Vi beskriver etableringen av ortotopiske kolorektale svulster via injeksjon av tumorceller eller organoider i cecum av mus og den etterfølgende isolasjonen av sirkulerende tumorceller (CTC) fra denne modellen.
Til tross for fordelene ved enkel brukbarhet og kostnadseffektivitet, har subkutane musemodeller alvorlige begrensninger og simulerer ikke nøyaktig simulering av tumorbiologi og tumorcelle. Ortotopiske musemodeller er innført for å overvinne disse begrensningene; Imidlertid er slike modeller teknisk krevende, spesielt i hule organer som stor tarm. For å produsere ensartede tumorer som pålidelig vokser og metastaserer, er standardiserte teknikker for fremstilling av tumorceller og injeksjon kritiske.
Vi har utviklet en ortotopisk musemodell av kolorektal kreft (CRC) som utvikler svært ensartede svulster og kan brukes til tumorbiologi studier samt terapeutiske studier. Tumorceller fra enten primære svulster, 2-dimensjonale (2D) cellelinjer eller 3-dimensjonale (3D) organoider injiseres i cecum og, avhengig av metastatisk potensial for de injiserte tumorceller, danner svært metastaserende tumorer. I tillegg,CTCs finnes regelmessig. Her beskriver vi teknikken for tumorcellepreparering fra både 2D-cellelinjer og 3D-organoider, så vel som primær tumorvev, kirurgiske og injeksjonsteknikker, samt isolering av CTC fra de tumorbærende musene og nåværende tips for feilsøking.
Colorectal cancer (CRC) er en av de vanligste årsakene til kreftdød i vestlige land. 1 Mens den primære svulsten ofte kan resekseres, forekommer forekomsten av fjerne metastaser dramatisk prognosen og fører ofte til døden. 2 , 3 Det biologiske korrelatet til metastase er sirkulerende tumorceller (CTC), som løsner fra svulsten, overlever i omløp, festes til epitelet i målorganet, invaderer orgelet og til slutt vokser ut til nye lesjoner. 4 Selv om CTCs er kjent for å være av prognostisk relevans, er deres biologi bare delvis forstått som følge av deres ekstrem sjeldenhet i CRC, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . 10
Musmodeller er en kraftig tOol å studere ulike aspekter av kreftbiologi. Klassiske subkutane svulstmodeller blir produsert ved subkutan injeksjon av tumorceller i mottakermus, som kan være enten immunokompetente (hvis syngene muse-tumorceller brukes) eller immundefekt. Subkutane svulstmodeller er billige og produserer data raskt; Deres endpoints tumorvekst kan enkelt og ikke-invasivt måles. Imidlertid mislykkes 88% av nye forbindelser som har vist antitumoraktivitet i slike modeller i kliniske studier. 11 Dette skyldes blant annet forskjeller mellom mennesker og mus; En stor del av denne feilen skyldes imidlertid den lave prediktive verdien av subkutane musemodeller.
Ortotopiske musemodeller, hvor tumorcellene injiseres i opprinnelsesorganet og dermed vokser i deres opprinnelige mikromiljø, blir derfor stadig brukt i kreftforskning. 11 , 12 , </sOpp> 13 , 14 Ortotopiske modeller simulerer ikke bare lokale tumorvekstbetingelser; Som et resultat av det anatomisk korrekte stedet for svulstvekst, tillater ortotopiske musemodeller også realistisk simulering av metastase og brukes derfor til å studere CTC biologi 8 , 15 , 16 eller deres respons på ulike behandlinger i CRC. 13 , 17
En stor ulempe ved ortotopmusemodeller er deres tekniske kompleksitet. Avhengig av organet der cellene skal injiseres, er læringskurven til eksperimentet i stand til å indusere reproducerbare svulster ganske lang. Dette gjelder spesielt for kolorektale kreftmodeller, da tumorcellene må injiseres i tarmvegget, noe som ofte resulterer i perforering, tumorcellelekkasje eller endoluminal tumorcelletap. Dette erRticle er ment å beskrive metoden for cellepreparering fra primære vevsprøver, 2D-cellelinjer og 3D-organoidkultur og deres injeksjon i cecum av mus. Teknikken beskrevet her fører til svært ensartede tumorer og, avhengig av tumorbiologien av cellelinjen som brukes til injeksjon, reproduserbar dannelse av fjerne metastaser og CTC i mottakermusene. 15
Til tross for preklinisk bevist aktivitet i subkutane musemodeller, svikter det store flertallet av nye forbindelser i kliniske studier og kommer aldri til klinikken. 11 Denne åpenbare mangelen på subkutane musemodeller for nøyaktig å simulere biologi og vekstmønstre av svulster har ført til utviklingen av ortotopiske musemodeller basert på injeksjon av tumorceller direkte inn i det opprinnelige organet.
Ortotopiske musemodeller kan simulere biologien og formid…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av tysk forskningsstiftelse (WE 3548 / 4-1) og Roland-Ernst-Stiftung für Gesundheitswesen (1/14).
Cell culture Media and Components | |||
Advanced DMEM F12 | Invitrogen | 12634010 | DMEM/ F12 +++ medium |
HEPES (1 M) | Life Technologies GmbH | 15630056 | DMEM/ F12 +++ medium |
Glutamax-I Supplement (200 mM) | Life Technologies GmbH | 35050038 | DMEM/ F12 +++ medium |
Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Life Technologies GmbH | 15140122 | DMEM/ F12 +++ medium |
DMEM | Life Technologies GmbH | 61965026 | basic medium of 2D cell lines (DMEM/10%FCS) |
Fetal Calf Serum (FCS) | BIOCHROM AG | S 0115 | basic medium of 2D cell lines (DMEM/10%FCS) |
TrypLE Express enzymatic dissociation buffer | Life Technologies GmbH | 12604021 | |
Matrigel basement membrane matrix (BMM, phenol red free) | CORNING B.V. Life Sciences | 356231 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
Trypsin-EDTA (0,25%, Phenol-Red) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
6-/48-well plates with lid | CORNING | 3516/3548 | |
cell culture flask 75cm², 250 mL | VWR International GmbH | 734-2066 | |
cell culture flask 150cm², 600 mL | Corning B.V. Life Sciences | 355001 | |
Eppendorf tubes 1,5 mL / 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72.706.400/ 72.695.400 | |
15 ml, 50 ml centrifuge tubes | Greiner-Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
TC10 Counting Slides (for TC20 Counting Machine) | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1450016 | |
Pasteur pipettes (glass, 150 mm) | Fisher Scientific GmbH | 11546963/ FB50251 | thinly pulled by using a bunsen burner |
gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | for primary tumor tissue preparation |
MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | for primary tumor tissue preparation |
gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | for primary tumor tissue preparation |
Human Tumor Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | for primary tumor tissue preparation |
Falcon 70µm Cell Strainer | Corning B.V. Life Sciences | 352350 | for primary tumor tissue preparation |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Surgical Equipment | |||
Sevoflurane | AbbVie Germany GmbH & Co. KG | – | |
Medical oxygen | Air Liquide Medical GmbH | – | |
Buprenorphine | Temgesic | – | |
Bepanthen – opthalmic ointment | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
Normal saline 0.9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
Aqua ad injectabilia | Braun | 235144 | |
1 mL Syringe (without dead volume) – Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
30G injection needle | BECTON DICKINSON | 304000 | |
cellulose swabs | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
Micro-Adson Forceps | FST – Fine Science Tools | 11018-12 | |
Iris Scissor – ToughCut | FST – Fine Science Tools | 14058-11 | |
Olsen-Hegar Needle Holder | FST – Fine Science Tools | 12002-12 | |
AutoClip Kit | FST – Fine Science Tools | 12020-00 | |
PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
Table Top Research Anesthesia Machine w/O2 Flush and a Sevoflurane Vaporizer | Parkland Scientific | V3000PS/PK | |
UltraMicro Pump with Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-4 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
Footswitch for SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | 15867 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
Three-axis Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M325 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
Magnetic Stand for Micromanipulator | World Precision Instruments | M10 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
Steel Base Plate for M10 Magnetic Stand | World Precision Instruments | 5479 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
Isis – Hair shaver | AESCULAP – Braun | – | |
Binocular Surgical Microscope | Parkland Scientific | VS-2Z | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
CTC isolation | |||
EDTA | Roth | 8040.1 | |
Density gradient medium – Ficoll | StemCell – Lymphoprep | 7801 | |
Alexa Fluor 488 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody clone 9C4 | BioLegend | 324210 | |
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD326 (EpCAM) Antibody clone G8.8 | BioLegend | 118210 | |
Petri Dish, ø 60 x 15 mm, 21 cm², Vent | Greiner bio-one | 628102 | |
Fluorescence Cell Culture Microscope | Leica | ||
Transferman 4r Micromanipulator | Eppendorf | ||
CellTram Air | Eppendorf | aspiration pump connected to the micromanipulator | |
Dmz Universal Microelectrode Puller | Dagan Corporation | required for the manufacturing of micro capillaries for single cell aspiration | |
Prism Glass Capillaries | Dagan Corporation | ||
PAP pen | Abcam | ab2601 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | picking buffer |
Fetal Calf Serum (FCS) | BIOCHROM AG | S 0115 | picking buffer |
Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Life Technologies GmbH | 15140122 | picking buffer |
EDTA | Roth | 8040.1 | picking buffer |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Immunohistochemistry | |||
Purified anti-human CD326 (EpCAM) antibody clone 9C4 | BioLegend | 324201 | EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C) |
HRP rabbit anti-mouse IgG | Abcam | ab97046 | EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C) |