Introduction
תאים דנדריטים (DCS) הם מתווכים חיוניים של מערכות החיסון המולדת ובעלי כושר הסתגלות. הן מתפקדות לגרום תגובה חיסונית ראשונית להקל על הפיתוח של זיכרון אימונולוגי. תאים אלה אחראים בעיקר עבור לכידת אנטיגן, הגירת גירוי תא T ולכן מכונים תאי מציגי אנטיגן מקצועיים כמו (נגמ"שים) 1 .Manipulation של DCs יכול להיות מנוצל על פני מגוון רחב של תחומי מחקר במסגרת הקלינית לטיפול שונה מחלות דלקתיות כגון HIV 6,7, סרטן 8, מחלות אוטואימוניות 9, ותגובות אלרגיות 10. DCs גם בשימוש למחקר התמכרות לסמים ואלכוהול על מנת לפתור מנגנונים לא ידועים מסלולים כגון אלה הקשורים בתלות באלכוהול 11-14, תלות בסמים 13,15, והשילוב של הידבקות ב- HIV ו חומר התעללות 16-19. מחקרים מתמשכים אלה ומחקרים בעתיד אניn בתחום האימונולוגיה לעשות בדור חוץ גופית של DCs חשוב מאוד למחקר. עם זאת, ישנם מספר קשיים הקשורים לבודד DCs מדם האדם כפי שהם רק מהווים 0.1 - 1% של תאים mononuclear הדם הכולל 20.
עד כה, חלק מהשיטות והמבוססות עבור הדור של DCs במבחנה מורכב דבקות פלסטיק או זכוכית של מונוציטים 21,22, צנטריפוגה שיפוע צפיפות 23, פרדה על בסיס סמן ספציפי כגון תא מגנטי מיון מופעל 22, תא מופעל פלורסנט מיון 24, סלקציה חיובית של מונוציטים CD14 + באמצעות חלקיקים מגנטיים צופה dextran 25, ובידוד מהיר של מונוציטים נקיים במיוחד באמצעות בחירת תא שלילית אוטומטית לחלוטין 26. עם זאת, השיטה הטובה ביותר של בחירה שנויה במחלוקת. לכן, כדי לשפר את טכניקות דור DC, מספר שיטות פותחו בהטוהר של תאים אלה יכולים להיות גדל מאוד על ידי בידול מתאי CD34 + אבי מטוהרים מונוציטים מבודדים מתאי דם היקפיים mononuclear (PBMCs) 27. כאמור לפני, שיטה המשמשת והפופולרי נרחב ליצירת תאים דנדריטים נגזר מונוציטים (MDDCs) היא לחקור את היכולת של מונוציטים לדבוק זכוכית או פלסטיק (שיטת הדבקות) 21,22,27. השיטה הדבקה היא שיטה מהירה וישירה שאינו דורשת שימוש בציוד מורכב. עם זאת, כמה חסרונות של התהליך הזה כוללים זיהום לימפוציטים, גמישות נמוכה, ומניפולציה חולפת מונוציטים 28. שיטה חלופית לשיטת הדבקות היא הבידוד המגנטי של מונוציטים מ PBMCs הכולל, במיוחד עם השימוש של ערכת העשרה מונוציטים אדם, אשר נועדה לבודד מונוציטים מ PBMCs ידי סלקציה שלילית 26. במהלך הליך זה, תאים לא רצויים ממוקדים להסרה עם tetramericמתחמי נוגדן וחלקיקים מגנטיים מצופה dextran. יתרונה של שיטת הבידוד הזה הוא כי התאים שכותרתו הרצויים מופרדים באמצעות מגנט בעוד תאי יעד יכולים להיות ניגרו בחופשיות לתוך צינור חדש ללא צורך עמודות. עד כה, עם הזמינות של נוגדנים ספציפיים monoclonal שיכול לתייג אוכלוסיות תאים ייחודיות, טכניקת הפרדה המגנטית הפכה לא פשוט שיטה נוספת, אלא הכרח עבור הבידוד של תאים נדירים בתחום האימונולוגיה. למשל, טכניקות כגון תא מגנטי מיון עם-חלקיקים MACS פאראמגנטיים זמינים מסחרית הקלו בפיתוח גישות חדשות למחקר ויישומים קליניים 22,29. יתר על כן, מחקרים מהזמן האחרון המשווה בין הדור DC משיטות הטכנולוגיה דבקות מונוציטים ו MACS הוכיחו טוהר DC גבוה ואת הכדאיות באמצעות MACS מופרדים מונוציטים 22,30.
מתנות המחקר הנוכחיותהשוואה בין שתי שיטות לייצור DCs האנושי מונוציטים מבודדים PBMCs: 1) בידוד מונוציטים ידי היצמדות 2) בידוד מונוציטים ידי סלקציה שלילית באמצעות ערכת העשרה מונוציטים אדם מסחרית. מחקר זה מספק ראיות כדי להראות כי נוהל הפרדה המגנט סלקציה השלילית לבודד מונוציטים מייצר את התשואה הגבוהה ביותר של מונוציטים ללא הבדלים משמעותיים כדאי מונוציטים בהשוואת מונוציטים המבודדים בשיטת דבקות. בתורו, לאחר שבעה ימים, מונוציטים מבודדים על-ידי פרדה מגנטית מובחנים לתוך MDDCs עם יכולת שגשוג ואת סכום גבוה יותר באופן משמעותי גבוהים יותר של תאי מבטאים חיוביים כפול (CD11c + / CD14 +) פנוטיפ מבלי להשפיע כדאיות MDDC. בסה"כ, המחקר הנוכחי שונה מחקרים קודמים אשר בסימוכין שכן הוא מדגים את היכולת של שתי הטכניקות בו זמנית לייצר מונוציטים המסוגלים מתרבים ומבדל לתוך CD11c +MDDCs (> 70%) לאחר שבעה ימים בתרבות מבלי להתפשר הכדאיות שלהם. בנוסף, הגישה הנוכחית מספקת לאפיון לראשונה של אוכלוסיות שונות CD11c / CD14 MDDCs ידי זרימת הדמיה cytometry.
לסיכום, מאז DCs לשחק מוקדי תפקיד לגבי מחקר בתחום האימונולוגיה, פרמטרים שונים חייבים להילקח בחשבון כאשר בוחנים כיצד הם מתקבלים ומה שיטות משמשים לבודד ותרבות אותם במבחנה. לכן, מחקר זה נועד לספק תובנה על שתי שיטות שונות של בידוד מונוציטים וכיצד שיטות אלה באופן דיפרנציאלי להשפיע כדאיות מונוציטים ותשואה בסופו של דבר להשפיע על הכדאיות של תאים דנדריטים, התפשטות, פנוטיפ. ממצאים אלו יתרמו רבים בתחום האימונולוגיה ויספקו פרוטוקול מפורט של בידוד DC, טיהור, ואפיון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
בסך הכל מחקרי דם אדם כבר נבדקו ואושרו על ידי דירקטוריון הסקירה המוסדי (IRB) של FIU, פרוטוקול IRB אישור # IRB-13-0440. leukopaks אדם נרכש מבנק דם הקהילה במיאמי, פלורידה.
1. ניתוק של PBMCs ידי טכניקת שיפוע צפיפות תקן
- בצע דילול 1: 1 של דם עם מי מלח 1X פוספט שנאגר בבקבוק T75.
- פיפטה 15 מ"ל של תמיסת שיפוע צפיפות לתוך 50 מ"ל צינורות צנטריפוגות שכבת בזהירות (25 - 30 מ"ל / צינור) של דם מדולל על שיפוע זה.
- צנטריפוגות במשך 20 דקות ב 1200 XG עם האצה של 1 האטה של 0.
- לאחר צנטריפוגה, לאסוף את שכבת ממשק (תאי דם לבנים) לתוך צינור צנטריפוגות חדשות 50 מ"ל ולשטוף תאים פעמיים PBS (3 דקות ב 1,080 XG). להשליך supernatant בכל פעם.
- פנקו את התאים עם lysing-אשלגן אמוניום כלוריד (ACK) חיץ (כדי lyse תאי דם אדומים). הוסף 10 מ"ל של חיץ ובcubate במשך 15 דקות ב 4 ° C..
- פעמיים שטפו תאים עם PBS, צנטריפוגות במשך 3 דקות ב 1080 XG וזורקים supernatant בכל פעם.
- שמור גלולה, אשר יכיל את PBMCs.
- להמשיך עם שיטת טיהור מונוציטים של בחירה.
2. טיהור מונוציטים ידי דבקות שיטה
- הכן בינוני תרבית תאים מלאה המכילה L- גלוטמין (300 מ"ג / מ"ל) שיושלם עם פניצילין (50 U / ml) -streptomycin (50 מיקרוגרם / מ"ל) ו -10% בסרום שור העובר.
- אפשר PBMCs לדבוק כ 2 שעות על ידי culturing אותם בבקבוק T75 בריכוז של 5 x 10 7 תאים לכל 10 מ"ל של מדיום שלם ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור humidified.
- לאחר דגירה, להסיר תאי צפים שאינם חסידים מן בקבוק התרבות לשטוף בעדינות תאים חסידים פעמים עם PBS.
- דגירת תאים חסידים במדיום תרבית תאים מלא בתוספת 2 μl / מיליליטר של macr גרנולוציט אדםמושבה ממגרת גורם ophage (GM-CSF) ו- interleukin 4 (IL-4) מאוחסנים בריכוז מלאה של 10 מיקרוגרם / מיליליטר.
- שנה וחצי של המדיום ומלאו ציטוקינים כל 48 שעות.
- אפשר 5 - 7 ימים עבור הבידול של מונוציטים לתוך MDDCs.
3. טיהור מונוציטים ידי שיטת הפרדה מגנטית
- אסוף PBMCs מן הטכניקה שיפוע צפיפות תקן, יוצקים לתוך צינור קלקר 5 מ"ל מחדש להשעות במאגר PBS בריכוז של תאים / מ"ל.
- הוסף קוקטייל ההעשרה מונוציטים האדם באמצעות 50 μl / תאים מ"ל, מערבבים היטב דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- לאחר דגירה, להוסיף חלקיקים מגנטיים באמצעות 50 μl / תאים מ"ל, מערבבים היטב דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- תביאו ההשעיה תא עד נפח כולל של 2.5 מ"ל על ידי הוספת PBS חיץ, ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה 2 - 3 פעמים.
- מניח את צינור הקלקר בלי כובע לתוך המכשיר המגנטי להפריש ב RT במשך 2.5 דקות.
- לאחר הדגירה בתנועה אחת רציפה, להרים המגנט ויוצקים השבר מונוציטים מטוהרים הרצויה לתוך צינור צנטריפוגה 50 מ"ל נקי.
- דגירת תאים חסידים במדיום תרבית תאים מלא בתוספת 2 μl / מיליליטר של (CSF-GM) גורם מגרת מושבת מקרופאג-גרנולוציט אדם אינטרלוקין 4 (IL-4) מאוחסנים בריכוז מלאה של 10 מיקרוגרם / מיליליטר.
- כל 48 שעות, לשנות וחצי של המדיום, ספין למטה ב 1,080 XG למשך 5 דקות מחדש להשעות גלולה עם מדיה חדשה (CRPMI) וציטוקינים.
- אפשר 5 - 7 ימים עבור הבידול של מונוציטים לתוך MDDCs.
4. Assay ליכולת קיום הכללת Trypan הכחול
הערה: השתמש בטכניקה זו כדי להשיג תא תשואה ואת הכדאיות של PBMCs, מונוציטים, ו MDDCs.
- קציר תאים באמצעות תקן טריפסין-EDTA ולבצע שטיפות של צלוחיות ואת גלולת התא באמצעות PBS. בהתאם לגודל של הגלולה, מחדשלהשעות ב 5 עד 10 מיליליטר של PBS לפזר את הגלולה.
- בתוך צינור מיקרו צנטריפוגות, לבצע דילול 1: 1 של מגיב trypan כחול עם תא גלולה מדולל.
- מתוך תמהיל זה, aliquot 10 μl לתא לספור שקופיות ולקרוא תוצאות באמצעות דלפק תא אוטומטי על פי הפרוטוקול של היצרן. אם נגד תא אוטומטי אינו זמין, ספירת תאים דומה אפשרית באמצעות hemocytometer או דלפק ידני.
5. Assay MTT
- פלייט תאים בריכוז של 4 x 10 4/100 μl של מדיה מלאה לבאר כל צלחת 96-היטב. אפשר 24 שעות עבור תאים להסתגל לתרבות.
- דגירה ולבצע קריאות 0 (יום 0), 36 (יום 3) ו -84 (יום 7) שעות בהתאמה.
- במועד ההשלמה של דגירה רצויה, להסיר תקשורת ולהחליף עם 100 μl של PBS לבד.
- הכן 3- (4,5-dimethylthiazol-2-י.ל.) פתרון ברומיד tetrazolium -2,5-diphenyl (MTT) (5 מ"ג / מ"ל) על ידי הוספת 10 מ"ל של dimethsulfoxide י.ל. (DMSO) עד 1 גרם של סולפט dodecyl נתרן (SDS).
- הוסף 10 μl (5 מ"ג / מ"ל) של פתרון MTT זה היטב לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות נוספות.
- לאחר דגירה, להסיר supernatants המכילים PBS תערובת MTT unconverted (פתרון צהוב צבעים).
- הוספת 100 μl של פתרון SDS-DMSO היטב כל דגירה במשך שעה אחת נוספת.
- קראו ספיגה ב 540 ננומטר באמצעות קורא microplate.
6. פני תא ניתוח מכתים ידי cytometry זרימת ההדמיה
- לאחר 7 ימים של בידול לעומת מונוציטים מטוהרים, לוותר 1x10 6 aliquots תא של התאים הדנדריטים הנגזרות מונוציטים לתוך המספר המתאים של צינורות 1.5 מ"ל.
- התחילו מכתימים פני תא על ידי תאי חסימה באמצעות 50 μl של חום מומת (HI) נסיוב אדם, דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- לאחר דגירה, תאים צנטריפוגות ב 720 XG במשך 5 דקות, להשליך supernatant.
- לתא Pellet, להוסיף fluorochrome- מצומדות נוגדנים המתאימים (למשל, אנטי CD11c או אנטי CD14) דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות מוגנים מפני אור. ב צינורות נפרדים, להכין דגימות יחיד מוכתם fluorochrome / מ"ל) מאז הם נדרשים לפיצוי.
- לאחר דגירה, לשטוף תאים פעמיים 1 מ"ל של חיץ PBS ו צנטריפוגות בכל פעם ב 720 XG במשך 5 דקות.
- שמירת תאים המוגנים מפני אור, מחדש להשעות במאגר PBS בריכוז של תאים / 100 μl לניתוח cytometry זרימה.
- על מנת שער על תאי קיימא, להוסיף 1 μl של DAPI על צינור אחד לפני רכישת התאים על זרימת הדמית תא הבודדה cytometry מכשיר פי הוראות היצרן.
7. ניתוח סטטיסטי
- קלט את כל הנתונים בגיליון אלקטרוני.
- השוואת התוצאות באמצעות מבחן t ו / או חד סטרי ANOVA על פי הצורך של התלמיד.
- מביא בחשבון הבדלים בין להיות משמעותי מבחינה סטטיסטית אם p <0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תשואת מונוציטים ידי פרדה מגנטית גבוהה בהשוואת תשואת מונוציטים ידי דבקות שיטה
נתונים המוצגים PBMC תצוגת איור 1 וספירת תאים מונוציטים בשיטת הרחקת trypan הכחולה על היום של בידוד של PBMCs ופרדה של מונוציטים. בממוצע, מונוציטים מבודדים בשיטת דבקות היוו כ 6.2 אחוז PBMCs הכולל תוך מונוציטים מבודדים על-ידי הפרדה מגנטי היוו עד 25 אחוזים של PBMCs. ניתוח סטטיסטי גילה כי האחוז מונוציטים ניב ידי פרדה מגנטית היה גבוה באופן משמעותי (≥ 4 לקפל). הנתונים באים לידי ביטוי ממוצע ± סטיית תקן של שלושה ניסויים בלתי תלויים לפחות. ניתוח סטטיסטי באמצעות t של סטודנט -test הראו הבדל משמעותי של תשואה מונוציטים כאשר משווים שתי השיטות (p ≤ 0.0005).
_content "FO: keep-together.within-page =" 1 "> בידוד מונוציטים ידי דבקות ועל ידי פרדה מגנטית שאינו משפיע כדאיות מונוציטיםלאחר בידוד מונוציטים ידי שתי הטכניקות השונות שתוארו לעיל, מבחני כדאיות בוצעו כדי להבטיח כי האמצעים שננקטו לא היו ציטוטוקסיות המשפיעים על יכולת הקיום של התאים. הנתונים מובאים תצוגת איור 2 מהממוצע של האחוז מונוציטים קיימא המבודד על-ידי אחת מהשיטות עמידות או על ידי פרדה מגנטית. תאי חיים נספרו בשיטת הרחקת trypan הכחולה על היום של בידוד. השוואת כדאיות אחוז מונוציטים בין שיטות הבידוד שני גילה כי ההבדל בין שתי הקבוצות לא היה מובהק סטטיסטית. בנוסף, הממוצע של אחוז מונוציטים קיימא מבודד על ידי דבקות היה 91.75% ± 1.66 ואת הממוצע של אחוז מונוציטים קיימא מבודד על ידי magnהפרדת etic היה 87.4% ± 2.75. נתונים כדאיים אלו הוערכו משלושה ניסויים עצמאיים לפחות. משמעות סטטיסטית נקבעה באמצעות מבחן t.
תאים שמקורם מונוציטים מבודדים על ידי פרדה מגנטית ניתן לראות גידול משמעותי ב התפשטות תאים לעומת התאים שמקורם מונוציטים נרכשו על ידי דבקות שיטה
MTT שימש assay colorimetric למדוד התפשטות תאים. בתאים חיים, צבע tetrazole הצהוב של MTT מצטמצם formazan הסגול, אשר נמדד בקלות באמצעות ספקטרופוטומטר. הנתונים המוצגים באיור 3 להוכיח כי שני התהליכים של בידוד מונוציטים להוביל התפשטות תאים גבוהה על פני תקופה של 7 ימים, כפי שהיא נמדדת על ידי מוגברת ספיגה ביום 0 (שיטת דבקות: 0.22 ± 0.02 שיטה מגנטית לעומת: 0.38 ± 0.02), יום 3 (שיטה דבקה: 0.28 ± 0.02, שיטה מגנטית: 0.55 ± 0.05) ויום 7 (שיטת דבקות: 0.36 ± 0.01, מגנט = 0.66 ± 0.006). עם זאת, בניגוד assay XTT (מידע לא מוצג), assay MTT חשף עלייה משמעותית בתא הפצת MDDCs מ מונוציטים מבודדים על-ידי הפרדה מגנטי לעומת MDDCs מ מונוציטים נרכשה על ידי שיטת הדבקות ביום 0 (p = 0.003), יום 3 (p = 0.006), ויום 7 (p = 0.002). התפשטות תאים נמצאת גם להיות שונה באופן משמעותי בין ימים 0 ו -3 (p = 0.003), ובין ימים 0 ו -7 (p <0.001) בתוך קבוצת MDDCs מ מונוציטים מטוהרת באמצעות פרדה מגנטית. יתר על כן, הבדל משמעותי התפשטות תאים בין היום 0 ויום 7 MDDCs מ מונוציטים מטוהר על ידי דבקה (p = 0.008) נצפה. assay MTT נערך באמצעות MDDCs רכשה שלושה ניסויים שונים. מובהקות סטטיסטיות נקבעו באמצעות ANOVA ואת מבחן t, p ≤ 0.05 wכמו נחשב משמעותי, ערכי p ציינו על הגרף, אלא אם כן לא נמצא מובהק סטטיסטית.
אפיון MDDCs ידי מכתים פני התא CD11c ו CD14
לאחר culturing מונוציטים במשך שבעה ימים עם IL-4 ו- GM-CSF, MDDCs המתקבל מונוציטים מבודדים על ידי שיטות דבקות ובידוד מגנטי התאפיינו באיור 4. האפיון חשף CD14 יחיד נמוכה + / פנוטיפ CD11c- או האוכלוסייה monocytic גרידא, בשתי השיטות, דבקות = 1% ± 1.0 לעומת מגנטים = 1% ± CD11c + פנוטיפ הכולל 0.0 וגבוה, דבקות = 72% ± 11 לעומת מגנטים = 79% ± 19. עם זאת, כאשר CD14 + האוכלוסייה נותחה נוסף נרשמה תשואה גבוהה של תאים כפולים חיוביים CD11c ו CD14, בשני השיטות עם פרדה מגנטית נותנת מספר גבוה יותר של CD11c ו CD14 הכפול החיוביכאשר אוכלוסייה בהשוואה לשיטת הדבקות, דבקות = 49% ± 7 לעומת מגנטים = 73% ± 15. למרות חלה תשואה גבוהה יותר של MDDCs עם פנוטיפ החיובי הכפול באמצעות פרדה מגנטית, CD11c החיובית אוכלוסייה שלילית CD14 של MDDCs הייתה גבוה בשיטת הדבקות; דבקות = 23% ± 7 לעומת מגנטים = 6% ± 7. איור 4 ב, את עוצמת הקרינה הממוצעת (MFI) של כל סמן בודד היו הביטה באוכלוסייה המגודרת והראתה בעצמה גבוהה של CD14 ב CD14 + אוכלוסייה, עוצמת מקבילה של שניהם CD11c ו CD14 באוכלוסייה חיובית כפולה ועוצמת CD11c גבוהה + CD11c ואוכלוסיית CD14-. לסיכום, למרות הבידוד מגנטי נותן אחוז גבוה יותר של CD11c + / CD14 + תאים, אשר עשוי להיות MDDCs הבדיל בשלב מוקדם שטרם ירד סמן monocytic (CD14), שיטת הדבקות נותן אחוז גבוה יותר של CD11c + / CD14-, אשר יכול להיות שלב מאוחר בדיל אוכלוסיית MDDC. בשנת additמכתים יון, DAPI בוצע על מנת לאשר את התוצאות כדאיות ועל מנת להבטיח אפיון בוצע על MDDCs החי. האחוזים של תאים שליליים / חי DAPI (דבקות = 76 ± 7 לעומת מגנטים = 67 ± 1) אינם שונים באופן מהותי בין שתי השיטות המאשר שני השיטות אינו משפיע על יכולת הקיום של MDDCs לאחר שבעה ימים בתרבות.
איור 1. מונוציטים תשואה ידי פרדה מגנטית גבוהה בהשוואת תשואת מונוציטים ידי דבקות שיטה. כ -6.2% של מונוציטים בודדו PBMCs בשיטת הדבקות תוך ~ 25% של מונוציטים התקבלו בשיטת הפרדה המגנטית. הנתונים באים לידי ביטוי ממוצע ± סטיית תקן של שלושה ניסויים בלתי תלויים לפחות. ניתוח סטטיסטי מבחן t באמצעות הראו הבדל משמעותי של תשואה מונוציטים כאשר משווים שתי השיטות(p = 0. 00005). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. בידוד מונוציטים ידי דבקות ועל ידי פרדה מגנטית שאינו משפיע כדאי מונוציטים. הממוצע של האחוז מונוציטים קיימא המבודד על ידי דבקות היה 91.75% ± 1.66 ואת הממוצע של האחוז מונוציטים קיימא המבודד על-ידי פרדה מגנטית היה 87.4% ± 2.75. הנתונים באים לידי ביטוי הממוצע ± סטיית תקן אחוז תאי קיימא של שלושה ניסויים בלתי תלויים לפחות. לא נמצא הבדל משמעותי ב כדאיויות תא כאשר משווים שני שיטות הטיהור. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
תאי איור 3. נגזר מונוציטים מבודד על ידי פרדה מגנטית ניתן לראות גידול משמעותי ב התפשטות תאים לעומת תאים שמקורם נרכש מונוציטים ידי דבקות שיטה. עלייה משמעותית ספיגה נצפתה עבור שני השיטות בשני היום 3 והיום 7 כאשר משווים את הערכים בהשוואה לקבוצת הביקורת שלו בהתאמה של יום 0. בנוסף, ANOVA וגם מבחן t הראה הבדל משמעותי ספיגת של ספיגת MTT כאשר משווים שתי השיטות (p ≤ 0.05). הנתונים באים לידי ביטוי הממוצע ± סטיית תקן של שלושה ניסויים בלתי תלויים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
96 / 54296fig4.jpg "/>
אפיון איור 4. MDDCs ידי CD11c ו CD14 Cell Surface מכתים. א) גרף בר המייצגים את האוכלוסיות השונות (% המגודר מתוך תאים בודדים). ראשית, DAPI- (בחיים) תאים היו מגודרים מתאי יחיד הכוללים. לאחר מכן, CD14 + / CD11c-, CD11c +, CD11c + / CD14 + ו CD11c + / CD14- היו מגודרת מ DAPI- (בחיים) האוכלוסייה. CD11c + אוכלוסייה היא הסיכום של CD11c שני אזורים + / CD14 + ו CD11c + / CD14-. B) גרפי נציג מראים את עוצמת הקרינה הממוצעת (MFI) שני ערכים עבור CD11c ו CD14 בכל תת-אוכלוסייה של תאים. ג) מגרש פיזור נציג של תאים שכותרתו עם CD11c-APC לנשלטים CD14-APCcy7 על אוכלוסיית תאים שלילי DAPI (בחיים) עבור שיטות מגנטי ודבקות שניהם. גלריית תמונות נציג של תאים בודדים (נבחרה בכחול בחלקות הפיזור) השייכים לכל אוכלוסיית משנה של תאים, CD11c + / CD14- (מגודר בכתום), CD11c + / CD14 + (מגודרבאדום), ו CD14 + (מגודר בסגול). בגלריה תמונה של תאים בודדים, הצבע האדום מייצג CD11c שכותרתו עם APC וצבע צהוב מייצג CD14 שכותרתו עם APCcy7. בחלקות הפיזור, הצבעים שנבחרו לשער האוכלוסיות הם אקראיים ואינו תואמים את תמונות תא בפועל. נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בהתבסס על הקשיים הידועים של בידוד ויצירת MDDCs מדם אדם, המחקר הנוכחי נועד לספק השוואה מקיפה של שתי שיטות ומבוססות עבור הדור של MDDCs. השיטה הראשונה לעומת שיטה מסורתית ומבוססת להפקה MDDCs תוך ניצול היכולת של מונוציטים לדבוק זכוכית או פלסטיק (שיטת הדבקות) 21,22,27. השיטה הדבקה היא מהירה וחסכונית, ואינו דורשת שימוש בציוד מורכב. עם זאת, כמה חסרונות של התהליך הזה כוללים זיהום לימפוציטים, גמישות נמוכה, 22,30,31 מניפולציה חולפת מונוציטים. שיטת החלופה השנייה לעומת היא הבידוד המגנטי של מונוציטים מתאי הדם היקפי mononuclear הכולל (PBMCs) באמצעות ערכת העשרה מונוציטים אדם 26, אשר נועדה לבודד מונוציטים מ PBMCs ידי סלקציה שלילית. יתרונה של שיטת הבידוד הזה הוא כי תאים לא הרצוייםמסומנים ומופרד באמצעות מגנט בעוד תאי היעד הם ניגרו בחופשיות לתוך צינור חדש ללא הצורך של עמודות וללא מיקוד התאים ישירות עם נוגדנים. ללא קשר לשיטת בידוד מונוציטים (חסיד לעומת פרדה מגנטית), לאחר ששני ההליכים, אחד השלבים הקריטיים בתוך הפרוטוקול הוא הגירוי במבחנה של מונוציטים עם גורם מגרת המושבה- מקרופאג גרנולוציט (GM-CSF) ו- interleukin-4 ( IL-4), אשר נדרשים כדי ליצור MDDCs. זהו פרוטוקול נפוץ גם שייעודו ליצור MDDCs מתאי mononuclear הדם מבלי להתפשר לכידת אנטיגן מאפיין קיבולת עיבוד של MDDCs בשלה 32. אחת המגבלות הגדולות של הטכניקות נפוצות עבור הדור במבחנה של DCs נקבע בהתאם לתשואה הנמוכה של תאים מבשרים כגון מונוציטים. כפי שדווח לעיל, מונוציטים מבודדים בשיטת הדבקות היוו כ 6.2 אחוזים בסך הכל PBMCs, בעוד מונוציטים מבודדים על-ידי הפרדה מגנטי היוו עד 25 אחוזים של PBMCs. על פי הספרות, טווחי ספירת תאי דם לבן הפרש אצל מבוגרים נורמלים מונוציטים הוא מ- 2 - 10% 31 תוך DCs רק מהווה 0.1 - 1% של תאי mononuclear הדם הכולל 20. לכן, התשואה הגבוהה של מונוציטים (~ 25%) המתקבלת לאחר בידוד מגנטי יכולה להיות בגלל טומאת אוכלוסיית תאים וחוסר נוגדנים ו / או חלקיקים מגנטיים מחייבים תאים לא רצויים.
כדי להשיג תשואה וטוהר גבוהה של מונוציטים מבודדים, כל השלבים הקריטיים בפרוטוקול יש לפעול בזהירות. במהלך הבידוד של PBMCs מן הדם על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות הרגיל, יש כמה שלבים קריטיים. ראשית, pipetting ו שכבות של דם בזהירות מעל שיפוע הפתרון צפיפות לתוך 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה היא צעד הדורש תרגול מאז pipetting בקשיחות יכול לגרום ערבוב של פתרון זה ודם,מה שעלול להוביל שכבת PBMC חלשה שקשה לבודד, או שזה יכול לגרום לתערובת השלמה של כדוריות דם אדומות עם PBMCs. בשלב זה, חשוב לשמור על תזרים קבוע יחסית איטי של pipetting להיות שכבה מוגדרת היטב של דם ושכבת PBMC ברורה. שנית, צנטריפוגה בשלב הבא עם 1 האצה האטה 0 הוא מאוד קריטי. אם הגדרות אלה אינן משמשות את הצעד צנטריפוגה הראשון, זה יוביל ערבוב של דם עם שיפוע הפתרון צפיפות סדיר ולא להפריד את PBMCs משאר מרכיבי הדם. שלישית, חשוב דגירה PBMCs עם אמוניום-כלוריד-אשלגן (ACK) lysing חיץ לא יותר מאשר בפעם אופטימיזציה (10 - 15 דקות) מאז הדגירה כבר עם ACK יכול להוביל לירידה של PBMCs קיימא יחד עם כדוריות דם אדומות . בנוסף, חשוב גם לבצע את שוטף PBS לאחר דגירת ACK. עם זאת, אם את כדוריות הדם האדומות אינן lysed עם הראשוןצעד ACK והם עדיין ממשיכים להופיע לאחר שטיפות, סיבוב נוסף של lysing ACK מומלץ מאוד.
לאחר הבידוד של תאי דם לבנים, יש כמה שלבים קריטיים כדי לזכור בעת ביצוע השיטה הדבקה ליצור מונוציטים. ראשית, לשטוף מעליו את לימפוציטים צף לאחר שעתיים של הדגירה PBMCs חשוב מאוד מאז הנוכחות של לימפוציטים צף יכול לגרום פחות מונוציטים לדבוק וגם יכול לגרום טוהר MDDC נמוך. למרות צעדי כביסה אלה הם קריטיים, מוגזמות כביסה קשה (יותר ממומלץ, כלומר, פעמים) יכול לגרום הכביסה מן מונוציטים החסידים מדי, וכתוצאה מכך התשואה מונוציטים נמוכה. שנית, דוגרי התאים עם מדיום וציטוקינים שלם הוא קריטי שכן הציטוקינים אחראים בידול של מונוציטים לתוך MDDCs. בנוסף, שינוי תקשורת ומלא את ציטוקינים כל 48 שעות חשובה עבור הבידול וההישרדות של התאים. בעוד שינוי תקשורת, הוא גם חיוני כדי לשמור את MDDCs צף ולהחזיר אותם בחזרה לתוך התרבות יחד עם תקשורת וציטוקינים טריים מאז יש כמה MDDCs שיכול לנתק מפני השטח במהלך התהליך של בידול. כמו כן חשוב לוודא כי מונוציטים הם זורעים בריכוז המומלץ, מצ"ב צפוף כי הם צריכים תא מגע תא על מנת לגדול. בעת ביצוע שיטת ההפרדה המגנטית ליצור מונוציטים, ישנם מספר שלבים קריטיים על מנת לקבל תשואה טובה וטוהר גבוה של מונוציטים. ראשית, הוא קריטי כדי לשמור על ריכוז התאים המומלץ על ידי היצרן. כמו כן, חשוב כדי לא להפריע צינור הקלקר כאשר הניחו המגנט, מכיוון שהוא עלול להוביל תשואה פחותה וטוהר פחותים. כפי שהוצג לעיל, טכניקה זו מובילה בתשואה מונוציטים גבוה משמעותית (איור 1) כשמשווים את שיטת הדבקות, אשר עשוי להיות קשור לנוכחות של ג אחריםאמות. יתר על כן, כאשר התאים התאפיינו cytometry זרימה, השיטה המגנטית מראה אחוז גבוה של תאים חיוביים כפולים (CD11c + / CD14 +), אשר להיות מתואם עם הנוכחות של תאים אחרים או יכול להיות גם בשל נוכחותם של שלבים שונים של MDDC בידול.
היבט חשוב נוסף של דור במבחנת MDDC קשר התשואה וטוהר הוא היכולת ליצור MDDCs קיימא השגשוג. המחקר הנוכחי מספק ראיות על מנת להוכיח כי הן שיטות הטיהור לגרום התפשטות של MDDCs (איור 3), כפי שמוצגת על ידי הגידול בפעילות תאים מטבולית במהלך שבעה ימים בתרבות. בנוסף, דור MDDCs מ מונוציטים מטוהרים על ידי הפרדה מגנטי הראו שיעור גבוה משמעותית של התפשטות להשוות MDDCs המופק מונוציטים מטוהרים על ידי הדבקה (איור 3). ממצאים אלה עולים בהתאם ספרות קודמת הוכחת g כיeneration של מחלת דקומפרסיה נובעים CD34 + תאים הוא תהליך שגשוג בשל נוכחותם של אבות DC שגשוג בדם אנושי 27, 33. עם זאת, ישנם ממצאים שנויים במחלוקת הוכחה כי מונוציטים יכול גם להתמיין DCs ללא כל ראיה של התפשטות 34,35. זה רלוונטי לציין כי יש הרבה חילוקי דעות בנוגע הדור במבחנה של DCs ובדבר אם DCs מופקת מן מבשרים מתרבים או בידול של מונוציטים. למשל, במבחנת ייצור של DC מתאי דם היקפיים חסידים הוכח גם להעשיר את ובתאים מסוגלים התפשטות לאחר חשיפת GM-CSF 27 ויש גם ראיות הוכחת כי התשואה של DCs נגזרה בנוכחות GM-CSF ו- IL-4 לא ניתן להרחיב מעבר למספר של החל מונוציטים 33. בסה"כ, המחקר הנוכחי מדגים מוגבר בהתרבות של monתאי ocytic בתרבות שעד שבעה ימים לגרום אוכלוסיית MDDCs הכולל עם> 70% + CD11c פנוטיפ (דבקות = 72% ± 11 לעומת מגנטים = 79% ± 19). זה רלוונטי לציין כי כאשר ניתוח פנוטיפי נוסף בוצע, אם כי לא משמעותי, מונוציטים מבודדים בשיטת הפרדה המגנטית הביאו MDDCs עם פנוטיפ חיובית גבוהה כפולה (דבקות = 49% ± 7 CD11c + / CD14 + לעומת מגנטים = 73% ± 15 CD11c + / CD14 +) בעוד מונוציטים מבודדים על-ידי הדבקה הביא MDDCs עם פנוטיפ חיובית אחת גבוה (דבקות = 23% ± 7 CD11c + / CD14- מול מגנטי = 6% ± 7 CD11c + / CD14-). MDDCs עם פנוטיפ חיובי כפול גבוה (CD11c + / CD14 +) עשוי להיות תחת בשלבים המוקדמים של בידול תוך MDDCs עם פנוטיפ חיובית אחת גבוהה יותר עשוי להיות תחת בשלבים מאוחרים של בידול.
לסיכום, המחקר הנוכחי מספק ראיות לתמוך כי procedur הפרדה מגנטי סלקציה שליליתדואר לבודד מונוציטים מייצר את התשואה הגבוהה ביותר של מונוציטים ללא הבדלים משמעותיים כדאי מונוציטים בהשוואת מונוציטים המבודדים בשיטת דבקות. בתורו, לאחר שבעה ימים, מונוציטים מבודדים על-ידי פרדה מגנטית מובחנים לתוך MDDCs עם יכולת שגשוג ואת סכום גבוה יותר באופן משמעותי גבוהים יותר של תאי מבטאים חיוביים כפול (CD11c + / CD14 +) פנוטיפ מבלי להשפיע כדאיות MDDC. כאשר משווים את שתי השיטות, הממצאים הדגימו את היכולת של שתי הטכניקות להפקת זמנית מונוציטים המסוגלים מתרבים (איור 3) ומבדל (איור 4) לתוך CD11c + MDDCs לאחר שבעה ימים בתרבות מאז שתי השיטות הניבו> 70% + CD11c MDDCs . עם זאת, ניתוח נוסף מסתכל סמני התבגרות עשוי להיות שימושי כדי לאפיין את אוכלוסיית MDDC מתפקדת במלואה. לסיכום, שתי השיטות הן חלופות יתרון עבור הבידוד של CD11c + MDDCs ו provIDE תשואה נאותה עבור יישומי מחקר ואף עלול להיות שימושי עבור יישומים קליניים עתידיים. המעבדה מתמקדת כעת דור MDDCs כדי לחקור את ההשפעות של שימוש לרעה באלכוהול וחומרים אחרים של התעללות על מערכת החיסון המולדת, ב במיוחד את היכולת של חומרים אלה כדי לשנות MDDC הפנוטיפ ותפקוד. לכן, המחקר הנוכחי יספק בסיס של אפיון MDDC ולשפר את היכולת להמשיך עם ניסויים נוספים כדי להבהיר את המנגנונים המולקולריים בתיווך פונקצית תאי דנדריטים נגזרים מונוציטים בהקשר של שימוש בסמים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-5442-03 | Must be used at RT |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Life Technologies | 10010-023 | |
| ACK Lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 22400-089 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Life Technologies | 15240-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| RoboSep buffer | StemCell | 20104 | |
| EasySep Human monocyte enrichment kit | StemCell | 19059 | |
| TC20 Automated cell counter | Bio-Rad | 145-0101 | |
| FITC-Dextran | Sigma Aldrich | FD4-100MG | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | |
| Synergy 2 multi-mode reader | Biotek | 7131000 | |
| XTT Sodium salt bioreagent (XTT) | Sigma Aldrich | X4626-100MG | |
| Dimethyl sulfoxide bioreagent (DMS) | Sigma Aldrich | D8418-500ML | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT) | Sigma Aldrich | m5655-500MG | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Bio-Rad | 161-0302 | |
| Phenazine Methosulfate (DMSO) | Sigma Aldrich | P9626-1G | |
| Inactivated (HI) Human Serum | Chemicon | S1-100ML | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | BD Accuri | 653119 | |
| FlowSight Amnis Flow Cytometer | EMD Millipore | 100300 |
References
- Cella, M., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Origin maturation and antigen presenting function of dendritic cells. Curr Opin Imunol. 9, 10-16 (1997).
- Banchereau, J., et al.
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Kaouther, M., Ridha, O.
- Steinman, R., Gutchinov, B., Witmer, M., Nussenzweig, M. Dendritic cells are the principal stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice. J Exp Med. 157, 613-627 (1983).
- Nair, M. N., et al. RNAi-directed inhibition of DC-SIGN by dendritic cells: Prospects for HIV-1 therapy. AAPS J. 7, E572-E578 (2005).
- Agudelo, M., et al. Chapter 10. Dendritic Cells: Types, Life Cycles and Biological Functions. , Nova Publishers. 167-177 (2010).
- Kajihara, M., Takakura, K., Ohkusa, T., Koido, S. The impact of dendritic cell-tumor fusion cells on cancer vaccines - past progress and future strategies. Immunotherapy. , (2015).
- Suwandi, J., Toes, R., Nikolic, T., Roep, B. Inducing tissue specific tolerance in autoimmune disease with tolerogenic dendritic cells. Clin Exp Rheumatol. 33, 0097-0103 (2015).
- Gorelik, M., Frischmeyer-Guerrerio, P. A. Innate and adaptive dendritic cell responses to immunotherapy. Curr Opin Allergy Immunol. 15, 575-580 (2015).
- Zwolak, A., et al. Peripheral blood dendritic cells in alcoholic and autoimmune liver disorders. Hum Exp Toxicol. 31, 438-446 (2012).
- Agudelo, M., et al. Differential expression and functional role of cannabinoid genes in alcohol users. Drug Alcohol Depend. 133, 789-793 (2013).
- Nair, M. P., Figueroa, G., Casteleiro, G., Muñoz, K., Agudelo, M. Alcohol Versus Cannabinoids: A Review of Their Opposite Neuro-Immunomodulatory Effects and Future Therapeutic Potentials. J Alcohol Drug Depend. 3, 184 (2015).
- Boukli, N. M., et al. Implications of ER Stress, the Unfolded Protein Response, and Pro- and Anti-Apoptotic Protein Fingerprints in Human Monocyte-Derived Dendritic Cells Treated With Alcohol. Alcohol Clin Exp Res. 34, 2081-2088 (2010).
- Nair, M. N., Mahajan, S., Sykes, D., Bapardekar, M., Reynolds, J. Methamphetamine Modulates DC-SIGN Expression by Mature Dendritic Cells. J Neuroimmune Pharmacol. 1, 296-304 (2006).
- Napuri, J., et al. Cocaine Enhances HIV-1 Infectivity in Monocyte Derived Dendritic Cells by Suppressing microRNA-155. PLoS ONE. 8, e83682 (2013).
- Nair, M. P. N., Saiyed, Z. M. Effect of methamphetamine on expression of HIV coreceptors and CC-chemokines by dendritic cells. Life Sciences. 88, 987-994 (2011).
- Nair, M. P. N., et al. Cocaine Modulates Dendritic Cell-Specific C Type Intercellular Adhesion Molecule-3-Grabbing Nonintegrin Expression by Dendritic Cells in HIV-1 Patients. J Immunol. 174, 6617-6626 (2005).
- Reynolds, J. L., Mahajan, S. D., Sykes, D. E., Schwartz, S. A., Nair, M. P. N. Proteomic analyses of methamphetamine (METH)-induced differential protein expression by immature dendritic cells (IDC). Biochem Biophys Acta. 1774, 433-442 (2007).
- Van Voorhis, W., Hair, L., Steinman, R., Kaplan, G. Human dendritic cells. Enrichment and characterization from peripheral blood. J Exp Med. 155, 1172-1187 (1982).
- Davis, G. The Mac-1 and p150,95 beta 2 integrins bind denatured proteins to mediate leukocyte cell-substrate adhesion. Exp Cell Res. 200, 242-252 (1992).
- Delirezh, N., Shojaeefar, E. Phenotypic and functional comparison between flask adherent and magnetic activated cell sorted monocytes derived dendritic cells. Iran J Immunol. 9, 98-108 (2012).
- Lehner, M., Holter, W. Endotoxin-Free Purification of Monocytes for Dendritic Cell Generation via Discontinuous Density Gradient Centrifugation Based on Diluted Ficoll-Paque Plus®. Int Arch Allergy Immunol. 128, 73-76 (2002).
- Van Brussel, I., et al. Fluorescent activated cell sorting: An effective approach to study dendritic cell subsets in human atherosclerotic plaques. J. Immunol Methods. 417, 76-85 (2015).
- Mucci, I., et al. The methodological approach for the generation of humandendritic cells from monocytes affects the maturation state of the resultant dendritic cells. Biologicals. 37, 288-296 (2009).
- Yuan, N., et al. The American Association of Immunologists (AAI). , AAI. Miami Beach, FL. (2007).
- Romani, N., et al. Proliferating dendritic cell progenitors in human blood. J Exp Med. 180, 83-93 (1994).
- Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. J Leukoc Biol. 56, 236-240 (1994).
- Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A, 643-647 (2010).
- El-Sahrigy, S. A., Mohamed, N. A., Talkhan, H. A., Rahman, A. M. A. Comparison between magnetic activated cell sorted monocytes and monocyte adherence techniques for in vitro generation of immature dendritic cells: an Egyptian trial. Cent Eur J Immunol. 40, 18-24 (2015).
- Curry, C. V. Differential Blood Count. , http://emedicine.medscape.com/article/2085133-overview (2015).
- Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179, 1109-1118 (1994).
- Cavanagh, L. L., Saal, R. J., Grimmett, K. L., Thomas, R. Proliferation in Monocyte-Derived Dendritic Cell Cultures Is Caused by Progenitor Cells Capable of Myeloid Differentiation. Blood. 92, 1598-1607 (1998).
- Ardeshna, S. M., et al. Monocyte-derived dendritic cells do not proliferate and are not susceptible to retroviral transduction. Br J Haematol. 108, 817-824 (2000).
- Chapuis, F., et al. Differentiation of human dendritic cells from monocytes in vitro. Eur J Immunol. 27, 431-441 (1997).
- Zhou, L. J., Tedder, T. F. CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells. Proc Natl Acad Sci. 93, 2588-2592 (1996).
- Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180, 1841-1847 (1994).
- Caux, C., et al. Activation of human dendritic cells through CD40 cross-linking. J Exp Med. 180, 1263-1272 (1994).
- Fujii, S. i, Liu, K., Smith, C., Bonito, A. J., Steinman, R. M. The Linkage of Innate to Adaptive Immunity via Maturing Dendritic Cells In Vivo Requires CD40 Ligation in Addition to Antigen Presentation and CD80/86 Costimulation. J Exp Med. 199, 1607-1618 (2004).
- Mohammadi, A., Mehrzad, J., Mahmoudi, M., Schneider, M., Haghparast, A. Effect of culture and maturation on human monocyte-derived dendritic cell surface markers, necrosis and antigen binding. Biotech Histochem. 90, 445-452 (2015).
