ve oluşum mekanizmaları çözmek için Madde Araştırma için kullanılmaktadır. Bu devam eden çalışmalar ve gelecekteki araştırma çalışmaları in immünoloji saha araştırması için son derece önemli DC'ler in vitro nesil olun. Toplam kan tek çekirdekli hücreleri 20% 1 - Bununla birlikte, bir 0,1 teşkil insan kanından DH'lerin izole edilmesine ile ilişkili çeşitli zorluklar bulunmaktadır.
Bugüne kadar, DH'lerin in vitro üretilmesi için iyi bilinen yöntemlerin bazıları, 22 ayırma manyetik aktif hücre, floresan aktive hücre sınıflandırma Monositler 21,22 plastik ya da cam yapışması, yoğunluk gradyanlı santrifüj 23, spesifik bir işaretleyici göre ayrılması oluşmaktadır 24, dekstran-kaplı manyetik nanopartiküller 25 ve tam otomatik negatif hücre seçimi 26 ile yüksek oranda saflaştırılmış monositlerin hızlı izolasyon kullanılarak CD14 + monositler pozitif seçim. Ancak, seçim en iyi yöntemi tartışmalıdır. Bu nedenle, DC oluşturma teknikleri geliştirmek için, çeşitli yöntemler hangi geliştirilmiştirBu hücrelerin saflığı önemli ölçüde, periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC), 27 ile izole edilmiş, saflaştırılmış CD34 + projenitör hücreleri ve monositler farklılaşmanın arttırılabilir. Önce belirtildiği gibi, monosit türevli dendritik hücreler (MDDCs) üretmek için yaygın olarak kullanılan bir ve popüler bir yöntem cam veya plastik (yapışma yöntemi) 21,22,27 uymaları monositlerin yeteneğini keşfetmek olduğunu. yapışma yöntemi, karmaşık ekipman kullanımının gerektirmeyen, hızlı ve basit bir yöntemdir. Ancak, bu sürecin bazı dezavantajları lenfosit kirlenme, düşük esneklik ve monosit geçici manipülasyon 28 arasındadır. Yapışma yönteme alternatif bir yöntem, özel olarak negatif seçim 26 tarafından PBMC'lerden monositleri izole etmek için tasarlanmış olan bir insan monosit zenginleştirme kiti kullanılarak toplam PBMC'lerden monositler manyetik izolasyondur. Bu işlem sırasında, istenmeyen hücrelere tetramerik ile çıkarılması için hedeflenirantikor komplekslerinden ayrılmakta ve dekstran-kaplı manyetik parçacıklar. Bu izolasyon yönteminin avantajı, istenmeyen etiketli hücreler hedef hücreler serbest sütun gerek olmadan yeni bir tüp içine boşaltılır edilebilir ise bir mıknatıs kullanılarak ayrıştırılmasıdır. Bugüne kadar, benzersiz bir hücre popülasyonu etiket spesifik monoklonal antikorların mevcudiyeti, manyetik ayırma tekniği ek bir yöntem, ancak immünoloji alanında az hücrelerin izolasyonu için bir zorunluluk değildir, sadece olmuştur. Örneğin, manyetik hücre gibi teknikler araştırma ve klinik uygulamaları 22,29 için yeni yaklaşımların gelişmesine olanak sağlamıştır piyasada mevcut paramanyetik MACS-nanopartiküller ile sıralama. Ayrıca, monosit bağlılık ve MACS teknoloji yöntemleri DC nesil karşılaştıran son araştırmalar monositler 22,30 ayrılmış MACS kullanarak daha yüksek bir DC saflık ve canlılığı ortaya koymuştur.
Bu çalışma sunarticari bir insan monosit zenginleştirme kiti kullanılarak yapışma 1), monosit izolasyonu ve 2), monosit izolasyon negatif seçim kriteri: PBMC'lerden izole monositlerde insan DH'lerinin üretimi için iki yöntem arasındaki karşılaştırması. Bu çalışma, yapışma yöntemiyle izole edilmiş monositler ile karşılaştırıldığında monositlerin izole etmek için negatif seçim manyetik ayırma işlemi monosit yaşam kabiliyetinde önemli bir farklılıklar ile monositlerin yüksek verim oluşturur dair kanıt sağlar. Buna karşılık, yedi gün sonra, manyetik ayırma ile izole monositler MDDC canlılığı etkilemeden anlamlı olarak daha yüksek çoğalma kapasitesi ve çift pozitif (CD11c + / CD14 +) fenotip sentezleyen hücrelerin yüksek miktarda MDDCs ayrışmıştır. aynı anda çoğalan ve CD11c ayırma yöntemi edebilen monositleri üretmek için her iki tekniğin becerisi gösterir çünkü genel olarak, bu çalışma + Yukarıda atıfta bulunulan önceki çalışmalardan farklıyaşama yetenekleri tehlikeye sokulmadan kültür içinde yedi gün sonra MDDCs (>% 70). Buna ek olarak, mevcut yaklaşım sitometri görüntüleme akışı ile farklı CD11c / CD14 MDDCs popülasyonlarının ilk kez karakterizasyonu sağlar.
DC'ler immünoloji alanında araştırma ile ilgili bir odak noktası rolü oynamaya beri elde edilir ve hangi yöntemleri in vitro onları izole ve kültür için nasıl kullanıldığını göz önüne alındığında Özetle, farklı parametreler dikkate alınmalıdır. Bu nedenle, bu çalışmada iki farklı monosit izolasyon yöntemleri ve nasıl bu yöntemler farklı olarak sonunda dendritik hücre canlılığı, proliferasyon ve fenotip etkileyen monosit canlılığını ve verimini etkileyen anlayışlar sağlamayı amaçlamaktadır. Bu bulgular immünoloji alanında büyük katkı sağlayacaktır ve DC izolasyonu, saflaştırılması ve karakterizasyonu ayrıntılı bir protokol sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Genel insan kanı çalışmaları gözden geçirmiş ve IRB protokol onay # IRB-13-0440 Mali İstihbarat Birimi Kurumsal İnceleme Kurulu (KİK) tarafından onaylanmıştır. İnsan leukopaklar Miami, FL topluluk kan bankasından satın alınmıştır.
Standart Yoğunluk Gradient Tekniği ile PBMC'ler 1. İzolasyonu
- T75 şişesi içinde 1x-fosfat tamponlu tuzlu su ile kanı 1 seyreltme: 1 gerçekleştirin.
- Pipet 15 ila 50 ml santrifüj tüpleri içine yoğunluk gradyan solüsyonu ve dikkatli bir şekilde katman - Bu gradyan seyreltilmiş kan (25 30 mL / tüp).
- 1 hızlanma ve 0 yavaşlama ile 1200 x g'de 20 dakika süreyle santrifüjlenir.
- Santrifüj işleminden sonra, yeni bir 50 ml'lik santrifüj tüpüne arabirim katmanı (beyaz kan hücreleri) toplamak ve PBS içinde iki kere (1.080 x g'de 3 dakika) ardından hücreler yıkanır. Her zaman süpernatant atın.
- Amonyum klorid, potasyum lize (ACK) tampon maddesi ile hücreleri tedavi (kırmızı kan hücreleri lize etmek için). tampon ve 10 ml4 ° C'de 15 dakika boyunca cubate.
- 1.080 x g'de 3 dakika boyunca, PBS ile iki kez santrifüj hücre yıkayın ve her bir zaman supernatant atın.
- PBMC'ler içerecek olan pelet kaydedin.
- tercih edilen monosit saflaştırma yöntemi ile devam edin.
Bağlılık Yöntemiyle 2. Monosit Arıtma
- L-glutamin (300 mg / ml) ihtiva eden tam bir hücre kültür ortamı hazırlayın penisilin (50 U / ml) -streptomycin (50 ug / ml) ve% 10 cenin sığır serumu ile takviye edilmiştir.
- PBMC'ler nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de ve% 5 CO2 seviyesinde tam ortam, 10 ml başına 5 x 10 7 hücre konsantrasyonunda T75 şişesi içinde kültürlenmesi ile yaklaşık 2 saat boyunca yapışmaya izin verin.
- İnkübasyondan sonra, kültür şişesi yapışmayan kayan hücreleri çıkarmak ve yavaşça PBS ile iki kez yapışmış olan hücrelerin yıkayın.
- insan granülosit-Makr 2 ul / ml ile desteklenmiş tam hücre kültür ortamı içinde yapışkan hücreleri inkübeophage koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) ve interlökin 4 (IL-4), 10 ug / ml'lik bir stok konsantrasyonu C'de saklandı.
- orta yarısı değiştirin ve sitokinler her 48 saat doldurmak.
- MDDCs monositlerin farklılaşması için 7 gün - 5 bekleyin.
Manyetik Ayırma Yöntemiyle 3. Monosit Arıtma
- 5 ml'lik bir polistiren tüp içine dökün ve hücre / ml'lik bir konsantrasyonda PBS tamponu içinde askıya tekrar standart yoğunluk gradyan tekniği PBMC'ler toplayın.
- 50 ul / ml hücreleri kullanılarak insan monosit zenginleştirme kokteyl ekleyin karıştırın ve 10 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- İnkübasyondan sonra, 50 ul / ml hücreleri kullanılarak manyetik parçacıkların ilave edilir, iyice karıştırın ve 5 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- PBS tampon çözeltisi ilave edilerek 2.5 ml'lik toplam hacme kadar hücre süspansiyonu getirmek aşağı 2 ve yukarı pipetlenerek iyice karıştırın - 3 kez.
- Manyetik cihazın içine bir kapak olmadan polistiren tüp yerleştirin ve 2 RT'de kenara.5 dakika.
- inkübasyondan sonra ve bir sürekli hareket halinde, mıknatıs pick up ve temiz bir 50 ml'lik santrifüj tüpüne istenen saflaştırılmış monosit fraksiyonu dökün.
- Tüm hücre kültürü insan granülosit-makrofaj koloni stimüle edici faktör (GM-CSF) 2 ul / ml ile takviye edilmiş ortam ve interlökin 4 yapışık hücreleri inkübe (IL-4), 10 ug / ml'lik bir stok konsantrasyonu C'de saklandı.
- Her 48 saat, orta yarısı değiştirin 5 dakika boyunca 1.080 xg'de aşağı spin ve yeni medya (cRPMI) ve sitokinler ile pelet yeniden askıya.
- MDDCs monositlerin farklılaşması için 7 gün - 5 bekleyin.
4. Tripan Mavi Dışlama Canlılık Testi
Not: PBMC, monositler ve MDDCs hücre verimini ve canlılığı elde etmek için bu yöntem kullanınız.
- Standart tripsin-EDTA kullanılarak ve matara ve PBS kullanarak hücre pelet yıkar gerçekleştirmek Hasat hücreleri. pelet boyutuna bağlı olarak, yenidenpelet çözmek için PBS 5 ila 10 ml askıya.
- Seyreltilmiş hücre peleti ile tripan mavisi reaktif 1 seyreltme: mikro-santrifüj tüpünde, 1 gerçekleştirin.
- Bu karışımı, bir hücre içine kısım 10 ul slayt sayarak ve üreticinin protokolüne uygun olarak, otomatik bir hücre sayacı sonuçları okuyun. otomatik bir hücre sayacı mevcut değilse, benzer hücre sayısı, bir hemasitometre veya manuel sayacı kullanılarak mümkündür.
5. MTT Testi
- Bir 96-çukurlu plaka içindeki her birine tam ortam 4 x 10 4/100 ul'lik bir konsantrasyonda plakası hücreleri. Hücreler kültüre uyum için 24 saat izin verin.
- Inkübe ve sırasıyla 0 (Yok gün 0), 36 (3 gün) ve 84 (gün 7) saatte okumaları gerçekleştirin.
- İstenilen kuluçka tamamlanmasından sonra, ortamını çıkarın ve tek başına 100 ul PBS ile değiştirin.
- Hazırlama 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) dimetilpropil 10 ml ekleyerek -2,5-difenil tetrazolyum bromür çözeltisi (MTT) (5 mg / ml)sodyum dodesil sülfat, 1 g (SDS) il sülfoksit (DMSO).
- Her bir oyuğa MTT çözeltisi 10 ul (5 mg / ml) ilave edin ve 2 saat daha 37 ° C'de inkübe edin.
- inkübasyondan sonra, PBS ve dönüştürülmemiş MTT karışımı (sarı renkli çözelti) ihtiva süpernatantlar kaldırmak.
- Her bir oyuğa, SDS-DMSO çözeltisi 100 ul ilave edin ve bir saat daha inkübe edilir.
- Bir mikrolevha okuyucu kullanılarak 540 nm'de absorbansı okumak.
6. Hücre Yüzey Görüntüleme Sitometrisi ile Boyama Analizi
- Saflaştınldı monositlerden farklılaşma 7 gün sonra, 1.5 ml tüpler uygun sayıya monosit türevli dendritik hücrelerin 1x10 6 Hücre numuneleri dağıtın.
- ısıyla inaktive 50 ul (HI), insan serumu kullanılarak bloke hücreler ile hücre yüzeye lekelemesi başlatın, 10 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- İnkübasyondan sonra, santrifüj hücreler 5 dakika için 720 x g hızında, süpernatant atılır.
- pelle hücret, ilgili florokrom-eşlenik antikorlar (örneğin, anti-CD11c, anti-CD14 ya da) ekleyin ve ışıktan koruyarak 20 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin. tazminat için gerekli beri ayrı tüplerde) tek florokrom lekeli örnekler / ml hazırlamak.
- İnkübasyondan sonra, 5 dakika boyunca 720 x g'de PBS tamponu ve santrifüj 1 ml her seferinde iki kez yıkama hücreleri.
- ışıktan korunan hücreleri tutulması, akış sitometri analizi için bir hücre / 100 ul bir konsantrasyonda PBS tamponu içinde yeniden askıya.
- canlı hücreler üzerinde kapısı için, önce, imalatçının talimatlarına uygun olarak alet sitometrisi tek hücre görüntüleme akış hücreleri elde etmek Her tüpe DAPI 1 ul ekle.
7. İstatistiksel Analiz
- Girdi bir e-tablodaki tüm verileri.
- Öğrencinin t-testi ve / veya tek yön uygun olarak ANOVA kullanarak sonuçları karşılaştırın.
- p ise <0.05 istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar göz önünde bulundurun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Manyetik Ayırma ile Monosit Verim bağlılık Yöntemi ile Monosit Verimi Higher karşılaştırıldığında edilir
PBMC'ler ve monositlerin ayrılması izolasyon gün tripan mavisiyle çıkarma metodu kullanılarak Şekil 1 ekran PBMC ve monosit hücre sayımı sunulan veriler. manyetik ayırma ile izole monositler PBMC kadar yüzde 25 paya sahip olması ortalama bağlılık yöntemi ile izole monositler toplam PBMC'ler yaklaşık yüzde 6.2 olarak gerçekleşmiştir. İstatistiksel analiz manyetik ayırma ile elde edilen monositler yüzdesi önemli ölçüde daha yüksek (≥ 4 kat) olduğu görülmüştür. Veri, en az üç bağımsız deneyin ortalama ± SD olarak ifade edilmiştir. Her iki yöntem (0.0005 ≤ p) karşılaştırırken monosit verimi önemli bir farklılık gösterdi -test öğrencinin t kullanarak İstatistiksel analiz.
1 "> Monosit İzolasyon bağlılık ile ve Manyetik Ayırma ile Monosit Canlılık etkiler Not:" keep-together.within-page = fo "_contentYukarıda tarif edilen iki farklı teknikler ile monosit izole edildikten sonra, canlılık tahlilleri kullanılan yöntem sitotoksik ve hücrelerin canlılığını etkileyen değildi sağlamak için yapıldı. Veri Şekil 2 ekranda iki yapışma yöntemiyle veya manyetik ayırma ile izole canlı monosit yüzde ortalama sundu. Canlı hücreler izolasyon gün tripan mavisiyle çıkarma metodu kullanılarak sayıldı. İki izolasyon yöntemleri arasındaki monositlerin karşılaştırılması yüzde canlılığı iki grup arasında istatistiksel olarak anlamlı fark olduğunu ortaya çıkardı. Ayrıca, bağlılık ile izole canlı monosit yüzde ortalama 1.66 ± 91.75% ve canlı monositler ortalama yüzde MAG ile izoleetik ayırma 2,75 ± 87.4% idi. Bu canlılığı veriler en az üç bağımsız deneyden değerlendirildi. Istatistiksel farkları, Öğrenci t-testi kullanılarak tespit edilmiştir.
Manyetik ayırma ile izole monositlerden türetilmiş hücreler Yapışma Yöntemi tarafından satın monositlerden türetilmiş hücreler ile karşılaştırıldığında hücre proliferasyonunda önemli bir artış olduğunu göstermektedir
MTT hücre çoğalmasını ölçmek için bir kolorimetrik test olarak kullanılmıştır. canlı hücreler olarak, MTT san bir tetrazol rengi kolay bir spektrofotometre kullanılarak ölçülür mor formazan'a, indirgenir. 0.22 ± 0.02 vs manyetik yöntemi: 0.38 ± 0, Şekil 3'te sunulan veriler, 0. günde absorbanstaki artış (yapışma yöntemiyle ölçülen monosit tecrit her iki süreç 7 günlük bir süre boyunca yüksek bir hücre çoğalmasına neden olduğunu göstermektedir.02), Gün 3 (yapışma yöntemi: ± 0.02 0.28, manyetik yöntem: 0.55 ± 0.05) ve gün 7 (yapışma yöntemi: 0.36 ± 0.01, manyetik = 0.66 ± 0.006). Bununla birlikte, XTT deneyi farklı olarak (veriler gösterilmemiştir), MTT deneyi 0. günde (p = 0.003), 3. günde yapışma yöntemiyle elde edilen monositlerden MDDCs göre manyetik ayırma ile izole edilmiş monositlerden MDDCs hücre proliferasyonunda önemli bir artış olduğunu göstermiştir (p = 0.006), ve gün 7 (p = 0.002). Hücre çoğalması da gün 0 ve 3 (p = 0.003) arasında anlamlı bir farklılık olduğu tespit ve günler 0 ve monositlerin gelen MDDCs grubu içindeki 7 (p <0.001) arasındaki manyetik ayırma yoluyla arıtıldı. Bundan başka, (= 0.008 M) yapışma ile arıtılmış, monositlerden 0. günde ve MDDCs gün 7 arasında hücre proliferasyonunda önemli bir fark gözlenmiştir. MTT deneyi, üç farklı deneylerden elde edilen MDDCs kullanılarak gerçekleştirilmiştir. İstatistiksel anlamlılık w ≤ 0.05 ANOVA ve öğrencinin t-testi, p kullanılarak belirlendianlamlı kabul olarak istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur sürece, ve p değerleri grafikte belirtilmiştir.
CD11c ve CD14 hücre yüzeyi boyama ile MDDCs karakterizasyonu
IL-4 ve GM-CSF ile yedi gün monositler kültürlendikten sonra MDDCs yapışma ve manyetik izolasyon yöntemlerle izole monositlerden elde edilen, Şekil 4'te karakterize edilmiştir. Karakterizasyonu her iki yöntemde de, düşük bir CD14 + / CD11c- fenotip veya tamamen monositik nüfusu ortaya çıkardı 0.0 ve yüksek toplam CD11c'nin + fenotip, bağlılık =% 72 ± 1 = manyetik karşı% 1.0 ± bağlılık =% 1 ± 19. Bununla birlikte, toplam CD14 + popülasyonu ayrıca analiz edildiğinde, yüksek verim vardı =% 79 manyetik karşı ± 11 CD11c ve pozitif çift CD14 daha yüksek sayıda veren manyetik ayırma ile her iki yöntemde de CD11c ve CD14 için çift pozitif hücrelerNüfus yapışma yöntemine göre, uyum =% 49, manyetik karşı ± 7 =% 73 ±, MDDCs manyetik ayırma, pozitif CD11c ve CD14 negatif popülasyonu ile çift pozitif fenotipe sahip MDDCs daha yüksek bir ürün elde yüksek oldu 15. Her ne yapışma yöntemi; Şekil 4B'de ± 7. her işaretleyicinin ortalama florasan yoğunluğu (MFI) kapı popülasyonda bakıp CD14 + popülasyonda CD14 yüksek yoğunluk gösterdi =% 6, manyetik karşı ± 7 yapışma =% 23, iki eşdeğer yoğunluklu çift pozitif nüfus ve CD11c + ve CD14- popülasyonunda yüksek CD11c yoğunluğu CD11c ve CD14. Özetle, manyetik izolasyon henüz monositik işaretleyici (CD14) düştü değil erken evre farklılaşmış MDDCs olabilir CD11c + / CD14 + hücreler daha yüksek bir yüzdesi verir olsa bile, bağlılık yöntemi + / CD14-, CD11c'nin yüksek oranda verir MDDC nüfus farklılaşmış bir geç evre olabilir. addit içindeiyon, DAPI boyama canlılığı sonuçlarını onaylamak ve karakterizasyonu canlı MDDCs gerçekleştirildi sağlamak için yapıldı. DAPI negatif / canlı hücrelerin yüzde (bağlılık = 67 ± 1 = manyetik karşı 76 ± 7) değil kültürde yedi gün sonra MDDCs canlılığını etkilemez her iki yöntem teyit iki yöntem arasında anlamlı bir farklılık vardır.
Manyetik ayırma ile Şekil 1. Monosit Verim Yapışma Metot Monosit vermek üzere yüksek karşılaştırılır. Monositlerin yaklaşık% 6.2 ~ monositlerin% 25 manyetik ayırma yöntemiyle elde ise yapışma yöntemiyle PBMC'lerden izole edilmiştir. Veri, en az üç bağımsız deneyin ortalama ± SD olarak ifade edilmiştir. Her iki yöntemi karşılaştırırken İstatistiksel analiz kullanılarak öğrencinin t-testi monosit verimi önemli bir farklılık gösterdi(p = 0. 00005). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Monosit İzolasyon bağlılık ile ve Manyetik Ayırma ile Şekil 2. Monosit Canlılık etkiler Not. Bağlılık ile izole canlı monosit yüzde ortalama 1.66 ± 91.75% ve manyetik ayırma ile izole canlı monosit yüzde ortalama 87.4 ±% 2.75. Veri, en az üç bağımsız deneyin yaşayan hücrelerin ortalama ± SD yüzdesi olarak ifade edilmiştir. Her iki arıtma yöntemleri karşılaştırırken anlamlı fark hücre canlılığı gözlendi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Manyetik ayırma ile izole monositlerden türetilmiş Şekil 3. Hücre Yapışma Metot Monositler Edilen türetilen hücreler ile karşılaştırıldığında hücre proliferasyonunda önemli bir artış göstermektedir. Absorbans önemli bir artış hem de gün 3 ve gün 7, her iki yöntem için gözlendi değerleri karşılaştırırken her iki yöntem (p ≤ 0.05) karşılaştırırken ek olarak 0. günde onun kendi kontrolleri karşı, ANOVA ve öğrencinin t-testi de MTT alımı absorbans önemli bir farklılık gösterdi. Veriler, üç bağımsız deneyin ortalama ± SD olarak ifade edilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
96 / 54296fig4.jpg "/>
Farklı popülasyonları (tek hücre dışına kapılı%) temsil eden CD11c ve CD14 Hücre Yüzey Boyama. A) Bar grafiğinin tarafından MDDCs Şekil 4. Karakterizasyonu. İlk olarak, DAPI- (canlı) hücreleri toplam tek hücrelerden geçitlendi. Sonra, CD14 + / CD11c-, CD11c +, CD11c + / CD14 + ve CD11c + / CD14- DAPI- (canlı) nüfus Geçitli bulundu. CD11c + popülasyonu etiketli iki bölge CD11c + / CD14 + ve CD11c + / CD14- b.) Hücrenin her alt popülasyonun. C) hücre Örnek dağılı noktalan CD11c ve CD14 hem de ortalama floresan yoğunluğu (MFI) değerleri gösteren Örnek grafikler toplamıdır manyetik ve bağlılık yöntemleri hem DAPI negatif (canlı) hücre popülasyonu üzerinde kapı CD11c-APC ve CD14-APCcy7 ile. Geçitli hücrelerin her bir alt-nüfusa ait (dağılım araziler mavi seçili) tek hücrelerin Temsilcisi resim galerisi, CD11c + / CD14- (turuncu kapılı), CD11c + / CD14 + (kırmızı) ve CD14 + () mor kapılı. tek hücre görüntü galerisinde, kırmızı renk CD11c APC ile etiketlenmiş ve sarı renk APCcy7 ile etiketlenmiş CD14 temsil eder. Dağılım parsellerde, nüfusları kapısına seçilen renkler rasgele ve gerçek hücre görüntüleri ilişkili değildir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
izole edilmesi ve insan kanından MDDCs üretilmesi bilinen zorlukların göre, bu çalışmada MDDCs üretilmesi için iki köklü yöntemlerin bir karşılaştırma sağlamak için amaçlanmıştır. Kıyasla ilk yöntem, cam veya plastik (yapışma yöntemi) 21,22,27 uymaları monositlerin yeteneği yararlanarak MDDCs üretilmesi için iyi bilinen bir geleneksel bir yöntemdir. yapışma kullanım olup, etkili, hızlı ve düşük maliyetli ve karmaşık ekipman kullanımını gerektirmez. Ancak, bu sürecin bazı dezavantajları lenfosit kirlenme, düşük esneklik, monosit geçici manipülasyon 22,30,31 içerir. Kıyasla ikinci alternatif yöntem negatif seçimle PBMC'lerden monositleri izole etmek için tasarlanmış olan bir insan monosit zenginleştirme kiti 26 ile toplam periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC), monosit manyetik izolasyondur. Bu izolasyon yönteminin avantajı, istenmeyen hücreleretiketli hedef hücreler, serbest sütun doğrudan antikorlar ile hücreleri hedef olmayan gerek olmadan yeni bir tüp içine dökülür iken, bir mıknatıs kullanılarak ayrılır. Ne olursa olsun monosit izolasyon yönteminin (manyetik ayırma vs yapışık), her iki işlemlerden sonra, protokol çerçevesinde kritik adımlardan biri granülosit makrofaj-koloni uyarıcı faktör ile monositlerin in vitro uyarılması (GM-CSF) ve interlökin-4 ( MDDCs üretmek için gerekli olan, IL-4). Bu antijen yakalama ve olgunlaşmamış MDDCs 32 işleme kapasitesi özelliğine ödün vermeden tek çekirdekli kan hücrelerinden MDDCs oluşturmak için yaygın ve iyi kurulmuş bir protokoldür. Yaygın DC'lerin in vitro üretimi için kullanılan tekniklerin önemli sınırlamalar biri monositler gibi öncül hücrelerin düşük verim. Yukarıda belirtildiği gibi, bağlılık yöntemi ile izole monositler toplam P yaklaşık 6,2 payaBMCs iken manyetik ayırma ile izole edilmiş monositler PBMC'lerin 25'e kadar 'ini oluşturur. Toplam kan mononükleer hücreleri 20% 1 - DC'ler sadece 0.1 teşkil ederken% 10 31 - literatüre göre, 2 ila monositler normal yetişkinlerde farklı beyaz kan hücresi sayımı için değişmektedir. Bu nedenle, manyetik izolasyon sonra elde edilen monositlerin yüksek verim (~% 25) hücre popülasyonu ve istenmeyen hücrelere antikor bağlanması ve / veya manyetik parçacık eksikliği kirlilik nedeniyle olabilir.
İzole monositler yüksek verim ve saflık elde etmek için, protokol tüm kritik adımlar dikkatle takip edilmelidir. Standart yoğunluk gradyan santrifüj ile kandan PBMC izolasyonu sırasında, birkaç kritik adım vardır. Birincisi, pipetleme ve dikkatle 50 ml santrifüj tüplerine yoğunluk gradyan çözümü üzerinde kan katman bu çözeltinin ve kanın karışmasını neden olabilir sert pipetleme beri pratik gerektirir bir adımdır,bu izole etmek zordur zayıf PBMC tabakası yol açabilir, ya da PBMC ile kırmızı kan hücreleri tam karışımı ile sonuçlanabilir. Bu adımda, kan iyi tanımlanmış bir tabaka ve bir tat PBMC tabakası için pipetleme sürekli ve nispeten yavaş bir akış sağlamak için önemlidir. İkincisi, hızlanma ve yavaşlama 1 0 ile sonraki adımda santrifüj çok kritik. Bu ayarlar, ilk santrifüj adımı için kullanılmaz, bu hatalı yoğunluk gradyan çözeltisi ile kan karıştırılması neden olur ve kan bileşenlerinin geri kalanından PBMC'ler ayrı değil. Kırmızı kan hücreleri ile birlikte uygulanabilir PBMC'lerin azalmasına yol açabilir ACK ile daha uzun inkubasyon yana - (15 dakika 10) Üçüncü olarak, optimize edilmiş bir süreden daha uzun olmayan bir süre tampon yokedici Amonyum Klorür-Potasyum (ACK) PBMC'lerin inkübe önemlidir . Buna ek olarak, ACK inkübasyondan sonra PBS yıkama yapılması da önemlidir. Bununla birlikte, kırmızı kan hücreleri ile ilk lize değilseACK adım ve onlar hala yıkamadan sonra görünmeye devam, ACK lizizi bir tur şiddetle tavsiye edilir.
beyaz kan hücrelerinin izole edildikten sonra, monositler oluşturmak için bağlılık yöntemi yaparken akılda tutulması gereken birkaç kritik adımlar vardır. İlk olarak, PBMC inkübasyon iki saat sonra yüzen lenfositler yıkandıktan kayan lenfositlerin varlığı az monositler bağlı neden olabilir ve aynı zamanda daha düşük MDDC saflık neden olabilir çünkü çok önemlidir. Bu yıkama aşaması, kritik aşırı ve sert yıkama olmasına rağmen (diğer tavsiye edilenden daha yani, iki kez) daha düşük monosit verimle sonuçlanan çok yapışık monositler yıkamaktan neden olabilir. sitokinler MDDCs monositlerin farklılaşma sorumludur, ve bu ikinci, tam bir ortamda ve sitokinler ile birlikte inkübe önemlidir. Ek olarak, medyayı değiştirme ve sitokinler her 48 saat ikmal hücrelerin farklılaşması ve yaşaması için önemlidir. ortam değişimi sırasında, yüzen MDDCs kaydetmek ve farklılaşma sürecinde yüzeyinden ayırmak bazı MDDCs olmadığından taze ortam ve sitokinler ile birlikte kültüre geri dönmek için de çok önemlidir. monositler, tavsiye edilen konsantrasyon numaralı seribaşı ekli ve büyümek için onlar hücreler arası teması gerektiğinden yakından aralıklı olması, aynı zamanda önemli bir emin olmak için. monositleri oluşturmak için manyetik ayırma yöntemi gerçekleştirirken, iyi bir verim ve monositlerin yüksek saflıkta elde etmek için birkaç kritik adımlar vardır. İlk olarak, üretici tarafından tavsiye edilen hücre konsantrasyonu elde etmek için kritiktir. Mıknatıs yerleştirilen zaman daha az verim ve daha az saflıkta neden olabileceğinden, polistiren tüpü rahatsız etmek de önemlidir. Yukarıda açıklandığı gibi, bu teknik, diğer c varlığına bağlı olabilir yapışma yöntemi ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha yüksek bir monosit verimle (Şekil 1), yol açararşın. Hücreler akış sitometrisi ile karakterize edilmiştir Dahası, manyetik bir yöntem nedeniyle MDDC farklı aşamalarında varlığı diğer hücrelerinin varlığı ile ilişkili ya da, aynı zamanda olabilir çift pozitif hücrelerin (CD11c + / CD14 +) daha yüksek bir yüzdesi, göstermektedir farklılaşma.
Bağımsız olarak verim ve saflıkta in vitro MDDC kuşağın bir başka önemli yönü, canlı ve çoğalma MDDCs üretme yeteneğidir. Bu çalışma, kültür içinde yedi gün boyunca, hücre metabolik aktivite artışı ile gösterildiği gibi, her iki saflaştırma yöntemleri MDDCs (Şekil 3) proliferasyonunu olduğunu göstermek için bir kanıt sağlar. Buna ek olarak, manyetik ayırma ile arıtılmış, monositlerden MDDCs üretimi çoğalmasının daha yüksek oranda yapışma (Şekil 3) ile saf hale monositlerden elde MDDCs karşılaştırmak göstermiştir. Bu bulgular g gösteren literatür ile uyumludurCD34 + hücrelerinden DC'lerin eneration bağlı insan kanı 27, 33 proliferatif DC progenitörlerin varlığına proliferatif bir işlemdir. Ancak, monositler de çoğalması 34,35 herhangi bir kanıt olmadan DH'lere ayırt olabileceğini göstererek tartışmalı bulgular vardır. Orada DC'lerin in vitro nesil hakkında pek çok ihtilaf ve DH'ler çoğalan öncüleri veya monosit farklılaşma elde edilip edilmediği konusunda o işaret alakalı. Örneğin, yapışkan periferal kan hücrelerinden DC in vitro üretimi da GM-CSF 27 maruz kaldıktan sonra proliferasyon kabiliyeti olan ve DH'lerin verimi mevcudiyetinde türetilmiş olduğunu gösteren kanıtlar da vardır progenitör hücrelerin zenginleştirilmesi gösterilmiştir GM-CSF ve IL-4 monositler 33 başlangıç sayısının ötesinde genişletilmiş edilemez. Genel olarak, bu çalışma bir mon çoğalmasında artış gösteriyoryedi gün>% 70 CD11c + fenotip ile toplam MDDCs nüfus neden kültürde ocytic hücreleri (yapışma = 19 ± =% 79, manyetik karşı% 72 ± 11). Daha yüksek bir çift pozitif fenotip (aderans =% 49 ile daha fazla fenotipik analizi uygulandığında önemli olmasa da, manyetik ayırma yöntemiyle izole edilmiş monositlerin MDDCs sonuçlanan manyetik = 73 karşı% ± 7 CD11c + / CD14 + işaret alakalı ± 15 CD11c + / CD14 +) yapışma ile izole monositler daha yüksek bir tek pozitif fenotip (bağlılık =% 23% 6 = manyetik ± 7 CD11c + / CD14-) karşı ± 7 CD11c + / CD14- ile MDDCs sonuçlanmıştır. daha yüksek bir tek pozitif fenotipe sahip MDDCs farklılaşma geç aşamalarında altında olabilirken daha yüksek bir çift pozitif fenotip (CD11c + / CD14 +) olan MDDCs farklılaşma erken dönemlerinde altında olabilir.
Özetle, bu çalışmada negatif seçim manyetik ayırma prosedüründe olduğu destekleyecek kanıt sağlaryapışma yöntemi ile izole edilmiş monositler ile karşılaştırıldığında monositlerin izole e monosit yaşam kabiliyetinde önemli bir farklılıklar ile monositlerin yüksek verim oluşturur. Buna karşılık, yedi gün sonra, manyetik ayırma ile izole monositler MDDC canlılığı etkilemeden anlamlı olarak daha yüksek çoğalma kapasitesi ve çift pozitif (CD11c + / CD14 +) fenotip sentezleyen hücrelerin yüksek miktarda MDDCs ayrışmıştır. Her iki yöntemi karşılaştırıldığında, bulgular aynı anda her iki yöntem>% 70 CD11c + MDDCs vermiştir beri kültüründe yedi gün sonra CD11c + MDDCs içine (Şekil 4) (Şekil 3) çoğalan ve ayırt edebilen monositler oluşturmak için her iki tekniğin yeteneğini göstermiştir . Ancak, olgunlaşma belirteçleri bakarak daha fazla analiz tamamen işlevsel MDDC nüfusu karakterize etmek yararlı olabilir. Sonuç olarak, her iki yöntem de CD11c + MDDCs ve İl izolasyonu için avantajlı alternatiflerdiraraştırma uygulamaları için yeterli bir verim ide ve hatta gelecekteki klinik uygulamalarda yararlı olabilir. laboratuar şu anda MDDC fenotip ve işlevini değiştirmek için bu maddelerin özellikle yeteneği, alkol kötüye kullanımı ve doğuştan gelen bağışıklık sistemi üzerinde kötüye diğer maddelerin etkilerini incelemek amacıyla MDDCs nesil üzerinde duruluyor. Bu nedenle, mevcut çalışma MDDC karakterizasyonu bir temel sağlamak ve madde kötüye kullanımı bağlamında monosit türevli dendritik hücre fonksiyonunu aracılık moleküler mekanizmaları aydınlatmak için daha fazla deney devam yeteneğini artıracaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-5442-03 | Must be used at RT |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Life Technologies | 10010-023 | |
| ACK Lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 22400-089 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Life Technologies | 15240-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| RoboSep buffer | StemCell | 20104 | |
| EasySep Human monocyte enrichment kit | StemCell | 19059 | |
| TC20 Automated cell counter | Bio-Rad | 145-0101 | |
| FITC-Dextran | Sigma Aldrich | FD4-100MG | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | |
| Synergy 2 multi-mode reader | Biotek | 7131000 | |
| XTT Sodium salt bioreagent (XTT) | Sigma Aldrich | X4626-100MG | |
| Dimethyl sulfoxide bioreagent (DMS) | Sigma Aldrich | D8418-500ML | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT) | Sigma Aldrich | m5655-500MG | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Bio-Rad | 161-0302 | |
| Phenazine Methosulfate (DMSO) | Sigma Aldrich | P9626-1G | |
| Inactivated (HI) Human Serum | Chemicon | S1-100ML | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | BD Accuri | 653119 | |
| FlowSight Amnis Flow Cytometer | EMD Millipore | 100300 |
References
- Cella, M., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Origin maturation and antigen presenting function of dendritic cells. Curr Opin Imunol. 9, 10-16 (1997).
- Banchereau, J., et al.
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Kaouther, M., Ridha, O.
- Steinman, R., Gutchinov, B., Witmer, M., Nussenzweig, M. Dendritic cells are the principal stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice. J Exp Med. 157, 613-627 (1983).
- Nair, M. N., et al. RNAi-directed inhibition of DC-SIGN by dendritic cells: Prospects for HIV-1 therapy. AAPS J. 7, E572-E578 (2005).
- Agudelo, M., et al. Chapter 10. Dendritic Cells: Types, Life Cycles and Biological Functions. , Nova Publishers. 167-177 (2010).
- Kajihara, M., Takakura, K., Ohkusa, T., Koido, S. The impact of dendritic cell-tumor fusion cells on cancer vaccines - past progress and future strategies. Immunotherapy. , (2015).
- Suwandi, J., Toes, R., Nikolic, T., Roep, B. Inducing tissue specific tolerance in autoimmune disease with tolerogenic dendritic cells. Clin Exp Rheumatol. 33, 0097-0103 (2015).
- Gorelik, M., Frischmeyer-Guerrerio, P. A. Innate and adaptive dendritic cell responses to immunotherapy. Curr Opin Allergy Immunol. 15, 575-580 (2015).
- Zwolak, A., et al. Peripheral blood dendritic cells in alcoholic and autoimmune liver disorders. Hum Exp Toxicol. 31, 438-446 (2012).
- Agudelo, M., et al. Differential expression and functional role of cannabinoid genes in alcohol users. Drug Alcohol Depend. 133, 789-793 (2013).
- Nair, M. P., Figueroa, G., Casteleiro, G., Muñoz, K., Agudelo, M. Alcohol Versus Cannabinoids: A Review of Their Opposite Neuro-Immunomodulatory Effects and Future Therapeutic Potentials. J Alcohol Drug Depend. 3, 184 (2015).
- Boukli, N. M., et al. Implications of ER Stress, the Unfolded Protein Response, and Pro- and Anti-Apoptotic Protein Fingerprints in Human Monocyte-Derived Dendritic Cells Treated With Alcohol. Alcohol Clin Exp Res. 34, 2081-2088 (2010).
- Nair, M. N., Mahajan, S., Sykes, D., Bapardekar, M., Reynolds, J. Methamphetamine Modulates DC-SIGN Expression by Mature Dendritic Cells. J Neuroimmune Pharmacol. 1, 296-304 (2006).
- Napuri, J., et al. Cocaine Enhances HIV-1 Infectivity in Monocyte Derived Dendritic Cells by Suppressing microRNA-155. PLoS ONE. 8, e83682 (2013).
- Nair, M. P. N., Saiyed, Z. M. Effect of methamphetamine on expression of HIV coreceptors and CC-chemokines by dendritic cells. Life Sciences. 88, 987-994 (2011).
- Nair, M. P. N., et al. Cocaine Modulates Dendritic Cell-Specific C Type Intercellular Adhesion Molecule-3-Grabbing Nonintegrin Expression by Dendritic Cells in HIV-1 Patients. J Immunol. 174, 6617-6626 (2005).
- Reynolds, J. L., Mahajan, S. D., Sykes, D. E., Schwartz, S. A., Nair, M. P. N. Proteomic analyses of methamphetamine (METH)-induced differential protein expression by immature dendritic cells (IDC). Biochem Biophys Acta. 1774, 433-442 (2007).
- Van Voorhis, W., Hair, L., Steinman, R., Kaplan, G. Human dendritic cells. Enrichment and characterization from peripheral blood. J Exp Med. 155, 1172-1187 (1982).
- Davis, G. The Mac-1 and p150,95 beta 2 integrins bind denatured proteins to mediate leukocyte cell-substrate adhesion. Exp Cell Res. 200, 242-252 (1992).
- Delirezh, N., Shojaeefar, E. Phenotypic and functional comparison between flask adherent and magnetic activated cell sorted monocytes derived dendritic cells. Iran J Immunol. 9, 98-108 (2012).
- Lehner, M., Holter, W. Endotoxin-Free Purification of Monocytes for Dendritic Cell Generation via Discontinuous Density Gradient Centrifugation Based on Diluted Ficoll-Paque Plus®. Int Arch Allergy Immunol. 128, 73-76 (2002).
- Van Brussel, I., et al. Fluorescent activated cell sorting: An effective approach to study dendritic cell subsets in human atherosclerotic plaques. J. Immunol Methods. 417, 76-85 (2015).
- Mucci, I., et al. The methodological approach for the generation of humandendritic cells from monocytes affects the maturation state of the resultant dendritic cells. Biologicals. 37, 288-296 (2009).
- Yuan, N., et al. The American Association of Immunologists (AAI). , AAI. Miami Beach, FL. (2007).
- Romani, N., et al. Proliferating dendritic cell progenitors in human blood. J Exp Med. 180, 83-93 (1994).
- Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. J Leukoc Biol. 56, 236-240 (1994).
- Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A, 643-647 (2010).
- El-Sahrigy, S. A., Mohamed, N. A., Talkhan, H. A., Rahman, A. M. A. Comparison between magnetic activated cell sorted monocytes and monocyte adherence techniques for in vitro generation of immature dendritic cells: an Egyptian trial. Cent Eur J Immunol. 40, 18-24 (2015).
- Curry, C. V. Differential Blood Count. , http://emedicine.medscape.com/article/2085133-overview (2015).
- Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179, 1109-1118 (1994).
- Cavanagh, L. L., Saal, R. J., Grimmett, K. L., Thomas, R. Proliferation in Monocyte-Derived Dendritic Cell Cultures Is Caused by Progenitor Cells Capable of Myeloid Differentiation. Blood. 92, 1598-1607 (1998).
- Ardeshna, S. M., et al. Monocyte-derived dendritic cells do not proliferate and are not susceptible to retroviral transduction. Br J Haematol. 108, 817-824 (2000).
- Chapuis, F., et al. Differentiation of human dendritic cells from monocytes in vitro. Eur J Immunol. 27, 431-441 (1997).
- Zhou, L. J., Tedder, T. F. CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells. Proc Natl Acad Sci. 93, 2588-2592 (1996).
- Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180, 1841-1847 (1994).
- Caux, C., et al. Activation of human dendritic cells through CD40 cross-linking. J Exp Med. 180, 1263-1272 (1994).
- Fujii, S. i, Liu, K., Smith, C., Bonito, A. J., Steinman, R. M. The Linkage of Innate to Adaptive Immunity via Maturing Dendritic Cells In Vivo Requires CD40 Ligation in Addition to Antigen Presentation and CD80/86 Costimulation. J Exp Med. 199, 1607-1618 (2004).
- Mohammadi, A., Mehrzad, J., Mahmoudi, M., Schneider, M., Haghparast, A. Effect of culture and maturation on human monocyte-derived dendritic cell surface markers, necrosis and antigen binding. Biotech Histochem. 90, 445-452 (2015).
