Summary
Denne protokollen tar sikte på å presentere en generell metode for å visualisere lignin, cellulose og hemicellulose i plantecellevegger ved hjelp av Raman-bildebehandling og multivariat analyse.
Abstract
Anvendelsen av Raman imaging til plantebiomasse øker fordi den kan tilby romlig og sammensetningsinformasjon om vandige løsninger. Analysen krever vanligvis ikke omfattende prøvefremstilling; Strukturell og kjemisk informasjon kan oppnås uten merking. Imidlertid inneholder hvert Raman-bilde tusenvis av spektra; Dette gir vanskeligheter når man trekker ut skjult informasjon, spesielt for komponenter med lignende kjemiske strukturer. Dette arbeidet introduserer en flervariant analyse for å løse dette problemet. Protokollen etablerer en generell metode for å visualisere hovedkomponentene, inkludert lignin, cellulose og hemicellulose i plantecelleveggen. I denne protokollen beskrives prosedyrer for prøvefremstilling, spektraloppkjøp og databehandling. Det er svært avhengig av operatørferdighet ved prøvetilberedelse og dataanalyse. Ved å bruke denne tilnærmingen kan en Raman-undersøkelse utføres av en ikke-spesialisert bruker for å skaffe seg higH-kvalitetsdata og meningsfylte resultater for analyse av plantecellevegger.
Protocol
1. Prøveforberedelse
- Klipp en liten vevblokk (ca. 3 mm x 3 mm x 5 mm) fra planteprøven ( f.eks. En poppestamme).
- Dyp vevet i kokende deionisert vann i 30 minutter. Overfør straks det til deionisert vann ved romtemperatur (RT) i 30 minutter. Gjenta dette trinnet til vevet synker til bunnen av beholderen, noe som indikerer at luften i vevet er fjernet og at vevet har mykt.
Merk: For prøvene som synker til bunnen før dette trinnet, gjentar du vanligvis denne syklusen 3-5 ganger. - Tilbered 20, 50, 70, 90% (volum / volum) alikvoter av polyetylenglykol (PEG) i avionisert vann, så vel som rent PEG, og hold opp løsningene ved 65 ° C.
- Inkuber vevet i en rekke graderte PEG-bad for å forskyve vannet og la PEG infiltrere.
Merk: Vanligvis brukes PEG med en molekylvekt på 2000 (PEG2000) for innfelling.- Behandle vevet med gRaded PEG i en tørkeovn som følger: (a) 20% PEG i 1 time, (b) 50% PEG i 1,5 timer, (c) 70% PEG i 2 timer, (d) 90% PEG i 2 timer, og (E) 100% PEG i 10 timer.
- Forvarm en kassett ved 65 ° C i en ovn. Hell PEG som inneholder blokken i kassetten, og legg deretter vevblokken i ønsket posisjon ved hjelp av forvarmede pincett eller nåler.
- Kald sakte ned kassetten og oppbevar vevet ved RT til bruk.
- Disseksér PEG-blokken som inneholder målvevet til en liten blokk (ca. 1 cm x 1 cm x 2 cm) ved hjelp av et skarpt knivblad og fest det på mikrotomen.
- Skjær tynne seksjoner fra PEG-blokken (vanligvis 3-10 μm).
- Skyll avsnittet med deionisert vann i et urglass 10 ganger for å fjerne PEG fra vevet.
- Damp delene med toluen / etanol (2: 1, volum / volum) i 6 timer for å fjerne ekstrakter. Forbered reaksjonsvæsken ved å blande 65 ml deionisert vann, 0,5 ml eddiksyre og 0,6 g natriumkloridRite i et beger. Tilsett en seksjon og 3 ml reaksjonsvæske til et 5 ml hetteglass. Skru på toppen av hetteglasset.
- Varm hetteglasset i vannbad ved 75 ° C i 2 timer for å fjerne ligninet i vevet. Skyll seksjonen med deionisert vann i et urglass 10 ganger.
- Overfør ubehandlet / delignified-delen til et glassmikroskop. Fell opp delen nøye med pensler eller nåler. Fjern det ekstra deioniserte vannet med vevpapir.
- Dyp avsnittet inn i D 2 O. Dekk prøven med et glassdeksel. Tett dekselet med neglelakk for å forhindre fordampning av D 2 O.
2. Spektraloppkjøp
- Åpne instrumentets operativprogramvare for konfokal Raman-mikroskop. Slå på laseren (bølgelengde = 532 nm), fokus på overflaten av det krystallinske silisiumet med et 100x mikroskopmål, og klikk på kalibreringsknappen for å kalibrere instrumentet.
- Slå på instrumentetTil optisk mikroskopmodus og slå på mikroskoplampen. Monter mikroskopdysen på scenen, med dekselet som vender mot målet.
- Se prøven med et 20x-mikroskopmål og finn området av interesse. Påfør nedsenking av olje til dekselglasset og bytt til immersjonsmikroskopmål (60X, numerisk blenderåpning NA = 1,35). Fokus på overflaten av prøven.
- Bytt instrumentet til Raman-testmodus og slå av mikroskoplampen.
- Velg et kartområde ved hjelp av et rektangulært verktøy. Endre trinnstørrelsen for å bestemme antall oppnådde spektra.
Merk: Vær oppmerksom på trinnstørrelsen (vanligvis større enn spotdiameteren beregnet ved den numeriske blenderåpningen for målet, teoretisk 1,22λ / NA). Størrelser under dette vil resultere i oversampling. - Sett de optimale spektralparametrene for å oppnå det beste signal-støyforholdet (SNR) og spektralkvaliteten i en passende oppkjøpstid (generelt <8 timer), depeNding på prøven egnethet. Generelt legger du inn bildebehandlingsparametrene i instrumentprogramvaren som følger: laser (532 nm), filter (100%), hull (300), spalt (100), spektrometer (1,840 cm -1 ), spor (1200t), mål 60X olje), og oppkjøpstid (2 s).
- Lagre spektraldataene før databehandling og konverter dem til et universelt format ( f.eks. TXT-filer).
3. Dataanalyse
- Last opp spektraldataene (TXT-filer) i dataanalyseprogrammet ( f.eks. Matlab). Bruk en støyreduksjonsteknikk på datasettet for å forbedre SNR ( f.eks . Savitzsky-Golay-algoritmen eller wavelet-algoritmen)
- Bruk ubehandlede prøver for å produsere bildene av lignin og polysakkarider. For lignin imaging, vurdere spektral toppen rundt 1600 cm -1 på grunn av den aromatiske ring symmetrisk strekk vibrasjon. For polysakkaridbilder (inkludert cellulose og hemicellulose), bruk spektraltoppen aRundt 2,889 cm -1 på grunn av CH og CH 2 strekker seg.
- Bruk delignified prøver for å generere bildene av cellulose og hemicellulose. Utfør selvmodellerende kurveoppløsning (SMCR) på de oppkjøpte spektrene for å diskriminere spektrene av cellulose og hemicellulose og å vise fordelingen av dem.
- Utfør hovedkomponentanalyse (PCA) og clustering analyse på de oppkjøpte dataene for å skille Raman spektrene fra forskjellige cellevegglag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser en oversikt over et typisk mikro-Raman-system for Raman-avbildning av en plantecellevegg. Som et eksempel har de opprinnelige Raman-spektrene av poppel ( Populus nigra L.) betydelige grunnlinjer og pigger ( figur 2a ). Etter å ha utført den automatiske forbehandlingsmetoden for Raman imaging datasett (APRI), fjernes disse to spektrale forurensningene vellykket ( figur 2b ). Et typisk Raman-spektrum av poppel er vist i figur 3 , og bandoppgavene er oppført i tabell 1 . Ramanbildet av lignin genereres ved integrasjonen av spektralområdet fra 1,550-1,650 cm -1 , som tilskrives den aromatiske ringstrukturen ( figur 4a ). Figur 4d viser Raman-bildet av polysakkarider, whDet oppnås ved å integrere toppen ved 2,889 cm -1 . Til bildecellulose og hemicellulose utføres SMCR på Raman-bildedata av en delignifisert prøve. Tilsvarende spektra og bilder er vist i figur 5 . Figur 6 presenterer resultatene oppnådd ved PCA og clustering analyse.
Figur 1: En skjematisk av Raman Imaging for Plant Cell Wall. Tverrsnittprøven (poppel som et eksempel) måles ved hjelp av et mikro-Raman-system som kobler et optisk mikroskop til et Raman høyoppløselig spektrometer med en CCD-detektor. I lysbildebildet er anleggsveggveggen organisert i cellehjørnet (CC), sammensatt midtre lamell (CML) og sekundærvegg (SW). Konvensjonelt genereres et Raman-bilde av single-peakIntegrasjon eller intensitet. To spektrale forurensninger ( dvs. basislinjedrifter og kosmiske pigger) finnes i de opprinnelige dataene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Ramanspektra før ( a ) og etter ( b ) Forbehandling av APRI. To spektrale forurensninger fjernes med hell. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Et typisk Raman Spektrum av Poplar Cell Wall. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Ramanbilder av Lignin ( a ) og Polysakkarider ( b ) i Poplar Cell Wall. Ligninbildet genereres ved å integrere toppen rundt 1600 cm -1 . Polysakkaridbildet er produsert ved å integrere toppen rundt 2,889 cm -1 . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Ramanbilder av cellulose ( a ) og hemisellulose ( b ) i populasjonscellevegg. SMCR utføres på Raman imaging data av en delignified prøve. Delignifisering bidrar til eksponeringen av spektrale egenskaper av cellulose og hemicellulose. Cellulose er for det meste konsentrert i SW, mens fordelingen av hemicellulose er nesten jevn i hele poppelcelleveggen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Resultater for PCA og Clustering Analysis for automatisk å identifisere forskjellige cellevegglag i Poplar Cell Wall. Ved å bruke PCA og clustering analyse, spektrene er delt inn i fire deler som svarer til celle lumen, CC, CML og SW. De gjennomsnittlige spektrene til disse lagene er gitt nedenfor. Resultatene viste at lignin er konsentrert langs CML og i CC, mens polysakkaridene hovedsakelig er konsentrert i SW. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Wavenumbers (cm -1 ) | komponenter | oppdrag |
| 1095 | Cellulose, hemicellulose | Tunge atom CC og CO strekker vibrasjon |
| 1123 | Cellulose, hemicellulose | Tunge atom CC og CO strekker vibrasjon |
| 1163 | Cellulose, hemicellulose </ Td> | Tunge atom CC og CO strekkvibrasjon pluss HCC og HCO bøyningsvibrasjon |
| 1275 | lignin | Aryl-O av aryl OH og aryl-O-CH3; Guaiacylring med C = O-gruppe |
| 1331 | Lignin, cellulose, hemicellulose | HCC og HCO bøye vibrasjon |
| 1378 | Cellulose, hemicellulose | HCC, HCO og HOC bøyningsvibrasjon |
| 1460 | Lignin, cellulose, hemicellulose | HCH og HOC bøyer vibrasjon |
| 1603 | lignin | Arylring som strekker seg vibrasjon, symmetrisk vibrasjon |
| 1656 | lignin | Ringkonjugert C = C strekker vibrasjon av coniferylalkohol; C = O strekker vibrasjon av coniferaldehyd |
| 2889 | C, H | CH og CH 2 strekker vibrasjon |
| L, C, H | CH strekker vibrasjon i OCH 3 asymmetrisk vibrasjon |
Tabell 1: Raman Peak-posisjoner og båndoppgaver
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Plantecellevegget er et kompositt som er organisert i flere lag, inkludert cellehjørne (CC), sekundærvegg (SW, med S1, S2 og S3-lag), og sammensatt midtre lamell (CML, midtre lamell pluss tilstøtende primær Veggen), noe som gjør det vanskelig å oppnå en flat overflate under prøvefremstilling. Således må planteprøver, spesielt gress, som har en mer komplisert struktur enn tre, ofte være størknet for å muliggjøre fin snitting. PEG er en ideell hard matrise for kutting og Raman-undersøkelse, siden den er løselig i vann. Det kan lett fjernes ved skylling med avionisert vann. PEG som brukes til å bygge inn, har forskjellige molekylvekter, varierende fra 1000 til 20.000. Jo høyere molekylvekten til PEG er, jo lavere er penetreringsevnen 10 . D 2 O vil bidra til å redusere fluorescensen av lignin og har en markert topp ved 2,490 cm -1 , men det vil ikke eliminere fluorescensforstyrrelsen. ToStore støy signaler spilles over i kanalene, sammen med de faktiske signaler: 1) prøve- og bakgrunnsfluorescens, samt termiske fluktuasjoner av CCD, kan resultere i baseline drift og 2) kosmiske stråler kan tydelig påvirke de sensitive føleren, som manifesterer seg i Spektra som smalbåndbredde. APRI-metoden ble utviklet for å løse disse problemene 11 . APRI inkluderer de adaptive iterativt reweighted straffet minimum-kvadrater (airPLS) og hovedkomponentanalysen (PCA) for å eliminere basislinjedriftene og kosmiske pigger ved å bruke spektralfunksjonene selv.
For å oppnå distribusjonsbilder bør toppintensitet / integrering og helspektra lineær montering ved multivariate metoder velges. Den førstnevnte passer til komponentene med spesifikke Raman-topper ( f.eks. Lignin), mens sistnevnte passer til komponentene med sterk spektral overlapping ( f.eks. Cellulose og hemicellulose). DistriButionbilder av lignin og polysakkarider er tilgjengelige ved å integrere de spesifikke toppene rundt 1600 cm -1 og 2,889 cm -1 , henholdsvis (figur 4). Imidlertid er bildene av cellulose og hemicellulose vanskelig å direkte generere ved toppintegrasjon på grunn av den sterke spektrale overlappingen. Multivariat analyse gjør det mulig å sortere det sammenviklede informasjonsinnholdet i henhold til hypotesen om at de opprinnelige dataene rekonstrueres fra et begrenset antall signifikante faktorer 12 . Det kan således brukes til å diskriminere sine spektra og å produsere tilsvarende Raman-bilder. For planteprøver påvirker tilstedeværelsen av ekstrakter og lignin evnen til å rekonstruere spektrene av cellulose og hemicellulose. Det er nødvendig å fjerne disse forstyrrelsene før SMCR-analysen av bildedataene. SMCR ble først introdusert av Lawton og Sylvester som en multivariate teknikk utviklet spesielt for å løse en ren komponent fRom et sett med spektra, uten bruk av et spektralbibliotek, for å analysere bildedataene 13 . Spektral klassifisering er viktig for videre forståelse av plantecellemurenes strukturelle og kjemiske natur. Her har bildedataene blitt utsatt for hovedkomponentanalyse (PCA) og clustering analyse for å skille Raman spektra fra forskjellige cellevegglag 14 .
Denne teknikken har imidlertid to begrensninger. For det første er Raman-effekten svak. Den typiske totale Raman-spredningstverrsnitt er ~ 10-29 cm 2 pr. Molekyl, noe som gjør det sårbart for intens fluorescens 15 . En mulig måte å forbedre defekten på er å forberede seksjonene så tynt som mulig og bruke en baseline korreksjonsalgoritme, men fluorescerende signaler er vanskelige å fjerne. For det andre er kjemisk behandling en signifikant prosedyre når man oppnår Raman-bilder av cellenUlose og hemicellulose, og det kan øke risikoen for å endre det opprinnelige kjemiske innholdet. Derfor er det best å fjerne ekstrakter og lignin så mye som mulig, uten at celleveggstrukturen ser for annerledes ut enn den ubehandlede.
Som konklusjon er denne protokollen egnet for å studere fordelingen av lignin, cellulose og hemicellulose i plantecellevegg. Ved å bruke Raman-bildebehandling for å oppnå ønsket informasjon er det høyt avhengig av operatørferdigheten ved prøvepreparering og dataanalyse. God prøveutarbeidelse er viktig for å samle høyverdige Raman-spektra. Passende dataanalyse gir innsikt i de store spekterene og trekker ut skjult informasjon fra bildet. Som en grunnleggende metode kan denne protokollen brukes til å spore de dynamiske endringene av hovedkomponentene under kjemisk, fysisk eller biologisk behandling på mikronivå.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Kinas ministerium for vitenskap og teknologi (2016YDF0600803) for den økonomiske støtten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtome | Thermo Scientific | Microm HM430 | |
| Confocal Raman microscope | Horiba Jobin Yvon | Xplora | |
| Oven | Shanghai ZHICHENG | ZXFD-A5040 |
References
- Gonzalo, G. D., et al.
- Rosatella, A. A., Afonso, C. A. M. Chapter 2. Ionic Liquids in the Biorefinery Concept: Challenges and Perspectives. , Wiley. 38-64 (2016).
- Sun, L., et al. Understanding tissue specific compositions of bioenergy feedstocks Through hyperspectral Raman imaging. Bio. 108 (2), 286-295 (2009).
- Tolstik, T., et al. Classification and prediction of HCC tissues by Raman imaging with identification of fatty acids as potential lipid biomarkers. J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 141 (3), 407-418 (2015).
- Schrader, B. Infrared and Raman spectroscopy: methods and applications. , John Wiley and Sons. (2008).
- Gierlinger, N., et al. Imaging of plant cell walls by confocal Raman microscopy. Nat. Protoc. 7 (9), 1694-1708 (2012).
- Luca, A. C. D., et al. Online fluorescence suppression in modulated Raman spectroscopy. Anal. Chem. 82 (2), 738-745 (2009).
- Schlücker, S., et al. Raman microspectroscopy: a comparison of point, line, and wide-field imaging methodologies. Anal. Chem. 75 (16), 4312-4318 (2003).
- Cooper, J. B. Chemometric analysis of Raman spectroscopic data for process control applications. Chemometr. Intell. Lab. Syst. 46 (2), 231-247 (1999).
- Cheng, H. J., Hsiau, S. S. The study of granular agglomeration mechanism. Powder Technol. 199 (3), 272-283 (2010).
- Zhang, X., et al. Method for removing spectral contaminants to improve analysis of Raman imaging data. Sci. Rep. 6, 39891 (2016).
- Shinzawa, H., et al. Multivariate data analysis for Raman spectroscopic imaging. J. Raman Spectrosc. 40 (12), 1720-1725 (2009).
- Lawton, W. H., Sylvestre, E. A. Self modeling curve resolution. Technometrics. 13, 617-633 (1971).
- Zhang, X., et al. Method for automatically identifying spectra of different wood cell wall layers in Raman imaging data set. Anal. Chem. 87 (2), 1344-1350 (2015).
- Kudelski, A. Analytical application of Raman spectroscopy. Talanta. 76 (1), 1-8 (2008).
