Summary
यहां वर्णित संशोधित खमीर एक-संकर परख किसी भी कार्यात्मक जीनोमिक्स अध्ययन के लिए एक हेटेरोलोजी सिस्टम में हेटेरॉमेरिक प्रोटीन जटिल-डीएनए संवाद का अध्ययन और मान्य करने के लिए शास्त्रीय खमीर एक-संकर (Y1H) परख का एक विस्तार है।
Abstract
वर्षों से, खमीर एक-संकर परख ने प्रतिलेखन कारकों (टीएफ) और उनके डीएनए लक्ष्य जैसे प्रोटीनों के बीच शारीरिक संबंधों की पहचान और मान्यता के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक साबित हुई है। यहां प्रस्तुत विधि Y1H की अंतर्निहित अवधारणा का उपयोग करती है लेकिन इसे संशोधित करने के लिए उनके लक्ष्य डीएनए के लिए बंधन वाले प्रोटीन परिसरों के अध्ययन और मान्य करने के लिए संशोधित किया गया है। इसलिए, इसे संशोधित खमीर एक संकर (वाई 1.5 एच) परख के रूप में जाना जाता है। इस परख लागत प्रभावी है और आसानी से एक नियमित प्रयोगशाला सेटिंग में किया जा सकता है। एक heterologous प्रणाली का उपयोग कर यद्यपि, वर्णित विधि का परीक्षण करने और heteromeric प्रोटीन जटिल अध्ययन के किसी भी प्रणाली में कार्यात्मक जीनोमिक्स, विशेष रूप से संयंत्र जीनोमिक्स के लिए उनके डीएनए लक्ष्य (लक्ष्यों) के लिए बाध्य मान्य करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण हो सकता है।
Introduction
सामान्य रूप से, प्रोटीन-डीएनए बातचीत को समझने के लिए, Y1H परख एक प्रयोगशाला सेटिंग 1 में सफलतापूर्वक उपयोग की जाने वाली पसंदीदा प्रणाली है। बुनियादी Y1H परख में दो घटक शामिल हैं: क) ब्याज के डीएनए के साथ एक रिपोर्टर का निर्माण सफलतापूर्वक एक रिपोर्टर प्रोटीन एन्कोडिंग जीन की अपस्ट्रीम को क्लोन करता है; और बी) एक अभिव्यक्ति निर्माण जो ब्याज की टीएफ और एक खमीर प्रतिलेखन सक्रियण डोमेन (एडी) के बीच एक संलयन प्रोटीन पैदा करेगा। ब्याज के डीएनए को आम तौर पर 'चारा' कहा जाता है, जबकि संलयन प्रोटीन 'शिकार' के रूप में जाना जाता है पिछले वर्षों में, Y1H परख के कई संस्करणों को अपने फायदे के साथ विशिष्ट आवश्यकताओं के अनुरूप विकसित किया गया है 2 । डीएनए चारा के साथ एक समय में एक प्रोटीन की बातचीत को पहचानने और मान्य करने के लिए मौजूदा वाई 1 ए एच परख को सफलतापूर्वक लागू किया जा सकता है, लेकिन इसमें हेटरोडिमीरिक या मल्टीमैरिक प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन की पहचान करने की क्षमता नहीं है।
"> यहाँ वर्णित विधि मौजूदा Y1H सक्षम संशोधकों का एक संशोधित संस्करण है जो कि उनके लक्ष्य डीएनए अनुक्रम (बाकि) के लिए एक साथ कई प्रोटीनों का अध्ययन करने के लिए एक साथ सक्रिय है। इस परख का लक्ष्य एक सक्रियण डोमेन (pDEST22: टीएफ) और खमीर प्रणाली में उपस्थिति और / या इंटरैक्टिंग प्रोटीन पार्टनर (पीडीईटी 32 डीडीबीडी-टीएफ) की अनुपस्थिति में एक रिपोर्टर के साथ जुड़ने वाले उम्मीदवार डीएनए क्षेत्रों के सक्रियण का मूल्यांकन। यह परख हमें यह निर्धारित करने की अनुमति देगा कि क्या इन दोनों के बीच बातचीत लक्ष्य के सक्रियण के लिए प्रोटीन आवश्यक है। यह एक गैटवे क्लोनिंग संगत प्रणाली है और इसलिए नियमित प्रयोगशाला सेटिंग में उपयोग करने के लिए संभव है। यह प्रोटोकॉल प्रत्यक्ष परिवर्तन पर आधारित है, जो खमीर प्रणाली में विभिन्न टीएफ के सह-परिवर्तन की आसानी प्रदान करता है इस प्रकार, यह प्रोटीन कॉम्प्लेक्स को मान्य करने के लिए एक लाभप्रद रणनीति है , इन विट्रो आणविक और कार्यात्मक सत्यापन में उनके संभावित डीएनए लक्ष्य के लिए बाइंडिंग।या किसी भी सिस्टम वर्तमान तकनीक जैसे कि टेंडेमल आत्मीयता शुद्धि (टीएपी) तरीके महंगे हैं और श्रम में गहन हैं लेकिन बड़े पैमाने पर 3 , 4 , 5 पर प्रोटीन हीट्रोकॉम्पलेक्स का पता लगाना है। यह संशोधित खमीर एक-संकर को नियमित रूप से एक छोटे पैमाने पर प्रयोगशाला सेटिंग ( चित्रा 1 ) में किया जा सकता है और यह लागत प्रभावी भी है। Y1.5H परख समुदाय के शोधकर्ताओं को एक हेल्लोरागसिस सिस्टम का उपयोग करके एक आम डीएनए लक्ष्य के लिए बाध्यकारी बहुआयामी प्रोटीन जटिल की भूमिका को परिभाषित करने के लिए उनकी परिकल्पना का परीक्षण और मान्य करने की सुविधा प्रदान कर सकता है। निष्कर्षों के आधार पर, इस अभिकल्पना को अध्ययन की पसंदीदा प्रणाली में विवो में मान्य किया जा सकता है। हाल ही में, हमने एबिडाप्सिस 6 में फूल को विनियमित करने के लिए एक टीएफ और उसकी कार्रवाई की भूमिका को परिभाषित करने के लिए इस दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया है।Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. निर्माण और रिपोर्टर प्लाज्मिड तैयारी
- पीसीआर ई। कोलाई (टॉप 10) के उपयोग से प्रविष्टि वेक्टर में क्लोनिंग के लिए विश्लेषण करने वाले लक्ष्य डीएनए के प्रमोटर क्षेत्रों / "टुकड़े" (अधिमानतः ~ 250 - 500 बीपी) को बढ़ाना।
- अनुक्रमण की पुष्टि करने पर, एक संगत pGLacZi अभिव्यक्ति वेक्टर 7 में पॉजिटिव क्लोन को उप-आकार दें जैसा कि पहले 8 , 9 , 10 , 11 वर्णित है।
- प्रमोटर एकीकरण (वाईएम 4271) के लिए पीजीएलसीसी के मुताबिक़ पुनर्संयोजन द्वारा खमीर रिपोर्टर तनाव पैदा करने के लिए खमीर तनाव को रूपांतरित करें जैसा पहले 12 , 13 के अनुसार वर्णित है। मीडिया के नुस्खा के साथ डीएनए क्षेत्र के साथ खमीर तनाव के परिवर्तन और पुष्टिकरण चरण यहाँ वर्णित नहीं हैं, क्योंकि ये कदम शास्त्रीय Y1H प्रोटोकॉल के समान हैंAss = "xref"> 9 , 10 , 11 , 12 , 13 PEXP-AD502 नियंत्रण प्लाज्मिड का इस्तेमाल सामान्यीकरण उद्देश्यों के लिए किया जा सकता है, जबकि पहले वर्णित 8 के अनुसार β-galactosidase गतिविधि को क्फ़ाईफाईइंग किया जा सकता है।
- टीएफ या ब्याज की प्रोटीन क्लोन करें और बाद में पीडीआईटी 22 और पीडीईटी 32 डीडीडीडी (पीडीईएसटी 32 डीसीएन बाइंडिंग डोमेन) एक्सप्रैक्ट वैक्टर में इंटरैक्टिंग प्रोटीन पार्टनर को क्लोन करें। बाद में प्रोटोकॉल में तब्दील हुए खमीर प्रमोटर टुकड़े और टीएफ क्लोन का इस्तेमाल किया जाता है।
2. संशोधित Y1.5H प्रोटोकॉल
- 1 दिन (दोपहर) पर, पेट्री डिश या ग्लिसरॉल स्टॉक से एसडी-उरा में 5 एमएल संस्कृति के साथ शुरू करें और 30 डिग्री सेल्सियस के प्रकार के बरतन में रातोंरात सेते रहें।
नोट: यह संस्कृति एक ताजा सीधा प्लेट से या सीधे खमीर के 25% या 30% ग्लिसरॉल स्टॉक से शुरू की जा सकती हैडीएनए टुकड़ा के साथ क्लोन - दिन 2 (दोपहर) पर, रोजाना संस्कृति के 500 μL के साथ वाईपीडीए मीडिया के 10 एमएल टीका लगाना और 30 डिग्री सेल्सियस के प्रकार के बरतन में रातोंरात सेते रहें।
- दिन 3 (सुबह और पूरे दोपहर में): सक्षम कोशिकाओं को तैयार करें (सुबह जल्दी)।
- रात भर की संस्कृति के 2 एमएल के साथ वाईपीडीए मीडिया के 100 एमएल की टीका डालना और 30 डिग्री सेल्सियस के प्रकार के बरतन में सेते हैं। ओडी 600 तक 0.4-0.8 (3-5 एच) तक पहुंचने तक इस ताजा संस्कृति को बढ़ाएं।
नोट: रातोंरात संस्कृति के ओडी 600 की जाँच करें और सुनिश्चित करें कि इस चरण के लिए प्रारंभ बिंदु ओडी 600 0.1 - 0.2 है। अधिक या कम उम्र की संस्कृति का प्रयोग प्रयोग को लंबा कर सकता है। - 1000 मिनट और 1000 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला त्यागें
- भंवर का उपयोग करके 10 एमएल की बाँझ पानी में पुन: परिष्कृत छर्रों या ऊपर और नीचे pipetting।
- 1000 मिनट और 1000 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला त्यागें
- Reconstituतिलस-एथिलेनेयमिनेटेट्रैसेटेसिआसिड (टीई) / लिथियम एसीटेट (लीएक) के 2 एमएल में एक भंवर का उपयोग करके या ऊपर और नीचे pipetting।
नोट: कृपया तालिका 1 में टी / लीएसी के लिए नुस्खा देखें - 5 मिनट 1000 xg और 21 डिग्री सेल्सियस के लिए अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला त्यागें
- 4 एमएल ऑफ टी / लीएसी + 400 μL सैमोन शुक्राणु डीएनए (10 मिलीग्राम / एमएल) के ऊपर और नीचे pipetting और अगले चरण के लिए आगे बढ़ने में गोली फिर से निलंबित।
- रात भर की संस्कृति के 2 एमएल के साथ वाईपीडीए मीडिया के 100 एमएल की टीका डालना और 30 डिग्री सेल्सियस के प्रकार के बरतन में सेते हैं। ओडी 600 तक 0.4-0.8 (3-5 एच) तक पहुंचने तक इस ताजा संस्कृति को बढ़ाएं।
- सह-रूपांतरण: कोशिकाओं को हिट झटका (दोपहर में देर हो गई)
- एक 96-अच्छी तरह मिश्रण प्लेट (यू-नीचे) में अच्छी तरह से प्रति 20 μL कोशिकाओं को वितरित करें।
- पीडीईटी 22 में से प्रत्येक में 150 एनजी (~ 1.5 μL) जोड़ें: टीएफ प्लाज्मिड, पीडीईटी 32 डीडीडीडी: टीएफ प्लाज्मिड और पीएक्सपी-एडी 2502 प्लस पीडीईएसटी 32 डीडीडीडी: टीएफ (सामान्यीकरण नियंत्रण) कुओं तक।
नोट: अधिकतम नतीजे की उम्मीद है ~ pDEST22 में से प्रत्येक ~ 150 एनजी प्रत्येक: टीएफ और पीडीईएसटी 32 डीडीडी: सफल सह-परिवर्तन के लिए टीएफ प्लाज्मिड। निर्माण और प्लाज्मिड अभिव्यक्ति के साथ भिन्न हो सकते हैं, इस प्रकारप्रत्येक प्रयोग के साथ अनुकूलित होना चाहिए एक और नियंत्रण pDEST22-TF प्लस pDEST32deltaDBD भी उपयोगकर्ता के विवेक पर शामिल किया जा सकता है। - प्रति 100 μL TE / LiAc / पॉलीथीन ग्लाइकोल (पीईजी) प्रति अच्छी तरह से जोड़ें ( तीन बार मिश्रण )।
नोट: कृपया तालिका 1 में ते / लीएक / पीईजी के लिए नुस्खा देखें। - एक सांस सील के साथ प्लेट को कवर करें और 30 से 30 डिग्री सेल्सियस (कोई आंदोलन आवश्यक नहीं) के लिए 20 से 30 मिनट (लंबी हो सकती है) के लिए लें।
- 20 मिनट ( सटीक ) के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी झटका
- कोशिकाओं को प्लेटें
- 1000 मिनट और 1000 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला हटा दें 110 μL TE की और मिश्रण जोड़ें।
- 1000 मिनट और 1000 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके सतह पर तैरने वाले के 100 μL निकालें। पेंटर के साथ गोली फिर से निलंबित
- एसडी-ट्रिप-लिऊ अगर प्लेट्स पर कोशिकाओं को स्थानांतरित करें प्लेटें सेते हैंअगले चरण में 30 डिग्री सेल्सियस तक।
- दिन 5 (दोपहर): पेंचर / माइक्रोप्रेट रेप्लिकेटर का उपयोग करते हुए नई प्लेट्स पर कक्षों को स्थानांतरित करें।
- एक मल्टीचैनल विंदुक का उपयोग करके 50 μL TE के साथ एक बाँझ 96-अच्छी तरह मिश्रण प्लेट (यू-नीचे) भरें। ते में पेंचर को पूर्व गीला करें
नोट: पेंचर या माइक्रोप्लेट रिपिकेटर को इस चरण से पहले और बाद में बाद में प्रोटोकॉल में निष्फल होना चाहिए। पनचर को निष्फल करने का सामान्य तरीका जैसे कि इसे इथेनॉल में डुबोकर (100%, आणविक जीव विज्ञान ग्रेड नहीं) और फिर आग में जलाकर इसे लागू किया जा सकता है। छिद्रण पिन को ठंडा करने के लिए 1 मिनट की प्रतीक्षा करें
सावधानी: यदि बेंच पर नसबंदी कर रही हो; सुनिश्चित करें कि बेंच ईथेनॉल से पहले से साफ हो गया है और लगभग किसी भी दहनशील सामग्री से मुक्त है। उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहनें - पंच कालोनियों और ते-भर वाली प्लेट में फिर से निलंबित
नोट: यदि प्लेट पर चिकनी वृद्धि होती है, तो कॉलोनियों को सीधे सीधा किया जा सकता हैते-भरी हुई प्लेट या वैकल्पिक रूप से, एक कॉलोनी (एक से अधिक कालोनियों के मामले में) को निष्प्रभावित टूथपिक का उपयोग करके ते भरा हुआ प्लेट में ले जाना चाहिए और बाद में पेंचचर का उपयोग अगले चरण के लिए किया जा सकता है। - इष्टतम सतह कवरेज के लिए उन्हें नए एसडी-टीआरपी-ल्यू एगर प्लेटों पर स्थानांतरित करें। अगले चरण तक 30 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते।
- एक मल्टीचैनल विंदुक का उपयोग करके 50 μL TE के साथ एक बाँझ 96-अच्छी तरह मिश्रण प्लेट (यू-नीचे) भरें। ते में पेंचर को पूर्व गीला करें
- दिन 7 (दोपहर): β-galactosidase गतिविधि को मापने के लिए संस्कृति को प्रारंभ करें
- एक multichannel विंदुक का उपयोग करते हुए एसडी-ट्रिप-लियू मीडिया के 50 μL के साथ एक बाँझ 96-अच्छी तरह मिश्रण प्लेट (यू-नीचे) भरें।
- एक multichannel विंदुक का उपयोग करके 180 μL SD-Trp-Leu मीडिया के साथ एक बाँझ 96-गहरी अच्छी तरह से ब्लॉक भरें।
- मीडिया में पेंचर को पहले से गीला करें और प्लेट से 50 μL मीडिया तक स्थानांतरित करें।
- एसडी-टीआरपी-ल्यू मीडिया के 180 μL को खमीर के 20 μL स्थानांतरित करें और एक सांस सील के साथ ब्लॉक को सील करें। सेते36 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस के प्रकार
- 9 दिन (सुबह): एंजाइमेटिक माप के लिए संस्कृति को प्रारंभ करें।
- एक निष्फल 96 गहरी अच्छी तरह से ब्लॉक में 500 μL YPDA मीडिया के 100 μL संस्कृति को हस्तांतरित करें।
- सांस की गहरी अच्छी तरह से प्लेट को एक सांस सील के साथ कवर करें और 3-5 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस के साथ 200 आरपीएम (जब तक ओडी 600 0.3-0.6 तक) आंदोलन न हो।
- संस्कृति को फिर से निलंबित और एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर प्लेट (उपाय 600 आयुध डिपो) पर एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके 125 μL स्थानांतरित करें।
नोट: सावधानी: बुलबुले से बचने के लिए आखिरी बूंद को बांटना नहीं है, यदि ओडी 600 0.3 से नीचे है 0.6 - पढ़ने के आधार पर 1 से 2 घंटे के अतिरिक्त शेष कोशिकाओं को सेते हैं। इस कदम पर इस्तेमाल की गई 125 μL संस्कृति को उपयोगकर्ता के विवेकानुसार मूल गहरी अच्छी तरह से ब्लॉक में वापस स्थानांतरित किया जा सकता है। - गहरी अच्छी तरह से ब्लॉक में शेष कोशिकाओं को 10 मिनट 3000 डिग्री और 21 डिग्री सेल्सियस के लिए अपकेंद्रित्र। तैरनेवाला निकालेंInverting द्वारा टी
- 200 μL Z-बफर और भंवर जोड़ें।
नोट: कृपया 1 तालिका में Z- बफर के लिए नुस्खा देखें - 5 मिनट के लिए 3000 xg और 21 डिग्री सेल्सियस के लिए अपकेंद्रित्र Inverting द्वारा सतह पर तैरनेवाला निकालें
- 20 μL Z- बफर और भंवर जोड़ें।
- सील पन्नी के साथ थाली को कवर करें जो फ्रीज पिघलना चक्र का विरोध कर सकता है। एक धूआं हुड में तरल नाइट्रोजन का उपयोग कर फ्रीज / पिघलना के 4 चक्रों को करें और फिर 42 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान (2 मिनट प्रत्येक) में करें।
- 200 μL Z-बफर / बीटा-मर्कैपोटोथेनॉल (β-ME) / ओर्थो-नाइट्रोफेनील-बीओ-गैलेक्टोसैड (ओएनपीजी) (12 एमएल, 21 μL, 8.4 मिलीग्राम क्रमशः 20 एमएल समाधान उत्पन्न करेगा, हमेशा ताजा तैयार करें ) जोड़ें।
नोट: ओएनपीजी कुछ समय के लिए ठीक से भंग करने के लिए कुछ समय लगेगा ताकि इस चरण तक पहुंचने से पहले समाधान तैयार करें। ओएनपीजी β-galactosidase गतिविधि के माप के लिए सब्सट्रेट के रूप में कार्य करता है। - 30 से 30 डिग्री सेल्सियस तक 17 से 24 घंटे तक का सेवन करें (बीच में जांच करें, अगर रंग पहले जनसंपर्क विकसित करता हैअगले चरण में आगे बढ़ें)
- दिन 10 (सुबह): प्रतिक्रिया और उपाय बंद करो
- प्रतिक्रिया और रिकॉर्ड समय को रोकने के लिए 110 μL 1M Na 2 CO 3 जोड़ें।
- भंवर और अपकेंद्रित्र में 10 मिनट के लिए 3000 xg और 21 डिग्री सेल्सियस
- मल्टीचैनल का उपयोग करके 125 μL सतह पर तैरनेवाला ले लो और ओडी 420 उपाय करें।
नोट: सावधानी, बुलबुले से बचने के लिए आखिरी बूंद को बांटना मत। - Β-gal गतिविधि की गणना करें: 1000 x OD 420 / (समय (मिनट) x मात्रा (एमएल) x OD 600 एक स्प्रैडशीट में।
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Representative Results
ब्याज की प्रोटीन ( चित्रा 2 ) के साथ खमीर कोशिकाओं में डीएनए क्षेत्रों के सह-परिवर्तन के लिए सामान्य प्लेट सेट अप प्रक्रिया। प्लेट सेट अप संशोधित किया जा सकता है और डीएनए क्षेत्रों / टुकड़े जांचने की आवश्यकता के अनुसार संशोधित किया जा सकता है। प्रोटोकॉल के दिन -5 के बाद एक अच्छी तरह से विकसित और सकारात्मक प्लेट चित्र 3 में दिखाई देनी चाहिए। हमारे अध्ययन में, प्रतिलेखन प्रारंभ साइट की शुरुआत से 2600 बीपी अपस्ट्रीम के प्रमोटर क्षेत्र को छह क्षेत्रों या टुकड़े (एफआर 1-6) 6 में विभाजित किया गया था। प्रतिनिधि आंकड़ा ( चित्रा 3 ) में, डीएनए क्षेत्रों 1 और 4 प्रोटीन ए और बी कॉम्प्लेक्स के साथ सकारात्मक बातचीत करते हैं। Β-galactosidase गतिविधि ( पूरक तालिका 1 ) के माप पर केवल टुकड़ा -1 रिपोर्टर जीन गतिविधि के चार गुना प्रेरण दिखाता है, जबकि टुकड़ा -4 ने हमारे इंसुल्यू को पारित नहीं किया≥ दो गुना का अनुयायी सीमा
चित्रा 1: संशोधित खमीर-एक हाइब्रिड (वाई 1 5 एच) परख का अवलोकन। लेआउट परख के चरण-दर-चरण प्रक्रिया का वर्णन करता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 2: ब्याज की प्रोटीन (टीएफ) के साथ खमीर कोशिकाओं के सह-परिवर्तन के लिए प्लेट की एक सरल प्रस्तुति। सामान्य प्रायोगिक सेट-अप में, प्लेट को व्यवस्थित किया जा सकता है जैसा कि आंकड़े में दिखाया गया है। निर्माण और नियंत्रणों के संयोजन की आवश्यकता के अनुसार संशोधित किया जा सकता है और यह पूरी तरह से उपयोगकर्ता के विवेक पर है।
चित्रा 3: सफल सह-परिवर्तन के बाद दोहराएं 1 के लिए सकारात्मक प्लेट (एसडी-ट्रिप-लियू) की एक प्रतिनिधि छवि। इसी तरह के परिणाम और प्रतिकृति के साथ मनाया जाना चाहिए। टुकड़ा 1-6 डीएनए क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है; कोई टुकड़ा नकारात्मक नियंत्रण नहीं है
| ते बफर 10 एक्स (10 मिलीलीटर) | |
| वांछनीय | स्टॉक से |
| 100 एमएम ट्राइस-सीएल (पीएच 8.0 | 1 एमएल का ट्राइस 1 एम |
| 10 एमएम EDTA (पीएच 8.0) | ईडीटीए 0.5 एम के 200 यूएल |
| पानी के साथ मात्रा बनाओ | |
| ते / लीएक (10 मिलीलीटर) | |
| स्टॉक से | |
| 1X | 1 एमएल ते 10 एक्स |
| 0.1 एम लीएक | 1 एमएल लीएक 1 एम |
| पानी के साथ मात्रा बनाओ | |
| ते / लीएक / पीईजी (50 एमएल) | |
| वांछनीय | स्टॉक से |
| 1X | 5 एमएल ते 10 एक्स |
| 0.1 एम लीएक | 5 एमएल लीएक 1 एम |
| 40 एमएल PEG3350 50% | |
| जेड-बफर (1 एल) पीएच 7.0 | |
| ना 2 एचपीओ 4 16.1 ग्राम हेप्टहाइड्रेट या 8.52 ग्राम निर्जल पदार्थ | |
| एनएएच 2 पीओ 4 5.5 ग्राम हाइड्रेटेड या 4 जी निर्जल पदार्थ | |
| के.एम.सी. 0.75 जी | |
| MGSओ 4 0.246 ग्राम हाइड्रेटेड या 0.12 ग्राम निर्जल | |
| एचसीएल के साथ पीएच बनाए रखें | |
| ध्यान दें: | |
| उपयोग करने से पहले सभी आत्माओं को स्टरलाइज़ किया जाता है | |
| प्रोटोकॉल (वाईपीडीए, एसडी-उरा, एसडी-ट्रिप-उरा और एसडी-ट्रिप-उरा एगर प्लेट्स) में इस्तेमाल किए जाने वाले मीडिया और अगर प्लेट्स का इस्तेमाल यूटीएच | |
तालिका 1: प्रोटोकॉल में उपयोग किए गए समाधानों के लिए नुस्खा। तालिका स्टॉक के लिए नुस्खा प्रदान करती है और परख में प्रयुक्त प्रमुख बफ़रों के कार्य समाधान प्रदान करती है।
पूरक तालिका 1: β-galactosidase गतिविधि माप। यहां प्रस्तुत स्प्रेडशीट शीट को प्रोटोकॉल में दिए गए फार्मूले के उपयोग से β-galactosidase गतिविधि के माप के लिए टेम्पलेट के रूप में उपयोग किया जा सकता है। संयोजनउपयोगकर्ता के विवेक के अनुसार निर्माण की रचना को संशोधित किया जा सकता है कृपया इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
मौजूदा Y1H मानक प्रक्रिया अपने डीएनए चारा के लिए बाध्यकारी एक एकल प्रोटीन शिकार की पहचान करने के लिए उपयुक्त है। विभिन्न तकनीकी संशोधनों के साथ, ट्रांसक्रिप्शनल नियामक नेटवर्क को परिभाषित करने के लिए मौजूदा प्रणाली का उपयोग किया गया है। हालांकि, TF दो या अधिक टीएफ या प्रोटीन से जुड़े परिसरों के एक भाग के रूप में कार्य करने के लिए जाना जाता है, केवल कुछ टीएफ़ डीएनए के लिए बाध्य करने में सक्षम है। प्रोटीन या टीएफ, जिनके पास केवल प्रोटीन-बाध्यकारी डोमेन होते हैं और डीएनए को बाँधने की क्षमता की कमी होती है, एक जटिल में काम करने की अधिक संभावना होती है, जो कि टीएफ के साथ होती है जो कि डीएनए को बाध्य करने में सक्षम है। परंपरागत वाई 1 एच का इस्तेमाल करते हुए उच्च-थ्रूपुट स्क्रीन कभी-कभी उन जैविक रूप से महत्वपूर्ण संपर्कों को याद करते हैं। इस प्रकार, हेटरोमेरिक प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन का पता लगाने के लिए Y1H परख को अनुकूलित करने के लिए आवश्यक है।
यहां प्रस्तुत विधि एक से अधिक प्रोटीन या टीएफ युक्त प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन का पता लगाने की क्षमता के साथ एक ऐसा अनुकूलन है। अद्वितीय चवर्णित विधि का ऊंचा सह-रूपांतरण के माध्यम से खमीर का परिवर्तन है, जो कि खनिज प्रणाली में विभिन्न टीएफ के एकीकरण की अनुमति देता है और आगे की तरफ डीएनए क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए बाध्य करने का परीक्षण करता है। इस पद्धति का एक महत्वपूर्ण योग्यता इसकी दो प्रोटीन अपने डीएनए चारा के साथ परीक्षण करने की क्षमता है। यह विधि विशिष्ट लक्ष्य (प्रचालक) साइटों की जानकारी प्रदान नहीं करती है, लेकिन डीएनए क्षेत्रों के लिए जानकारी प्रदान करती है। इसी समय, प्रस्तावित प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की पुष्टि के बाद ही इस विधि का उपयोग करने की सलाह दी जाती है। निष्कर्षों के आधार पर, वांछनीय अगर वांछनीय रूप से विवो में लक्ष्यित साइटों की पहचान करने के लिए, इलेक्ट्रोफोरेरिक गतिशीलता बदलाव परख (ईएमएसए) या क्रोमैटिन-इम्युनोपेरेग्रेशन (चीप) परख या अन्य एशेज जैसे अन्य प्रयोगों का प्रदर्शन किया जाना चाहिए। Β-galactosidase गतिविधि के ओएनपीजी आधारित माप के आवेदन शास्त्रीय गुणात्मक एक्स-लड़की ए से बेहतर पुष्टि प्रदान करता हैssay। हालांकि, संपूर्ण प्रयोगात्मक आवश्यकताएं और प्रोटीनों (प्रो) (प्रो) के गुणों को जांचने के लिए आवश्यक रूप में ध्यान में रखा जाना चाहिए। बड़े पैमाने पर स्क्रीन के लिए वर्णित विधि के कार्यान्वयन, दो डीएनए लक्ष्यों के साथ दो से अधिक प्रोटीन भागीदारों का उपयोग करने की जांच की जानी चाहिए। Y1.5H परख एक लागत प्रभावी तरीका है, जो नियमित प्रयोगशाला सेटिंग में एक छोटे पैमाने पर किया जा सकता है। शायद, यह परख अन्य वेक्टर सिस्टम के उपयोग के साथ किया जा सकता है लेकिन प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने की आवश्यकता है यदि गेटवे-संगत क्लोनिंग सिस्टम का उपयोग न करें।
Y1.5 एच के लिए प्रस्तुत प्रोटोकॉल अध्ययन की किसी भी प्रणाली के लिए डीएनए चारा के साथ प्रोटीन जटिल (एस) को मान्य करने के लिए एक लाभप्रद रणनीति है; पौधों या स्तनधारियों यह विधि पौधों के जीनोमिक्स के अध्ययन के लिए बहुत उपयोगी है, जहां विवो सत्यापन में पौधे और समय और श्रम गहन परिवर्तन प्रक्रियाओं के स्तर को देखते हुए चुनौतीपूर्ण हो सकता है। इस प्रकार, इस मी का उपयोगEthod एक हेटेरोलॉगस सिस्टम में कम से कम परिकल्पना परीक्षण को तेज कर सकती है।
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Disclosures
लेखक ब्याज का कोई संघर्ष नहीं घोषित करते हैं
Acknowledgments
हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए एसएस वैंग, एम। अमर और ए। गैला का धन्यवाद करते हैं। इस प्रकाशन में रिपोर्ट किए गए शोध को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ के तहत पुरस्कार संख्या आरओएजीएम 0 067837 और आरओएजीएम056006 (एसएसी) के अधीन किया गया था। सामग्री केवल लेखकों की जिम्मेदारी है और आवश्यक रूप से राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करती है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pDEST22 vector | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest Two hybrid system kit |
| pDEST32delatDBD | Invitrogen | PQ1000102 | Pro-Quest Two hybrid system kit; this vecor is modified. It is pDEST32 minus DNA binding Domain |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K240020 | |
| YM4271 Strain | Clontech | K1603-1 | MATCHMAKER One-Hybrid System |
| pEXP-AD502 | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest Two hybrid system kit |
| GATEWAY LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen | 11791020 | |
| YPDA media | Clontech | 630410 | |
| SD-Agar | Clontech | 630412 | |
| SD minimal media | Clontech | 630411 | |
| Uracil DO Supplement | Clontech | 630416 | |
| Tryptophan Do Supplement | Clontech | 630413 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
| LiAc | Sigma-Aldrich | L4158 | |
| Saplmon Sperm (10mg/ml) | Invitrogen | 15632011 | |
| 96 well round bottom Plate | Greiner bio-one | 650101 | |
| PEG3350 | Sigma-Aldrich | 1546547 | |
| 96-deep well block | USA Scientific | 1896-2000 | |
| Sealable Foil | USA Scientific | 2923-0110 | |
| Araseal | Excel Scientific | B-100 | |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Scientific | 034461-100 | |
| ONPG | Sigma-Aldrich | 73660 | |
| Na2CO3 | Sigma-Aldrich | 223484 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | |
| KCL | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 83266 | |
| HCL | Fisher Scientific | SA54-4 | |
| Drybath | Thermo Fischer | ||
| Voretx | Thermo Fischer | ||
| Centrifgue | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
| Plate Reader | Molecular Device | SPECTRAMAX PLUS Microplate Spectrophotometer | |
| Incubator | Thermo Fisher | Model No. 5250- 37 Degree, 6250-30 degrees | |
| Shaker Incubator | New Brunswick | ||
| Water Bath | Thermo Fisher | IsoTemp 205 | |
| Puncher | |||
| 50 ml Falocn | BD Falcon | ||
| Beaker | Nalgene | ||
| Flask | Nalgene | ||
| Petriplates (150mm) | Greiner bio-one |
References
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