Summary
Dit protocol beoogt een algemene methode te presenteren om lignine, cellulose en hemicellulose in plantencelwanden te visualiseren met behulp van Raman imaging en multivariate analyse.
Abstract
De toepassing van Raman imaging op plantaardige biomassa neemt toe omdat het ruimtelijke en compositie-informatie over waterige oplossingen kan bieden. De analyse vereist gewoonlijk niet uitgebreide monstervoorbereiding; Structurele en chemische informatie kan worden verkregen zonder etikettering. Echter, elke Raman-afbeelding bevat duizenden spectra; Dit leidt tot problemen bij het opnemen van verborgen informatie, vooral voor componenten met vergelijkbare chemische structuren. Dit werk introduceert een multivariate analyse om dit probleem aan te pakken. Het protocol stelt een algemene methode in voor het visualiseren van de hoofdcomponenten, waaronder lignine, cellulose en hemicellulose binnen de plantencelwand. In dit protocol worden procedures voor steekproefbereiding, spectrale aanschaf en dataverwerking beschreven. Het is sterk afhankelijk van de vaardigheden van de operator bij het voorbereiden van de monster- en data-analyse. Met behulp van deze aanpak kan een Raman-onderzoek worden uitgevoerd door een niet-gespecialiseerde gebruiker om hig te verwervenH-kwaliteitsdata en zinvolle resultaten voor plantencelwandanalyse.
Protocol
1. Voorbeeld Bereiding
- Knip een klein weefselblok (ongeveer 3 mm x 3 mm x 5 mm) van het plantenmonster af ( bijvoorbeeld een populierstam).
- Dompel het weefsel gedurende 30 minuten in kokend gedeïoniseerd water. Breng het onmiddellijk naar gedeïoniseerd water bij kamertemperatuur (RT) gedurende 30 minuten. Herhaal deze stap totdat het weefsel zinkt naar de bodem van de container, wat aangeeft dat de lucht in weefsel is verwijderd en dat het weefsel is verzacht.
Opmerking: Voor de monsters die voor deze stap zinken, moet u deze cyclus 3-5 keer herhalen. - Bereid 20, 50, 70, 90% (v / v) porties polyethyleenglycol (PEG) in gedeïoniseerd water, evenals pure PEG, en houd de oplossingen bij 65 ° C.
- Incubeer het weefsel in een reeks gegradeerde PEG-baden om het water te verplaatsen en de PEG te laten infiltreren.
Opmerking: Typisch wordt PEG met een molecuulgewicht 2000 (PEG2000) gebruikt voor inbedding.- Verwerk het weefsel met gPEG in een droogoven als volgt: (a) 20% PEG gedurende 1 uur, (b) 50% PEG gedurende 1,5 uur, (c) 70% PEG gedurende 2 uur, (d) 90% PEG gedurende 2 uur en (E) 100% PEG gedurende 10 uur.
- Verwarm een cassette bij 65 ° C in een oven. Giet de PEG die het blok bevat in de cassette en plaats het weefselblok op een gewenste plaats met behulp van voorverwarmde pincet of naalden.
- Koel de cassette langzaam af en hou het weefsel bij kamertemperatuur op tot het gebruik.
- Dissecteer het PEG-blok dat het doelweefsel bevat in een klein blokje (ongeveer 1 cm x 1 cm x 2 cm) met een scherp scheermesje en bevestig het op de microtome.
- Snijd dunne delen van het PEG-blok (typisch 3-10 μm).
- Spoel het gedeelte met gedeioniseerd water 10 keer in een kijkglas om de PEG uit het weefsel te verwijderen.
- Dompel de deeltjes met tolueen / ethanol (2: 1, v / v) gedurende 6 uur om de extracties te verwijderen. Bereid de reactievloeistof door het mengen van 65 ml gedeïoniseerd water, 0,5 ml azijnzuur en 0,6 g natriumchloRite in een beker. Voeg een sectie en 3 ml reactievloeistof toe aan een 5 ml injectieflacon. Schroef de bovenkant van de injectieflacon aan.
- Verhit de flesje in waterbad bij 75 ° C gedurende 2 uur om de lignine van het weefsel te verwijderen. Spoel de sectie met gedeïoniseerd water 10 keer in een kijkglas.
- Breng de onbehandelde / gedeignificeerde sectie over op een glasmicroscoopschuif. Vouw het gedeelte voorzichtig uit met behulp van borstels of naalden. Verwijder het extra gedeioniseerde water met tissuepapier.
- Dompel het gedeelte in D 2 O. Bedek het monster met een glazen afdekplaat. Verzegel de deklaag met nagellak om de verdamping van de D 2 O te voorkomen.
2. Spectrale Acquisitie
- Open de instrumentbedieningssoftware van de confocal Raman-microscoop. Zet de laser aan (golflengte = 532 nm), focus op het oppervlak van het kristallijne silicium met een 100x microscoopdoelstelling en klik op de kalibratieknop om het instrument te kalibreren.
- Schakel het instrument inNaar de optische microscoopmodus en zet de microscooplamp aan. Monteer de microscoopschuif op het podium, met de afdekplaat naar het object gericht.
- Bekijk het monster met een 20x-microscoopdoelstelling en zoek het gebied van belang. Breng onderdompelingsolie aan op de deklaag en schakel over naar de immersionmicroscoopdoelstelling (60X, numerieke diafragma NA = 1.35). Focus op het oppervlak van het monster.
- Schakel het instrument in de testmodus Raman en zet de microscooplamp uit.
- Kies een kaartgebied door gebruik te maken van een rechthoekig gereedschap. Verander de stapgrootte om het aantal verkregen spectra te bepalen.
Opmerking: Let op de stapgrootte (meestal groter dan de plaatsdiameter berekend door de numerieke diafragma van het doel, theoretisch 1.22λ / NA). Maten onder dit zullen resulteren in oversampling. - Stel de optimale spectrale parameters in om de beste signaal-ruisverhouding (SNR) en spectrale kwaliteit te verkrijgen in een geschikte aanschafstijd (in het algemeen <8 uur), depeNding op de geschiktheid van het monster. Typ in het algemeen de beeldparameters in de instrumentsoftware als volgt: laser (532 nm), filter (100%), gat (300), spleet (100), spectrometer (1,840 cm -1 ), groeven (1200t), objectief 60X olie), en verwervingstijd (2 s).
- Bewaar de spectrale data voor gegevensverwerking en omzetten naar een universeel formaat ( bijv. TXT-bestanden).
3. Gegevensanalyse
- Laad de spectrale data (TXT-bestanden) in de data-analyse software ( bijv. Matlab). Breng een geluidsreductie techniek aan op de dataset om de SNR te verbeteren (bijvoorbeeld het Savitzsky-Golay-algoritme of het waveletalgoritme)
- Gebruik onbehandelde monsters om de afbeeldingen van lignine en polysacchariden te produceren. Voor lignin imaging, beschouw de spectrale piek rond 1.600 cm -1 door de aromatische ring symmetrische stretching vibratie. Voor polysaccharide imaging (inclusief cellulose en hemicellulose), gebruik de spectrale piek aRond 2,889 cm -1 door de CH en CH 2 strekken.
- Gebruik afgekeurde monsters om de afbeeldingen van cellulose en hemicellulose te genereren. Voer zelfmodellerende curve resolutie (SMCR) uit op de verworven spectra om de spectra van cellulose en hemicellulose te onderscheiden en om hun verdelingen te zien.
- Voer hoofdcomponentanalyse (PCA) en clusteringanalyse uit op de verworven data om de Raman-spectra van verschillende celwandlagen te onderscheiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 geeft een overzicht van een typisch micro-Raman systeem voor de Raman beeldvorming van een plantencelwand. Bijvoorbeeld, de oorspronkelijke Raman spectra van populier ( Populus nigra L.) hebben significante baseline drijvingen en spikes ( Figuur 2a ). Na het uitvoeren van de automatische voorverwerkingsmethode voor Raman imaging dataset (APRI) worden deze twee spectrale verontreinigingen succesvol verwijderd ( Figuur 2b ). Een typisch Raman spectrum van populier wordt weergegeven in figuur 3 , en zijn bandopdrachten worden in tabel 1 weergegeven. Het Ramanbeeld van lignine wordt gegenereerd door de integratie van het spectrale gebied van 1.550-1.650 cm -1 , die wordt toegeschreven aan de aromatische ringstructuur ( Figuur 4a ). Figuur 4d toont het Ramanbeeld van polysacchariden, whHet wordt bereikt door de piek te integreren op 2,889 cm -1 . Voor beeldcellulose en hemicellulose wordt SMCR uitgevoerd op de Raman beeldvormingsgegevens van een gedeignificeerd monster. De bijbehorende spectra en afbeeldingen worden getoond in figuur 5 . Figuur 6 geeft de resultaten op basis van PCA en clustering analyse.
Figuur 1: Een schematische weergave van Raman Imaging voor de Plant Cell Wall. Het doorsnede monster (populier als voorbeeld) wordt gemeten door een micro-Raman systeem dat een optische microscoop koppelt aan een Raman hoge resolutie spectrometer met een CCD-detector. In het felveldbeeld wordt de plantencelwand georganiseerd in de celhoek (CC), samengestelde midden lamella (CML) en secundaire muur (SW). Conventioneel wordt een Raman-afbeelding gegenereerd door single-peakIntegratie of intensiteit. Twee spectrale verontreinigingen ( dwz baseline drives en kosmische spikes) worden gevonden in de oorspronkelijke gegevens. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: De Raman Spectra Vóór ( a ) en Na ( b ) Voorverwerking door APRI. Twee spectrale verontreinigingen worden succesvol verwijderd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Een typisch Raman Spectrum van de Poplar Cell Wall. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Raman Beelden van Lignin ( a ) en Polysacchariden ( b ) in de Poplar Cell Wall. Het ligninbeeld wordt gegenereerd door de piek omstreeks 1600 cm -1 te integreren. Het polysaccharidebeeld wordt geproduceerd door de piek te integreren rond 2,889 cm -1 . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Raman Beelden van Cellulose ( a ) en Hemicellulose ( b ) in de Poplar Cell Wall. SMCR wordt uitgevoerd op de Raman imaging data van een gedeignificeerd monster. Delignificatie draagt bij aan de blootstelling van de spectrale eigenschappen van cellulose en hemicellulose. Cellulose is meestal geconcentreerd in de SW, terwijl de verspreiding van hemicellulose bijna uniform is in de populiercelwand. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Resultaten voor PCA en Clustering Analyse voor het automatisch identificeren van verschillende celwandlagen in de Poplar Cell Wall. Met behulp van PCA en clustering analyse, zijn de spectra verdeeld in vier delen die overeenkomen met het cellumen, CC, CML en SW. De gemiddelde spectra van deze lagen worden hieronder gegeven. Uit de resultaten blijkt dat het lignine is geconcentreerd langs de CML en in de CC, terwijl de polysacchariden vooral geconcentreerd zijn in de SW. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Wavenumbers (cm -1 ) | Components | opdrachten |
| 1095 | Cellulose, Hemicellulose | Zware atoom CC en CO die trillingen uitstrekken |
| 1123 | Cellulose, Hemicellulose | Zware atoom CC en CO die trillingen uitstrekken |
| 1163 | Cellulose, Hemicellulose </ Td> | Zware atoom CC en CO die trillingen uitbreiden plus HCC en HCO buigende trillingen |
| 1275 | lignine | Aryl-O van aryl OH en aryl 0-CH3; Guaiacylring met C = O groep |
| 1331 | Lignine, Cellulose, Hemicellulose | HCC en HCO buigen trillingen |
| 1378 | Cellulose, Hemicellulose | HCC, HCO en HOC buigen trillingen |
| 1460 | Lignine, Cellulose, Hemicellulose | HCH en HOC buigen trillingen |
| 1603 | lignine | Arylring die trillingen uitstrekt, symmetrische trilling |
| 1656 | lignine | Ring geconjugeerde C = C strengende trilling van coniferyl alcohol; C = O strekt trillingen van coniferaldehyde |
| 2889 | C, H | CH en CH 2 strengen trillingen |
| L, C, H | CH strekt trillingen in OCH 3 asymmetrische trillingen |
Tabel 1: Raman Peak Posities en Band Opdrachten
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De plantencelmuur is een samengesteld materiaal dat in verschillende lagen is georganiseerd, inclusief celhoek (CC), secundaire muur (SW, met de S1, S2 en S3 lagen), en samengestelde midden lamella (CML, midden lamella plus de aangrenzende primaire Muur), waardoor het moeilijk is om een platte oppervlakte te verkrijgen tijdens de monstervoorbereiding. Zo moeten plantmonsters, in het bijzonder gras, die een ingewikkelder structuur hebben dan hout, vaak worden gestolven om fijne snede te kunnen maken. PEG is een ideale harde matrix voor snijden en Raman onderzoek, omdat het oplosbaar is in water. Het kan gemakkelijk worden verwijderd door spoelen met gedeïoniseerd water. PEG gebruikt voor embedding heeft verschillende molecuulgewichten, variërend van 1000 tot 20.000. Hoe hoger het molecuulgewicht van het PEG is, hoe lager het penetratievermogen 10 . D 2 O zal helpen om de fluorescentie van lignine te verminderen en heeft een gemarkeerde piek bij 2,490 cm -1 , maar het elimineert de fluorescentie-interferentie niet. TweeGrote geluidssignalen overkomen in de kanalen, samen met de eigenlijke signalen: 1) monsters en achtergrondfluorescentie, evenals thermische fluctuaties van CCD, kunnen leiden tot baseline-driften en 2) kosmische stralen kunnen de gevoelige detectoren duidelijk beïnvloeden Spectra als smalle bandbreedte spikes. De APRI-methode is ontwikkeld om deze problemen aan te pakken 11 . APRI omvat de adaptieve iteratief reweighted penalized least squares (airPLS) en de hoofdcomponent analyse (PCA) om de baseline drives en kosmische spikes te elimineren door gebruik te maken van de spectrale eigenschappen zelf.
Om distributiebeelden te verkrijgen, moet de piekintensiteit / integratie en de volledige spectra lineaire montage worden geselecteerd door multivariate methoden. De voormalige is geschikt voor de componenten met specifieke Raman pieken ( bijv. Lignine), terwijl de laatste geschikt is voor de componenten met sterke spectrale overlap (bijvoorbeeld cellulose en hemicellulose). De distriButionbeelden van lignine en polysacchariden zijn verkrijgbaar door respectievelijk de specifieke pieken rond respectievelijk 1.600 cm -1 en 2.889 cm -1 te integreren (Figuur 4). Echter, de beelden van cellulose en hemicellulose zijn moeilijk te direct door piekintegratie te genereren door de sterke spectrale overlap. Multivariate analyse maakt het mogelijk om de ingewikkelde informatie-inhoud te sorteren volgens de hypothese dat de oorspronkelijke gegevens worden gereconstrueerd uit een beperkt aantal significante factoren 12 . Het kan dus toegepast worden om hun spectra te discrimineren en om overeenkomstige Raman beelden te produceren. Voor plantenmonsters verstoort de aanwezigheid van extractiva en lignine de mogelijkheid om de spectra van cellulose en hemicellulose te reconstrueren. Het is noodzakelijk deze interferenties te verwijderen voor de SMCR analyse van de beeldgegevens. SMCR werd voor het eerst geïntroduceerd door Lawton en Sylvester als een multivariate techniek die specifiek is ontwikkeld voor het oplossen van een pure component fRom een reeks spectra, zonder gebruik te maken van een spectrale bibliotheek, om de beeldgegevens 13 te analyseren . Spectrale classificatie is belangrijk voor het verder begrijpen van de structurele en chemische aard van de plantencelwand. Hier zijn de beeldvormingsgegevens onderworpen aan de hoofdcomponentanalyse (PCA) en clusteringanalyse om Raman-spectra van verschillende celwandlagen 14 te onderscheiden.
Deze techniek heeft echter twee beperkingen. Ten eerste is het Raman-effect zwak. De typische totale Raman verstrooiingsdoorsnede is ~ 10-29 cm 2 per molecuul, waardoor het kwetsbaar is voor intense fluorescentie 15 . Een mogelijke manier om het defect te verbeteren is door de secties zo dun mogelijk te bereiden en een baseline correctie algoritme aan te brengen, maar fluorescerende signalen zijn moeilijk te verwijderen. Ten tweede, chemische behandeling is een belangrijke procedure bij het behalen van Raman beelden van celUlose en hemicellulose, en het kan het risico verhogen om de oorspronkelijke chemische inhoud te veranderen. Daarom is het het beste om de extractieve stoffen en lignine zo veel mogelijk te verwijderen, zonder dat de celwandstructuur te verschillend is van de onbehandelde.
Ten slotte is dit protocol geschikt voor het bestuderen van de verdeling van lignine, cellulose en hemicellulose binnen plantencelwand. Het gebruik van Raman beeldvorming om de gewenste informatie te verkrijgen is sterk afhankelijk van de vaardigheid van de operator bij het bereiden van monster en data-analyse. Goede steekproefbereiding is essentieel om hoogwaardige Raman spectra te verzamelen. Een geschikte data analyse geeft inzicht in de grootschalige spectra en haalt de verborgen informatie uit de afbeelding uit. Als een fundamentele methode kan dit protocol worden gebruikt om de dynamische veranderingen van belangrijke componenten te detecteren tijdens chemische, fysieke of biologische behandeling op micro-niveau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken het ministerie van Wetenschap en Technologie van China (2016YDF0600803) voor de financiële steun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtome | Thermo Scientific | Microm HM430 | |
| Confocal Raman microscope | Horiba Jobin Yvon | Xplora | |
| Oven | Shanghai ZHICHENG | ZXFD-A5040 |
References
- Gonzalo, G. D., et al.
- Rosatella, A. A., Afonso, C. A. M. Chapter 2. Ionic Liquids in the Biorefinery Concept: Challenges and Perspectives. , Wiley. 38-64 (2016).
- Sun, L., et al. Understanding tissue specific compositions of bioenergy feedstocks Through hyperspectral Raman imaging. Bio. 108 (2), 286-295 (2009).
- Tolstik, T., et al. Classification and prediction of HCC tissues by Raman imaging with identification of fatty acids as potential lipid biomarkers. J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 141 (3), 407-418 (2015).
- Schrader, B. Infrared and Raman spectroscopy: methods and applications. , John Wiley and Sons. (2008).
- Gierlinger, N., et al. Imaging of plant cell walls by confocal Raman microscopy. Nat. Protoc. 7 (9), 1694-1708 (2012).
- Luca, A. C. D., et al. Online fluorescence suppression in modulated Raman spectroscopy. Anal. Chem. 82 (2), 738-745 (2009).
- Schlücker, S., et al. Raman microspectroscopy: a comparison of point, line, and wide-field imaging methodologies. Anal. Chem. 75 (16), 4312-4318 (2003).
- Cooper, J. B. Chemometric analysis of Raman spectroscopic data for process control applications. Chemometr. Intell. Lab. Syst. 46 (2), 231-247 (1999).
- Cheng, H. J., Hsiau, S. S. The study of granular agglomeration mechanism. Powder Technol. 199 (3), 272-283 (2010).
- Zhang, X., et al. Method for removing spectral contaminants to improve analysis of Raman imaging data. Sci. Rep. 6, 39891 (2016).
- Shinzawa, H., et al. Multivariate data analysis for Raman spectroscopic imaging. J. Raman Spectrosc. 40 (12), 1720-1725 (2009).
- Lawton, W. H., Sylvestre, E. A. Self modeling curve resolution. Technometrics. 13, 617-633 (1971).
- Zhang, X., et al. Method for automatically identifying spectra of different wood cell wall layers in Raman imaging data set. Anal. Chem. 87 (2), 1344-1350 (2015).
- Kudelski, A. Analytical application of Raman spectroscopy. Talanta. 76 (1), 1-8 (2008).
