A Assembleia e Aplicação de 'tesoura Anéis': A endotelial novo modelo de Orbital, unidirecional e periódica fluxo de fluido e tensão de cisalhamento

Resumo

Sabe-se que diferentes níveis e padrões de cisalhamento de fluidos modulam a expressão gênica endotelial, o fenótipo e a suscetibilidade a doenças. Discutimos a montagem e o uso de 'anéis de cisalhamento': um modelo que produz padrões de tensão de cisalhamento unidirecionais e periódicos. Os anéis de cisalhamento são simples de montar, econômicos e podem produzir altos rendimentos celulares.

Resumo

Os desvios em relação aos níveis normais e padrões de vasculares jogo cisalhamento papéis fluidos importantes na fisiologia vascular e fisiopatologia induzindo adaptativa, bem como alterações patológicas no fenótipo endotelial e expressão gênica. Em particular, os efeitos inadaptado de periódico, o fluxo unidireccional shear stress induzido pode desencadear uma variedade de efeitos sobre vários tipos de células vasculares, em particular as células endoteliais. Embora até agora as células endoteliais de diversas origens anatômicas têm sido cultivadas, análises em profundidade das suas respostas ao cisalhamento de fluidos têm sido dificultados pela relativa complexidade dos modelos de cisalhamento (por exemplo, câmara de fluxo de placas paralelas, cone e modelo de fluxo de placa). Enquanto todos estes representam excelentes abordagens, tais modelos são tecnicamente complicado e sofre de desvantagens, incluindo o tempo de configuração relativamente longo e complexo, áreas de superfície de baixo, os requisitos para bombas e pressurização muitas vezes necessitando de selantes e vedações, criando desafios para both manutenção de esterilidade e uma incapacidade de executar várias experiências. No entanto, se os modelos de taxa de transferência mais elevados de fluxo de cisalhamento e foram disponíveis, um maior progresso na cisalhamento respostas endoteliais vasculares, a pesquisa de cisalhamento particularmente periódica, a nível molecular, podem ser mais rapidamente avançada. Aqui, descrevemos a construção e utilização de anéis de corte: um romance, simples de montar, e modelo de cultura de tecido barato, com uma área de superfície relativamente grande, que facilmente permite um alto número de repetições experimentais em unidirecionais, cisalhamento periódica estudos de estresse sobre células endoteliais.

Introdução

Tensão de cisalhamento de fluidos tem sido mostrado para modular os programas de genes endoteliais ^1-5 através da activação de elementos cis-reguladores ^6, a actividade de acetiltransferase de histona ⁷ e elementos de resposta a tensão de cisalhamento ⁽⁸⁾ SSRE. Cisalhamento influências de stress contribuições endoteliais no sentido de coagulação através da modulação do factor de tecido ⁹ e activador do plasminogénio tecidular (tPA) ¹⁰ expressão. A tensão de cisalhamento também influencia o controle da angiogênese ¹¹ e remodelação dos navios por regulação da síntese e ca....

Protocolo

1. Construção de 150 mm de diâmetro de cisalhamento anéis (Figura 1)

NOTA: Os anéis de corte pode ser construído de modo a criar muitas dimensões diferentes, variando as dimensões exteriores e interiores do prato de Petri, resultando em dispositivos com diferentes áreas de superfície total, o rendimento de células e desenvolvido gamas de forças de cisalhamento. Este relatório descreve um prato de 150 milímetros combinado com um prato de 100 milímetros interior para uma área de superfície total de 98 ^cm2 (Figura 2).

Resultados

Aqui nós apresentamos resultados representativos, tanto das células endoteliais do cérebro hCMEC / D3 e do rato monocamadas de células endoteliais microvasculares da retina, cultivadas em anéis de cisalhamento.

Depois de se deixar hCMEC / D3 monocamadas de células endoteliais do cérebro a crescer até à confluência em EBM completo, os anéis de cisalhamento foram colocadas num agitador orbital durante 72 horas. Usando a equação .......

Discussão

A construção do sistema de anel de corte durante a exposição das células endoteliais de cisalhamento é uma abordagem simples para realizar estudos de tensão de cisalhamento. No entanto, existem alguns passos que são críticos para a obtenção de anéis de cisalhamento superiores e melhores resultados. A vedação completa deve ser feita entre o anel interno e externo para evitar que materiais de vazamento que poderia criar tensão de cisalhamento inconsistente entre as amostras. Se a vedação não é feita, uma quantidade mínima.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa de cultura de tecidos de plástico de 100 x 20 mm	Corning	430167	Os pratos devem ser de poliestireno
Placa de cultura de tecidos de plástico de 150 x 25 mm	Corning	430599	Os pratos devem ser de poliestireno
Placa de Petri de vidro de 150 mm	Fisher	3160150BO
Tubos de plástico de cultura de tecidos de poliestireno de 15 ml Falcon		352099
Cloreto de metileno	Selante de borracha de silicone Sigma-Aldrich	D65100
	DAP	7079808641
etanol	Decon	2701
Pipeta de transferência de 3 ml	Becton-Dickinson	357524
impressora papel
tesoura
luvas
ferramenta rotativa e conjunto	Dremel	4000-6/50
cabeça de corte de ferramenta rotativa	Dremel	EZ476
ferramenta rotativa cabeça
agitador orbital de água
	VWR	57018-754
incubadora
Células endoteliais microvasculares da retina de rato	Biológicos Celulares	RA-6065

de brocadestilada