Summary
Este protocolo visa apresentar um método geral para visualizar lignina, celulose e hemicelulose em paredes celulares de plantas usando imagem de Raman e análise multivariada.
Abstract
A aplicação da imagem de Raman para planta de biomassa está aumentando porque pode oferecer informações espaciais e de composição sobre soluções aquosas. A análise geralmente não requer preparação extensiva de amostras; As informações estruturais e químicas podem ser obtidas sem rotulagem. No entanto, cada imagem Raman contém milhares de espectros; Isso levanta dificuldades ao extrair informações ocultas, especialmente para componentes com estruturas químicas semelhantes. Este trabalho apresenta uma análise multivariada para resolver esta questão. O protocolo estabelece um método geral para visualizar os principais componentes, incluindo lignina, celulose e hemicelulose dentro da parede celular da planta. Neste protocolo, são descritos os procedimentos para preparação de amostras, aquisição espectral e processamento de dados. É altamente dependente da habilidade do operador na preparação da amostra e análise de dados. Ao usar essa abordagem, uma investigação Raman pode ser realizada por um usuário não especialista para adquirirDados de qualidade h e resultados significativos para análise de parede celular vegetal.
Protocol
1. Preparação da amostra
- Corte um pequeno bloco de tecido (cerca de 3 mm x 3 mm x 5 mm) da amostra da planta ( por exemplo, uma haste de álamo).
- Mergulhe o tecido em água desionizada fervente durante 30 min. Imediatamente transferi-lo para água desionizada à temperatura ambiente (RT) durante 30 min. Repita este passo até o tecido escorrer no fundo do recipiente, indicando que o ar no tecido foi removido e que o tecido se amaciou.
Nota: Para as amostras que afundam no fundo antes desta etapa, geralmente repita este ciclo 3-5 vezes. - Prepare as alíquotas 20, 50, 70, 90% (v / v) de polietileno glicol (PEG) em água desionizada, bem como PEG puro e mantenha as soluções a 65 ° C.
- Incube o tecido em uma série de banhos graduados de PEG para deslocar a água e permitir que o PEG se infiltre.
Nota: Tipicamente, PEG com um peso molecular de 2.000 (PEG2000) é usado para incorporação.- Processar o tecido com gPEG radiado num forno de secagem da seguinte forma: (a) 20% de PEG durante 1 h, (b) 50% de PEG durante 1,5 h, (c) 70% de PEG durante 2 h, (d) 90% de PEG durante 2 h e (E) 100% de PEG por 10 h.
- Pré-aqueça uma cassete a 65 ° C no forno. Despeje o PEG que contém o bloco na cassete e, em seguida, coloque o bloco de tecido em uma posição desejada usando pinças pré-aquecidas ou agulhas.
- Lixar lentamente a cassete e armazenar o tecido à TA até o uso.
- Disseca o bloco de PEG contendo o tecido alvo em um pequeno bloco (cerca de 1 cm x 1 cm x 2 cm) usando uma lâmina afiada e montá-lo no microtomo.
- Corte seções finas do bloco PEG (tipicamente 3-10 μm).
- Enxague a seção com água desionizada em um vidro de relógio 10 vezes para remover o PEG do tecido.
- Mergulhe as secções com tolueno / etanol (2: 1, v / v) durante 6 h para remover os extrativos. Prepare o líquido de reação misturando 65 mL de água desionizada, 0,5 mL de ácido acético e 0,6 g de chlo de sódioRito em um copo. Adicione uma seção e 3 mL de líquido de reação a um frasco de 5 mL. Aperte o topo do frasco.
- Aqueça o frasco em banho-maria a 75 ° C durante 2 h para remover a lignina do tecido. Enxague a seção com água desionizada em um vidro de relógio 10 vezes.
- Transfira a seção não tratada / desligada para uma lâmina de microscópio de vidro. Desdobre a seção com cuidado usando escovas ou agulhas. Remova a água extra desionizada com papel de seda.
- Mergulhe a seção em D 2 O. Cubra a amostra com uma cobertura de vidro. Selar a tampa com esmalte para evitar a evaporação do D 2 O.
2. Aquisição espectral
- Abra o software de operação do instrumento do microscópio Raman confocal. Ligue o laser (comprimento de onda = 532 nm), foco na superfície do silício cristalino com um objetivo de microscópio 100X e clique no botão de calibração para calibrar o instrumento.
- Mude o instrumentoPara o modo microscópio óptico e acenda a lâmpada do microscópio. Monte o escorredor do microscópio no palco, com a tampa deslizante voltada para o objetivo.
- Veja a amostra com um objetivo de microscópio 20X e localize a área de interesse. Aplique óleo de imersão na lamínula e mude para o objetivo do microscópio de imersão (60X, abertura numérica NA = 1.35). Concentre-se na superfície da amostra.
- Mude o instrumento para o modo de teste Raman e desligue a lâmpada do microscópio.
- Escolha uma área de mapeamento usando uma ferramenta retangular. Altere o tamanho do passo para determinar o número de espectros obtidos.
Nota: Esteja ciente do tamanho do passo (geralmente maior do que o diâmetro do ponto calculado pela abertura numérica do objetivo, teoricamente 1,22λ / NA). Tamanhos abaixo disso resultarão em oversampling. - Defina os parâmetros espectrais ótimos para obter a melhor relação sinal-ruído (SNR) e qualidade espectral em um tempo de aquisição apropriado (geralmente <8 h), depeCom base na adequação da amostra. Em geral, insira os parâmetros de imagem no software do instrumento da seguinte forma: laser (532 nm), filtro (100%), furo (300), fenda (100), espectrômetro (1.840 cm -1 ), sulcos (1200t), objetivo ( Óleo 60X) e tempo de aquisição (2 s).
- Salve os dados espectrales antes do processamento de dados e converta-os em um formato universal ( por exemplo, arquivos TXT).
3. Análise de dados
- Carregue os dados espectrales (arquivos TXT) no software de análise de dados ( por exemplo, Matlab). Aplique uma técnica de redução de ruído no conjunto de dados para melhorar o SNR ( por exemplo, o algoritmo Savitzsky-Golay ou o algoritmo wavelet)
- Use amostras não tratadas para produzir imagens de lignina e polissacarídeos. Para a imagem de lignina, considere o pico espectral em torno de 1.600 cm -1 devido à vibração de alongamento simétrica do anel aromático. Para imagens de polissacarídeos (incluindo celulose e hemicelulose), use o pico espectral aRodada 2.889 cm -1 por causa dos trechos CH e CH 2 .
- Use amostras deslocadas para gerar imagens de celulose e hemicelulose. Execute a resolução da curva de auto-modelagem (SMCR) nos espectros adquiridos para discriminar os espectros de celulose e hemicelulose e para a imagem de suas distribuições.
- Execute análise de componentes principais (PCA) e análise de agrupamento nos dados adquiridos para distinguir os espectros Raman de camadas de parede celular diferentes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A Figura 1 apresenta uma visão geral de um sistema típico de micro-Raman para a imagem de Raman de uma parede celular de planta. Por exemplo, os espectros de Raman originais do álamo ( Populus nigra L.) têm derivações e espigas de linha de base significativas ( Figura 2a ). Depois de executar o método de pré-processamento automático para o conjunto de dados de imagem Raman (APRI), esses dois contaminantes espectrales são removidos com sucesso ( Figura 2b ). Um espectro Raman típico de álamo é exibido na Figura 3 , e suas atribuições de banda estão listadas na Tabela 1 . A imagem Raman da lignina é gerada pela integração da região espectral de 1.550-1.650 cm -1 , o que é atribuído à estrutura do anel aromático ( Figura 4a ). A Figura 4d exibe a imagem Raman de polissacarídeos, whIsto é conseguido integrando o pico a 2.889 cm -1 . Para imagem de celulose e hemicelulose, o SMCR é realizado nos dados de imagem Raman de uma amostra desligada. Os espectros e imagens correspondentes são mostrados na Figura 5 . A Figura 6 apresenta os resultados obtidos pela PCA e análise de agrupamento.
Figura 1: Esquema da Imagem Raman para o Mural da Planta. A amostra de seção transversal (álamo como exemplo) é medida por um sistema micro-Raman que combina um microscópio óptico com um espectrômetro Raman de alta resolução com um detector de dispositivo acoplado a carga (CCD). Na imagem de campo brilhante, a parede celular da planta é organizada no canto da célula (CC), lamela intermediária composta (CML) e parede secundária (SW). Convencionalmente, uma imagem Raman é gerada por um único picoIntegração ou intensidade. Dois contaminantes espectrales ( ou seja, derivações basais e picos cósmicos) são encontrados nos dados originais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: The Raman Spectra Before ( a ) e After ( b ) Pré-processamento por APRI. Dois contaminantes espectrales são removidos com sucesso. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Um Espectro Raman típico da parede celular de álamo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imagens Raman de Lignina ( a ) e Polissacarídeos ( b ) dentro do Muro da Pilha de Álamo. A imagem de lignina é gerada integrando o pico em torno de 1.600 cm -1 . A imagem de polissacarídeo é produzida integrando o pico em torno de 2.889 cm -1 . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Imagens Raman de Celulose ( a ) e Hemicelulose ( b ) dentro da Parede Celular. O SMCR é realizado nos dados de imagem Raman de uma amostra desligada. A designificação contribui para a exposição das características espectrais da celulose e da hemicelulose. A celulose é concentrada principalmente no SW, enquanto a distribuição da hemicelulose é quase uniforme em toda a parede celular do álamo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Resultados de Análise PCA e Clustering para Identificação Automática de Diferentes Camadas de Parede Celular no Muro da Cata de Álamo. Usando PCA e análise de agrupamento, os espectros são divididos em quatro partes correspondentes ao lúmen celular, CC, CML e SW. Os espectros médios dessas camadas são dados abaixo. Os resultados revelaram que a lignina é concentrada ao longo da CML e no CC, enquanto os polissacarídeos são concentrados principalmente no SW. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Wavenumbers (cm -1 ) | Componentes | atribuições |
| 1.095 | Celulose, Hemicelulose | Átomo pesado CC e vibração de alongamento de CO |
| 1.123 | Celulose, Hemicelulose | Átomo pesado CC e vibração de alongamento de CO |
| 1.163 | Celulose, Hemicelulose </ Td> | Átomo pesado CC e vibração de alongamento de CO mais vibração de flexão de HCC e HCO |
| 1.275 | Lignina | Aril-O de aril OH e aril O-CH3; Anel de guaiacil com grupo C = O |
| 1.331 | Lignina, Celulose, Hemicelulose | HCC e HCO flexão vibração |
| 1.378 | Celulose, Hemicelulose | HCC, HCO e vibração de flexão HOC |
| 1.460 | Lignina, Celulose, Hemicelulose | HCH e HOC vibração de flexão |
| 1.603 | Lignina | Anel de arilo vibração de alongamento, vibração simétrica |
| 1.656 | Lignina | Anel conjugado C = C vibração de estiramento de álcool coniferílico; C = O vibração de estiramento de coniferaldeído |
| 2.889 | CH | Vibração de alongamento CH e CH 2 |
| L, C, H | Vibração de alongamento CH em vibração assimétrica OCH 3 |
Tabela 1: Posições máximas de Raman e atribuições de banda
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A parede celular da planta é um composto que é organizado em várias camadas, incluindo o canto da célula (CC), a parede secundária (SW, com as camadas S1, S2 e S3) e a lamela intermediária composta (LMC, lamela média mais a primária adjacente Parede), o que dificulta a obtenção de uma superfície plana durante a preparação da amostra. Assim, as amostras de plantas, especialmente a grama, que tem uma estrutura mais complicada do que a madeira, muitas vezes precisam ser solidificadas para permitir a separação fina. O PEG é uma matriz rígida ideal para o corte e a investigação Raman, uma vez que é solúvel em água. Pode ser facilmente removido por enxaguamento com água desionizada. O PEG usado para incorporação tem diferentes pesos moleculares, variando de 1.000 a 20.000. Quanto maior o peso molecular do PEG, menor será a capacidade de penetração 10 . D 2 O ajudará a reduzir a fluorescência da lignina e tem um pico marcado a 2.490 cm -1 , mas não eliminará a interferência de fluorescência. DoisOs principais sinais de ruído se espalham para os canais, juntamente com os sinais reais: 1) fluorescência de amostra e de fundo, bem como flutuações térmicas do CCD, podem resultar em derivações de linha de base e 2) os raios cósmicos podem afetar de forma marcante os detectores sensíveis, que se manifestam em Espectros como picos de banda estreita. O método APRI foi desenvolvido para abordar essas questões 11 . A APRI inclui os quadradinhos penalizados (airPLS) e a análise de componentes principais (PCA), adequados e repensados de modo iterativo, para eliminar as derivações basais e os pontos cósmicos usando os próprios recursos espectrales.
Para obter imagens de distribuição, deve-se selecionar a intensidade / integração do pico e a adaptação linear por espectro completo por métodos multivariados. O primeiro é adequado para os componentes com picos Raman específicos ( por exemplo, lignina), enquanto o último é apropriado para os componentes com forte sobreposição espectral ( por exemplo, celulose e hemicelulose). A distribuiçãoAs imagens de lignina e polissacarídeos estão disponíveis integrando os picos específicos em torno de 1.600 cm -1 e 2.889 cm -1 , respectivamente (Figura 4). No entanto, as imagens de celulose e hemicelulose são difíceis de gerar diretamente pela integração do pico devido à forte sobreposição espectral. A análise multivariada permite que o conteúdo de informações enroladas seja ordenado de acordo com a hipótese de que os dados originais são reconstruídos a partir de um número limitado de fatores significativos 12 . Isso pode ser aplicado para discriminar seus espectros e produzir imagens Raman correspondentes. Para amostras de plantas, a presença de extractivos e lignina interfere na capacidade de reconstruir os espectros de celulose e hemicelulose. É necessário remover essas interferências antes da análise SMCR dos dados de imagem. O SMCR foi introduzido pela primeira vez por Lawton e Sylvester como uma técnica multivariada desenvolvida especificamente para resolver um componente puro fRom um conjunto de espectros, sem qualquer recurso a uma biblioteca espectral, para analisar os dados de imagem 13 . A classificação espectral é importante para uma maior compreensão da natureza estrutural e química da parede celular da planta. Aqui, os dados de imagem foram submetidos à análise de componentes principais (PCA) e análise de agrupamento para distinguir os espectros de Raman de diferentes camadas de parede celular 14 .
No entanto, esta técnica tem duas limitações. Primeiro, o efeito Raman é fraco - a seção transversal típica de espalhamento Raman é ~ 10 -29 cm 2 por molécula - o que o torna vulnerável a fluorescência intensa 15 . Uma possível maneira de melhorar o defeito é preparando as seções o mais finamente possível e aplicando um algoritmo de correção de linha de base, mas os sinais fluorescentes são difíceis de remover. Em segundo lugar, o tratamento químico é um procedimento significativo ao alcançar imagens Raman de célulasUlose e hemicelulose, e pode aumentar o risco de alterar o conteúdo químico original. Portanto, é melhor remover os extrativos e a lignina o máximo possível, sem que a estrutura da parede celular seja muito diferente da não tratada.
Em conclusão, este protocolo é adequado para estudar a distribuição de lignina, celulose e hemicelulose dentro da parede celular da planta. Usar a imagem de Raman para obter a informação desejada é altamente dependente da habilidade do operador na preparação da amostra e na análise de dados. A boa preparação da amostra é essencial para coletar espectros Raman de alta qualidade. A análise apropriada de dados fornece informações sobre os espectros de grande escala e extrai a informação escondida da imagem. Como método fundamental, este protocolo pode ser usado para rastrear as mudanças dinâmicas dos principais componentes durante o tratamento químico, físico ou biológico no nível micro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos ao Ministério da Ciência e Tecnologia da China (2016YDF0600803) o apoio financeiro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtome | Thermo Scientific | Microm HM430 | |
| Confocal Raman microscope | Horiba Jobin Yvon | Xplora | |
| Oven | Shanghai ZHICHENG | ZXFD-A5040 |
References
- Gonzalo, G. D., et al.
- Rosatella, A. A., Afonso, C. A. M. Chapter 2. Ionic Liquids in the Biorefinery Concept: Challenges and Perspectives. , Wiley. 38-64 (2016).
- Sun, L., et al. Understanding tissue specific compositions of bioenergy feedstocks Through hyperspectral Raman imaging. Bio. 108 (2), 286-295 (2009).
- Tolstik, T., et al. Classification and prediction of HCC tissues by Raman imaging with identification of fatty acids as potential lipid biomarkers. J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 141 (3), 407-418 (2015).
- Schrader, B. Infrared and Raman spectroscopy: methods and applications. , John Wiley and Sons. (2008).
- Gierlinger, N., et al. Imaging of plant cell walls by confocal Raman microscopy. Nat. Protoc. 7 (9), 1694-1708 (2012).
- Luca, A. C. D., et al. Online fluorescence suppression in modulated Raman spectroscopy. Anal. Chem. 82 (2), 738-745 (2009).
- Schlücker, S., et al. Raman microspectroscopy: a comparison of point, line, and wide-field imaging methodologies. Anal. Chem. 75 (16), 4312-4318 (2003).
- Cooper, J. B. Chemometric analysis of Raman spectroscopic data for process control applications. Chemometr. Intell. Lab. Syst. 46 (2), 231-247 (1999).
- Cheng, H. J., Hsiau, S. S. The study of granular agglomeration mechanism. Powder Technol. 199 (3), 272-283 (2010).
- Zhang, X., et al. Method for removing spectral contaminants to improve analysis of Raman imaging data. Sci. Rep. 6, 39891 (2016).
- Shinzawa, H., et al. Multivariate data analysis for Raman spectroscopic imaging. J. Raman Spectrosc. 40 (12), 1720-1725 (2009).
- Lawton, W. H., Sylvestre, E. A. Self modeling curve resolution. Technometrics. 13, 617-633 (1971).
- Zhang, X., et al. Method for automatically identifying spectra of different wood cell wall layers in Raman imaging data set. Anal. Chem. 87 (2), 1344-1350 (2015).
- Kudelski, A. Analytical application of Raman spectroscopy. Talanta. 76 (1), 1-8 (2008).
