Summary
Ce protocole vise à présenter une méthode générale pour visualiser la lignine, la cellulose et l'hémicellulose dans les parois des cellules végétales en utilisant l'imagerie Raman et l'analyse multivariée.
Abstract
L'application de l'imagerie Raman à la biomasse végétale augmente car elle peut offrir des informations spatiales et de composition sur des solutions aqueuses. L'analyse ne nécessite généralement pas une préparation approfondie des échantillons; Des informations structurelles et chimiques peuvent être obtenues sans étiquetage. Cependant, chaque image Raman contient des milliers de spectres; Cela soulève des difficultés lors de l'extraction d'informations cachées, en particulier pour les composants ayant des structures chimiques similaires. Ce travail présente une analyse multivariée pour résoudre ce problème. Le protocole établit une méthode générale pour visualiser les principaux composants, y compris la lignine, la cellulose et l'hémicellulose dans la paroi cellulaire de la plante. Dans ce protocole, des procédures pour la préparation des échantillons, l'acquisition spectrale et le traitement des données sont décrites. Il dépend fortement des compétences de l'opérateur lors de la préparation des échantillons et de l'analyse des données. En utilisant cette approche, une enquête Raman peut être effectuée par un utilisateur non spécialisé pour acquérirDonnées de qualité h et résultats significatifs pour l'analyse de la paroi cellulaire végétale.
Protocol
1. Préparation de l'échantillon
- Couper un petit bloc de tissu (environ 3 mm x 3 mm x 5 mm) de l'échantillon de la plante ( p. Ex. Une tige de peuplier).
- Immerger le tissu dans de l'eau désionisée bouillante pendant 30 min. Immédiatement, transférez-le à de l'eau désionisée à température ambiante (RT) pendant 30 minutes. Répétez cette étape jusqu'à ce que le tissu s'enfonce au fond du conteneur, ce qui indique que l'air dans le tissu a été enlevé et que le tissu a été ramolli.
Remarque: Pour les échantillons qui tombent au bas avant cette étape, répétez généralement ce cycle de 3 à 5 fois. - Préparez des portions aliquotes de 20, 50, 70, 90% (v / v) de polyéthylène glycol (PEG) dans de l'eau désionisée, ainsi que du PEG pur, et conservez les solutions à 65 ° C.
- Incuber le tissu dans une série de bains PEG gradués pour déplacer l'eau et permettre au PEG de s'infiltrer.
Remarque: Généralement, le PEG avec un poids moléculaire 2 000 (PEG2000) est utilisé pour l'encastrement.- Traiter le tissu avec gPEG radié dans un four à sécher comme suit: (a) 20% de PEG pendant 1 h, (b) 50% de PEG pendant 1,5 h, (c) 70% de PEG pendant 2 h, (d) 90% de PEG pendant 2 h et (E) 100% de PEG pendant 10 h.
- Préchauffer une cassette à 65 ° C dans un four. Versez le PEG contenant le bloc dans la cassette, puis placez le bloc de tissu dans une position désirée en utilisant des pinces ou des aiguilles préchauffées.
- Ralentir lentement la cassette et ranger le tissu à la température ambiante jusqu'à ce qu'il soit utilisé.
- Dissectionnez le bloc PEG contenant le tissu cible dans un petit bloc (environ 1 cm x 1 cm x 2 cm) à l'aide d'une lame de rasoir pointue et montez-le sur le microtome.
- Couper les sections minces du bloc PEG (généralement 3-10 μm).
- Rincez la section avec de l'eau désionisée dans un verre de montre 10 fois pour enlever le PEG du tissu.
- Immergez les sections avec du toluène / éthanol (2: 1, v / v) pendant 6 h pour éliminer les extraits. Préparer le liquide de réaction en mélangeant 65 ml d'eau désionisée, 0,5 ml d'acide acétique et 0,6 g de sodium chloRite dans un bécher. Ajouter une section et 3 mL de liquide de réaction dans un flacon de 5 mL. Vissez le dessus du flacon.
- Chauffer le flacon dans un bain d'eau à 75 ° C pendant 2 h pour éliminer la lignine du tissu. Rincer la section avec de l'eau désionisée dans un verre de montre 10 fois.
- Transférez la section non traitée / délignifiée vers une lame de microscope en verre. Déployez la section avec soin à l'aide de brosses ou d'aiguilles. Enlevez l'eau désionisée supplémentaire avec du papier de soie.
- Immergez la section dans D 2 O. Couvrez l'échantillon avec un couvercle de verre. Sceller le capot avec un vernis à ongles pour éviter l'évaporation du D 2 O.
2. Acquisition spectrale
- Ouvrez le logiciel d'exploitation des instruments du microscope Raman confocal. Allumez le laser (longueur d'onde = 532 nm), concentrez-vous sur la surface du silicium cristallin avec un objectif de microscope 100X et cliquez sur le bouton d'étalonnage pour étalonner l'instrument.
- Basculer l'instrumentAu mode microscope optique et allumez la lampe au microscope. Montez la glissière du microscope sur la scène, avec le patin de recouvrement face à l'objectif.
- Voir l'échantillon avec un objectif de microscope 20X et localiser la zone d'intérêt. Appliquer de l'huile d'immersion sur la lamelle et passer à l'objectif microscope immersion (60X, ouverture numérique NA = 1,35). Concentrez-vous sur la surface de l'échantillon.
- Passez l'instrument au mode de test Raman et éteignez la lampe du microscope.
- Choisissez une zone de mappage en utilisant un outil rectangulaire. Modifiez la taille des étapes pour déterminer le nombre de spectres obtenus.
Remarque: soyez conscient de la taille des étapes (généralement plus grand que le diamètre de la tache calculé par l'ouverture numérique de l'objectif, théoriquement 1,22λ / NA). Les tailles ci-dessous entraîneront un suréchantillonnage. - Définissez les paramètres spectral optimum pour obtenir le meilleur rapport signal / bruit (SNR) et la qualité spectrale dans un temps d'acquisition approprié (généralement <8 h), depeEn fonction de l'adéquation de l'échantillon. En général, entrez les paramètres d'imagerie dans le logiciel de l'instrument comme suit: laser (532 nm), filtre (100%), trou (300), fente (100), spectromètre (1,840 cm -1 ), rainures (1200t), objectif ( Huile 60X) et le temps d'acquisition (2 s).
- Enregistrez les données spectrales avant le traitement des données et convertissez-les dans un format universel ( p. Ex. Fichiers TXT).
3. Analyse des données
- Chargez les données spectrales (fichiers TXT) dans le logiciel d'analyse de données ( par exemple, Matlab). Appliquer une technique de réduction du bruit sur l'ensemble de données pour améliorer le SNR ( par exemple, l'algorithme Savitzsky-Golay ou l'algorithme wavelet)
- Utilisez des échantillons non traités pour produire les images de lignine et de polysaccharides. Pour l'imagerie lignine, considérez le pic spectral autour de 1 600 cm -1 en raison de la vibration d'étirage symétrique du cycle aromatique. Pour l'imagerie polysaccharidique (y compris la cellulose et l'hémicellulose), utiliser le pic spectral aRond de 2.889 cm -1 à cause des tronçons CH et CH 2 .
- Utiliser des échantillons délimités pour générer les images de cellulose et d'hémicellulose. Effectuez une résolution de courbe auto-modélisante (SMCR) sur les spectres acquis pour discriminer les spectres de cellulose et d'hémicellulose et d'image de leurs distributions.
- Effectuer l'analyse des composants principaux (PCA) et l'analyse de clustering sur les données acquises pour distinguer les spectres Raman des différentes couches de paroi cellulaire.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La figure 1 présente un aperçu d'un système typique de micro-Raman pour l'imagerie Raman d'une paroi cellulaire végétale. À titre d'exemple, les spectres Raman originaux du peuplier ( Populus nigra L.) ont des dérives et des pointes de base significatives ( Figure 2a ). Après avoir effectué la méthode de prétraitement automatique pour le jeu de données d'imagerie Raman (APRI), ces deux contaminants spectrales sont éliminés avec succès ( figure 2b ). Un spectre Raman typique de peuplier est affiché à la Figure 3 , et ses assignations de bande sont listées dans le Tableau 1 . L'image Raman de la lignine est générée par l'intégration de la région spectrale de 1.550-1.650 cm -1 , ce qui est attribué à la structure des anneaux aromatiques ( Figure 4a ). La figure 4d montre l'image Raman des polysaccharides, whCeci est obtenu en intégrant le pic à 2.889 cm -1 . Pour l'image de la cellulose et de l'hémicellulose, le SMCR est réalisé sur les données d'imagerie Raman d'un échantillon délignifié. Les spectres et images correspondants sont représentés sur la figure 5 . La figure 6 présente les résultats obtenus par PCA et l'analyse de clustering.
Figure 1: un schéma de l'imagerie Raman pour le mur cellulaire végétal. L'échantillon de section transversale (peuplier par exemple) est mesuré par un système micro-Raman qui couple un microscope optique à un spectromètre haute résolution Raman avec un détecteur de dispositif à couplage de charge (CCD). Dans l'image en champ lumineux, la paroi de la cellule de la plante est organisée dans le coin de la cellule (CC), la lamelle intermédiaire composée (CML) et la paroi secondaire (SW). D'une manière conventionnelle, une image Raman est générée par un seul picIntégration ou intensité. Deux contaminants spectrales ( c.-à-d. Dérives de base et pointes cosmiques) se trouvent dans les données d'origine. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: The Raman Spectra Before ( a ) et After ( b ) Prétraitement par APRI. Deux contaminants spectraux sont éliminés avec succès. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Un spectre Raman typique du mur cellulaire du peuplier. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: Images Raman de Lignine ( a ) et Polysaccharides ( b ) dans le Mur de Poplar Cell. L'image de lignine est générée en intégrant le pic d'environ 1 600 cm -1 . L'image du polysaccharide est produite en intégrant le pic d'environ 2 899 cm -1 . Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5: Images Raman de Cellulose ( a ) et Hemicellulose ( b ) dans le Mur de Poplar Cell. SMCR est effectué sur les données d'imagerie Raman d'un échantillon délignifié. La délignification contribue à l'exposition des caractéristiques spectrales de la cellulose et de l'hémicellulose. La cellulose est principalement concentrée dans le SW, tandis que la distribution de l'hémicellulose est presque uniforme dans toute la paroi cellulaire du peuplier. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6: résultats de l'analyse PCA et de clustering pour identifier automatiquement différentes couches de cellules dans le mur de la cellule de peuplier. En utilisant PCA et l'analyse de clustering, les spectres sont divisés en quatre parties correspondant à la lumière cellulaire, CC, CML et SW. Les spectres moyens de ces couches sont donnés ci-dessous. Les résultats ont révélé que la lignine est concentrée le long de la LMC et dans le CC, tandis que les polysaccharides sont principalement concentrés dans le SW. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Wavenumbers (cm -1 ) | Composants | Affectations |
| 1 095 | Cellulose, hémicellulose | Vibration d'étirement de CC et de CO atomes lourds |
| 1,123 | Cellulose, hémicellulose | Vibration d'étirement de CC et de CO atomes lourds |
| 1 163 | Cellulose, Hemicellulose </ Td> | Vibration d'étirement CC et CO2 accrue, plus HCC et vibrations de flexion HCO |
| 1 235 | Lignine | Aryl-O d'aryle OH et aryl O-CH3; Anneau de guaiacyle avec groupe C = O |
| 1.331 | Lignine, cellulose, hémicellulose | HCC et vibrations de flexion HCO |
| 1 378 | Cellulose, hémicellulose | HCC, HCO et vibrations de flexion HOC |
| 1 460 | Lignine, cellulose, hémicellulose | Vibration de flexion HCH et HOC |
| 1.603 | Lignine | Vibrations d'étirement en anneau aryle, vibration symétrique |
| 1,656 | Lignine | Cycle conjugué C = C étirement des vibrations d'alcool coniféryle; C = O vibration d'étirement du coniféraldehyde |
| 2.889 | C, H | CH et CH 2 étirement des vibrations |
| L, C, H | CH étirement des vibrations dans les vibrations asymétriques OCH 3 |
Tableau 1: Positions de Raman et affectations de bande
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La paroi de la cellule végétale est composée en plusieurs couches, y compris le coin cellulaire (CC), la paroi secondaire (SW, avec les couches S1, S2 et S3) et les lamelles intermédiaires composées (LML, la lamelle intermédiaire plus la primaire adjacente Mur), ce qui rend difficile l'obtention d'une surface plane lors de la préparation de l'échantillon. Ainsi, les échantillons de plantes, en particulier l'herbe, qui ont une structure plus compliquée que le bois, doivent souvent être solidifiés pour permettre une coupe fine. Le PEG est une matrice rigide idéale pour la coupe et l'étude Raman, car elle est soluble dans l'eau. Il peut être facilement éliminé par rinçage avec de l'eau désionisée. Le PEG utilisé pour l'incorporation a des poids moléculaires différents, variant de 1 000 à 20 000. Plus le poids moléculaire du PEG est élevé, plus la capacité de pénétration 10 est faible. D 2 O aidera à réduire la fluorescence de la lignine et a un pic marqué à 2 490 cm -1 , mais il n'éliminera pas les interférences de fluorescence. DeuxLes signaux de bruit majeurs se répandent dans les canaux, ainsi que les signaux réels: 1) la fluorescence d'échantillon et de fond, ainsi que les fluctuations thermiques du CCD, peuvent entraîner des dérives de base et 2) les rayons cosmiques peuvent affecter de manière marquée les détecteurs sensibles qui se manifestent Spectres comme pointes à large bande passante. La méthode APRI a été élaborée pour résoudre ces problèmes 11 . L'APRI inclut les plis pénalisés répréhensibles (airPLS) et l'analyse des composants principaux (PCA) adaptative pour éliminer les dérives de base et les pointes cosmiques en utilisant les caractéristiques spectrales elles-mêmes.
Pour obtenir des images de distribution, il faut sélectionner l'intensité / l'intégration du pic et l'ajustement linéaire des spectres complets par des méthodes multivariées. Le premier convient aux composants avec des pics spécifiques de Raman ( p. Ex., La lignine), tandis que le dernier est approprié pour les composants avec un fort chevauchement spectral ( par exemple, la cellulose et l'hémicellulose). La distributionDes images de lignine et de polysaccharides sont disponibles en intégrant les pics spécifiques d'environ 1 600 cm -1 et de 2,889 cm -1 , respectivement (figure 4). Cependant, les images de cellulose et d'hémicellulose sont difficiles à générer directement par intégration de pointe en raison du fort chevauchement spectral. L'analyse multivariée permet de trier le contenu d'information compliqué en fonction de l'hypothèse selon laquelle les données originales sont reconstruites à partir d'un nombre limité de facteurs importants 12 . Il peut donc être appliqué pour discriminer leurs spectres et produire des images Raman correspondantes. Pour les échantillons de plantes, la présence d'extraits et de lignine interfère avec la capacité de reconstruire les spectres de cellulose et d'hémicellulose. Il est nécessaire de supprimer ces interférences avant l'analyse SMCR des données d'imagerie. SMCR a d'abord été introduit par Lawton et Sylvester comme une technique multivariée développée spécifiquement pour résoudre un composant pur fUn ensemble de spectres, sans recours à une bibliothèque spectrale, pour analyser les données d'imagerie 13 . La classification spectrale est importante pour mieux comprendre la nature structurelle et chimique de la paroi cellulaire de la plante. Ici, les données d'imagerie ont été soumises à l'analyse des composantes principales (PCA) et à l'analyse de clustering pour distinguer les spectres Raman des différentes couches de paroi cellulaire 14 .
Cependant, cette technique a deux limites. Tout d'abord, l'effet Raman est faible: la section de diffusion Raman totale typique est de ~ 10 -29 cm 2 par molécule, ce qui la rend vulnérable à une fluorescence intense 15 . Un moyen possible d'améliorer le défaut consiste à préparer les sections aussi rapidement que possible et à appliquer un algorithme de correction de base, mais les signaux fluorescents sont difficiles à éliminer. Deuxièmement, le traitement chimique est une procédure importante lors de la réalisation des images Raman de cellulesL'ulose et l'hémicellulose, et cela peut augmenter le risque de changer le contenu chimique d'origine. Par conséquent, il est préférable d'éliminer autant que possible les extractifs et la lignine, sans que la structure de la paroi cellulaire ne soit trop différente de celle non traitée.
En conclusion, ce protocole convient à l'étude de la distribution de la lignine, de la cellulose et de l'hémicellulose dans la paroi cellulaire de la plante. L'utilisation de l'imagerie Raman pour obtenir l'information souhaitée dépend fortement de la compétence de l'opérateur lors de la préparation de l'échantillon et de l'analyse des données. Une bonne préparation des échantillons est essentielle pour collecter des spectres Raman de haute qualité. Une analyse appropriée des données donne un aperçu des spectres à grande échelle et extrait les informations cachées de l'image. En tant que méthode fondamentale, ce protocole peut être utilisé pour tracer les changements dynamiques des composants majeurs pendant le traitement chimique, physique ou biologique au micro-niveau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Nous remercions le ministère chinois de la Science et de la Technologie (2016YDF0600803) pour le soutien financier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtome | Thermo Scientific | Microm HM430 | |
| Confocal Raman microscope | Horiba Jobin Yvon | Xplora | |
| Oven | Shanghai ZHICHENG | ZXFD-A5040 |
References
- Gonzalo, G. D., et al.
- Rosatella, A. A., Afonso, C. A. M. Chapter 2. Ionic Liquids in the Biorefinery Concept: Challenges and Perspectives. , Wiley. 38-64 (2016).
- Sun, L., et al. Understanding tissue specific compositions of bioenergy feedstocks Through hyperspectral Raman imaging. Bio. 108 (2), 286-295 (2009).
- Tolstik, T., et al. Classification and prediction of HCC tissues by Raman imaging with identification of fatty acids as potential lipid biomarkers. J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 141 (3), 407-418 (2015).
- Schrader, B. Infrared and Raman spectroscopy: methods and applications. , John Wiley and Sons. (2008).
- Gierlinger, N., et al. Imaging of plant cell walls by confocal Raman microscopy. Nat. Protoc. 7 (9), 1694-1708 (2012).
- Luca, A. C. D., et al. Online fluorescence suppression in modulated Raman spectroscopy. Anal. Chem. 82 (2), 738-745 (2009).
- Schlücker, S., et al. Raman microspectroscopy: a comparison of point, line, and wide-field imaging methodologies. Anal. Chem. 75 (16), 4312-4318 (2003).
- Cooper, J. B. Chemometric analysis of Raman spectroscopic data for process control applications. Chemometr. Intell. Lab. Syst. 46 (2), 231-247 (1999).
- Cheng, H. J., Hsiau, S. S. The study of granular agglomeration mechanism. Powder Technol. 199 (3), 272-283 (2010).
- Zhang, X., et al. Method for removing spectral contaminants to improve analysis of Raman imaging data. Sci. Rep. 6, 39891 (2016).
- Shinzawa, H., et al. Multivariate data analysis for Raman spectroscopic imaging. J. Raman Spectrosc. 40 (12), 1720-1725 (2009).
- Lawton, W. H., Sylvestre, E. A. Self modeling curve resolution. Technometrics. 13, 617-633 (1971).
- Zhang, X., et al. Method for automatically identifying spectra of different wood cell wall layers in Raman imaging data set. Anal. Chem. 87 (2), 1344-1350 (2015).
- Kudelski, A. Analytical application of Raman spectroscopy. Talanta. 76 (1), 1-8 (2008).
