Summary
本明細書に記載の改変酵母一ハイブリッドアッセイは、任意の機能的ゲノミクス研究のための異種系におけるヘテロメリックタンパク質複合体-DNA相互作用を研究および検証するための古典的酵母一ハイブリッド（Y1H）アッセイの延長である。
Abstract
長年にわたって、酵母1ハイブリッドアッセイは、転写因子（TF）およびそれらのDNA標的などのタンパク質間の物理的相互作用の同定および確認のための重要な技術であることが証明されている。本明細書中に提示される方法は、Y1Hの基本概念を利用するが、標的DNAに結合するタンパク質複合体を研究し、検証するためにさらに修飾される。したがって、これは、改変酵母一ハイブリッド（Y1.5H）アッセイと呼ばれる。このアッセイは費用対効果が高く、通常の実験室環境で簡単に実施できます。異種システムを使用してもかかわらず 、記載された方法は、試験の任意のシステムで機能的ゲノミクス、特に植物ゲノミクスのためのそれらのDNA標的（単数または複数）に結合するヘテロメリックタンパク質複合体をテストし検証するための貴重なツールであり得ます。
Introduction
一般に、タンパク質-DNA相互作用を理解するために、Y1Hアッセイは実験室環境でうまく使用される好ましいシステムである1 。基本的なY1Hアッセイは、2つの成分を含む：a）レポータータンパク質をコードする遺伝子の上流に首尾よくクローニングされた目的のDNAを有するレポーター構築物; b）目的のTFと酵母転写活性化ドメイン（AD）との間に融合タンパク質を生成する発現構築物。目的のDNAは一般に「餌」と呼ばれ、融合タンパク質は「獲物」として知られている。過去数年間に、Y1Hアッセイの複数のバージョンが、独自の利点を備えた特定のニーズに合わせて開発されました2 。既存のY1Hアッセイは、一度に1つのタンパク質のDNAベイトとの相互作用を同定および確認するために首尾よく実施することができるが、ヘテロ二量体または多量体タンパク質-DNA相互作用を同定する能力は欠如している。
このアッセイの目的は、目的のタンパク質を活性化ドメイン（pDEST22：配列番号2）で発現させることであり、これは、標的DNA配列に結合する複数のタンパク質を同時に研究することを可能にする既存のY1Hの改変版である。 TF）と接触させ、酵母系において相互作用するタンパク質パートナー（pDEST32ΔDBD-TF）の存在下および/または非存在下でレポーターに融合した候補DNA領域の活性化を評価する。タンパク質は、標的の活性化のために必要とされる。これは、GATEWAYクローニング適合システムであり、従って、通常の実験室内で使用することが可能である。したがって、 インビトロでの分子および機能検証のためのそれらの可能なDNA標的に結合するタンパク質複合体を確認することは有利な戦略であるまたは任意のシステム。このようなタンデムアフィニティ精製などの現在の技術は、（TAP）の方法は高価であり、労働集約的であるが、大規模な3、4、5にタンパク質hetrocomplexesの検出を可能にします。この改変された酵母一ハイブリッドは、小規模の定期的な研究室で成功裏に実施することができ（ 図1 ）、費用対効果も高い。 Y1.5Hアッセイは、異種系を用いて共通のDNA標的に結合する多量体タンパク質複合体の役割を定義するという仮説を検証し検証するために、共同体全体の研究者を容易にすることができる。この知見に基づいて、この仮説は、好ましい研究系においてインビボで検証され得る 。最近、我々は、シロイヌナズナ6における開花を調節するためのTFの役割およびその作用様式を定義するためにこのアプローチを使用した6 。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.構築およびレポータープラスミドの調製
- 大腸菌 （TOP10）を用いて、エントリーベクターへのさらなるクローニングのために分析される標的DNAのプロモーター領域/「フラグメント」（好ましくは約250〜500bp）をPCR増幅する。
- 以前8、9、10、11に記載のように配列決定確認の際に、互換pGLacZi発現ベクター7に陽性クローンをサブクローニング。
- 13、12前述したように酵母レポーター株を生成するためにpGLacZiの相同組換えによって、プロモーター統合（YM4271）のための酵母株を形質転換します。培地のレシピに沿ったDNA領域を有する酵母株の形質転換および確認工程は、古典的なY1Hプロトコールと類似しているため、ここでは記載しない尻= "外部参照"> 9、10、11、12、13。 pEXP-AD502コントロールプラスミドは、標準化の目的で使用することができ、一方、以前に記載されているようにβ-ガラクトシダーゼ活性を定量化することができる8 。
- 目的のTFまたはタンパク質をクローニングし、続いて、相互作用するタンパク質パートナーをpDEST22およびpDEST32ΔDBD（pDEST32マイナスDNA結合ドメイン）発現ベクターにクローニングする。形質転換された酵母プロモーター断片およびTFクローンは、その後、プロトコルにおいてさらに使用される。
2.変更されたY1.5Hプロトコル
- 1日目（午後）に、ペトリ皿またはグリセロールストックからSD-Uraの培養液5mLで開始し、30℃シェーカーで一晩インキュベートする。
注：この培養は、新鮮なストリークプレートから、または酵母の25％または30％グリセロールストックから直接開始することができるDNA断片でクローニングする。 - 2日目（午後）に、10mLのYPDA培地に500μLの一晩培養液を接種し、30℃の振盪器中で一晩インキュベートする。
- 3日目（早朝と午後）：有能な細胞を準備する（早朝）。
- 一晩培養した2mLのYPDA培地100mLに接種し、30℃の振とう器中でインキュベートする。 OD 600が0.4〜0.8（3〜5時間）に達するまで、この新鮮な培養物を増殖させる。
注：一晩培養のOD 600をチェックし、このステップの開始点OD 600が0.1〜0.2であることを確認してください。過剰培養または未熟培養の使用は、実験を延長する可能性がある。 - 1000 xgおよび21℃で5分間遠心分離する。上清を捨てる。
- 渦を使用して10 mLの滅菌水でペレットを再構成するか、上下にピペッティングする。
- 1000 xgおよび21℃で5分間遠心分離する。上清を捨てる。
- 再構築（TE）/酢酸リチウム（LiAc）2mL中でボルテックスまたはピペッティングを用いて上下にペレットを上下に移動させる。
注： 表1の TE / LiAcのレシピを参照してください。 - 1000 xgおよび21℃で5分間遠心分離する。上清を捨てる。
- ペレットを4 mLのTE / LiAc + 400μLのサケ精子DNA（10 mg / mL）に再懸濁し、上下にピペッティングして次のステップに進みます。
- 一晩培養した2mLのYPDA培地100mLに接種し、30℃の振とう器中でインキュベートする。 OD 600が0.4〜0.8（3〜5時間）に達するまで、この新鮮な培養物を増殖させる。
- 同時形質転換：細胞を熱ショック（午後遅く）
- 1ウェルあたり20μLの細胞を96ウェルの混合プレート（U底）に分配する。
- ウェルにpDEST22：TFプラスミド、pDEST32ΔDBD：TFプラスミドおよびpEXP-AD502プラスpDEST32ΔDBD：TF（正規化対照）の各150ng（〜1.5μL）を加える。
注：pDEST22：TFおよびpDEST32ΔDBD：TFプラスミドはそれぞれ〜150 ngの最適な共形質転換のために最適な結果が期待されます。したがって、構築物およびプラスミド発現によって変化し得るすべての実験で最適化する必要があります。別のコントロールpDEST22-TFとpDEST32deltaDBDもユーザーの裁量で含めることができます。 - 1ウェルあたり100μLのTE / LiAc /ポリエチレングリコール（PEG）を添加する（ 3回混合する ）。
注： 表1の TE / LiAc / PEGのレシピを参照してください。 - プレートを通気性のあるシールで覆い、30〜30℃でインキュベートする（攪拌が必要ない）。
- 42℃で20分間（ 正確に ）熱ショック。
- 細胞をプレートする。
- 1000 xgおよび21℃で5分間遠心分離する。マルチチャンネルピペットを用いて上清を除去する。 110μLのTEを添加し、混合する。
- 1000 xgおよび21℃で5分間遠心分離する。マルチチャネルピペットを用いて100μLの上清を除去する。パンチャーでペレットを再懸濁する。
- 細胞をSD-Trp-Leu寒天プレート上に移す。プレートをインキュベートする30℃で次の工程まで。
- 5日目（午後）：パンチャー/マイクロプレートレプリケーターを用いて細胞を新しいプレートに移す。
- マルチチャンネルピペットを使用して、滅菌96ウェル混合プレート（U底）に50μLのTEを満たしてください。 TEのパンチャーをあらかじめ湿らせます。
注：パンチャーまたはマイクロプレートリプリケーターは、この手順の前およびその後のプロトコルで滅菌する必要があります。パンチャーをエタノール（100％;分子生物学的等級ではない）に浸して炎に燃やすなどの一般的な方法を適用することができます。パンチャーピンを冷却するために1分間待ちます。
注意：ベンチで滅菌を行う場合は、ベンチがエタノールで予備洗浄され、周囲に可燃性物質がないことを確認してください。適切な個人用保護具（PPE）を着用してください。 - TE充填プレートでコロニーを突き刺して再懸濁する。
注：プレート上で滑らかな成長がある場合、コロニーを直接パンチングすることができます（複数のコロニーの場合）は、TE充填プレートに滅菌したつまようじを用いて拾い、次にパンチャーを次のステップに使用することができる。 - 最適な表面カバレッジのために新しいSD-Trp-Leu寒天プレート上に移します。 30℃でプレートを次のステップまでインキュベートする。
- マルチチャンネルピペットを使用して、滅菌96ウェル混合プレート（U底）に50μLのTEを満たしてください。 TEのパンチャーをあらかじめ湿らせます。
- 7日目（午後）：β-ガラクトシダーゼ活性を測定するための培養を開始する。
- マルチチャンネルピペットを使用して、 SD-Trp-Leu培地50μLを含む滅菌96ウェル混合プレート（U底）を満たす。
- マルチチャンネルピペットを使用して、 180μLのSD-Trp-Leu培地で96穴の井戸ブロックを滅菌します。
- 培地中のパンチャーをあらかじめ濡らし、コロニーをプレートから培地50μLに移す。
- 酵母20μLをSD-Trp-Leu培地180μLに移し、通気性のシールでブロックをシールします。インキュベート30℃振盪器で36時間インキュベートした。
- 9日目（朝）：酵素測定のための培養を開始する。
- 100μLの培養液を滅菌96ディープウェルブロックのYPDA培地500μLに移す。
- 滅菌したディープウェルプレートを通気性のシールで覆い、200 rpmで撹拌しながら（OD 600 0.3〜0.6まで）30℃で3〜5時間インキュベートする。
- 培養を再懸濁し、分光光度計プレート（OD 600を測定）上のマルチチャンネルピペットを用いて125μLを移す。
注意：注意：OD 600が0.3〜0.6未満である場合は、最後の液滴を泡を避けるために分注しないでください。残りの細胞を1〜2時間インキュベートしてください。このステップで使用した125μLの培養液は、廃棄するか、元のディープウェルブロックにユーザーの裁量で戻すことができます。 - ディープウェルブロック中の残りの細胞を3000 xgおよび21℃で10分間遠心分離する。スーパーナタールを削除tを反転させる。
- 200μLのZ緩衝液を加えてボルテックスする。
注： 表1の Zバッファのレシピを参照してください。 - 3000 xgおよび21℃で5分間遠心分離する。反転させて上清を除去する。
- 20μLのZ緩衝液およびボルテックスを加える。
- 凍結融解サイクルに耐えることができるシーリングホイルでプレートを覆う。ヒュームフード内で液体窒素を使用して4サイクルの凍結/融解を行い、次に水浴中で42℃（それぞれ2分間）を行う。
- 200μLのZ-バッファー/β-メルカプトエタノール（β-ME）/オルソ - ニトロフェニル-β-ガラクトシド（ONPG）を加える（12mL、21μL、それぞれ8.4mgで20mLの溶液が得られる; 常に新鮮なものを調製する ）。
注記：ONPGは正しく溶解するまでに時間がかかりますので、このステップに達する1時間前に溶液を調製してください。 ONPGは、β-ガラクトシダーゼ活性の測定のための基質として働く。 - 30°Cで17〜24時間インキュベートする（色が以前のpr次のステップに進みます）。
- 10日目（朝）：反応を止め、測定する。
- 反応と記録時間を停止するために110μLの1MのNa 2 CO 3を追加します。
- ボルテックスし、3000×gおよび21℃で10分間遠心分離する。
- マルチチャネルを用いて125μLの上清を採取し、OD 420を測定する。
注：気泡を避けるために、最後のドロップを分配しないでください。 - スプレッドシート中のβ-gal活性：1000×OD 420 /（時間（分）×体積（mL）×OD 600 ）を計算する。
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Representative Results
関心対象のタンパク質を含む酵母細胞におけるDNA領域の同時形質転換のための一般的なプレートセットアップ手順（ 図2 ）。プレートのセットアップは、実験の必要性および試験されたDNA領域/フラグメントの数に従って改変することができる。プロトコールの5日後、よく増殖し陽性のプレートは図3のように見えるはずです。我々の研究では、転写開始部位の開始から2600bp上流のプロモーター領域を6つの領域または断片（FR1-6） 6にセグメント化した。代表的な図（ 図3 ）において、DNA領域1および4は、タンパク質AおよびB複合体との陽性相互作用を示す。 β-ガラクトシダーゼ活性の測定（ 補足表1 ）では、フラグメント-1のみがレポーター遺伝子活性の4倍の誘導を示し、フラグメント-4は我々のインテグを通過しなかった2倍以上の閾値。
図1：改変イースト - ワンハイブリッド（Y1.5H）アッセイの概要。レイアウトは、アッセイの段階的手順を記述する。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
【図2】目的のタンパク質（TF）を有する酵母細胞の共形質転換のためのプレート構成の単純化された表現。一般的な実験設定では、プレートを図のように配置することができます。コンストラクトとコントロールの組み合わせは、必要に応じて変更することができ、完全にユーザーの裁量に委ねられます。
図3：成功した同時形質転換後の複製1についての陽性プレート（SD-Trp-Leu）の代表的な画像。同様の結果がより多くの反復で観察されるべきである。フラグメント1-6はDNA領域を表す。 No Fragmentはネガティブコントロールです。
| TEバッファー10X（10ml） | |
| 望ましい | 株式から |
| 100mMトリス-Cl（pH8.0 | 1mLのTris 1M |
| 10mM EDTA（pH8.0） | 200uLのEDTA 0.5M |
| 水で量を増やす | |
| TE / LiAc（10ml） | |
| 株式から | |
| 1X | 1mL TE 10X |
| 0.1M LiAc | 1mL LiAc 1M |
| 水で量を増やす | |
| TE / LiAc / PEG（50mL） | |
| 望ましい | 株式から |
| 1X | 5mL TE 10X |
| 0.1M LiAc | 5mL LiAc 1M |
| 40mL PEG3350 50％ | |
| Z緩衝液（1L）pH7.0 | |
| Na 2 HPO 4 16.1gの七水和物または8.52gの無水物 | |
| NaH 2 PO 4 5.5gの水和物または4gの無水物 | |
| KCl 0.75g | |
| MgSO 4 0.246gの水和物または0.12gの無水物 | |
| HCLでpHを維持する | |
| 注意： | |
| すべての魂は使用前に滅菌されています。 | |
| プロトコール（YPDA、SD-Ura; SD-Trp-UraおよびSD-Trp-Ura寒天プレート）で使用される培地および寒天プレートは、Y1Hと同じ処方に従う | |
表1：プロトコルで使用されるソリューションのレシピ。この表は、アッセイに使用される主要緩衝液のストックおよび作業溶液の処方を提供する。
補足表1：β-ガラクトシダーゼ活性測定。ここに示すスプレッドシートシートは、プロトコールで与えられた式を用いてβ-ガラクトシダーゼ活性の測定のための鋳型として使用することができる。コンビネーションユーザーの裁量に応じて構成要素の変更が可能です。 このファイルをダウンロードするにはここをクリックしてください。
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Discussion
既存のY1H標準手順は、そのDNA餌に結合する単一のタンパク質餌を同定するのに適している。種々の技術的改変により、既存のシステムは転写調節ネットワークを規定するために利用されている。しかし、TFは、2つ以上のTFまたはタンパク質を含む複合体の一部として機能することが知られており、TFの一部のみがDNAに結合することができる。タンパク質結合ドメインのみを有し、DNAに結合する能力を欠いているタンパク質またはTFは、複合体、好ましくはDNAに結合することができるTFと作用する可能性がより高い。伝統的なY1Hを用いたハイスループットスクリーニングは、生物学的に重要な相互作用を時折欠くことがあります。したがって、ヘテロメリックなタンパク質-DNA相互作用を検出するためにY1Hアッセイを適応させることが不可欠です。
ここに示す方法は、複数のタンパク質またはTFを含むタンパク質-DNA相互作用を検出する能力を有するそのような適応の1つである。ユニークなf記載された方法の成熟したものは、酵母系における異なるTFの組込みを可能にし、標的DNA領域への複合体の結合を試験するためにさらに適用される同時形質転換による酵母の形質転換である。この方法の重要なメリットは、DNAベイトで2つのタンパク質を試験する能力である。この方法は、特定の標的（プロモーター）部位の情報を提供するのではなく、DNA領域についての情報を提供する。同時に、この方法の使用は、提案されたタンパク質 - タンパク質相互作用の確認後にのみ推奨される。この発見に基づいて、電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）またはクロマチン免疫沈降（ChIP）アッセイまたは研究系に適した他のアッセイを実施して、好ましくは望ましい場合にはインビボで標的部位を同定しなければならない。 ONPGに基づくβ-ガラクトシダーゼ活性の測定の適用は、古典的な定性的X-galαssay。しかしながら、試験されるタンパク質の全体的な実験要件および特性は、必要に応じて考慮されるべきである。異なるDNA標的を有する3つ以上のタンパク質パートナーを用いて、大規模スクリーニングのための記載された方法の実施を試験する必要がある。 Y1.5Hアッセイは費用効果の高い方法であり、通常の実験室環境では小規模で実施できます。おそらく、このアッセイは他のベクターシステムを用いて行うことができるが、ゲートウェイ適合クローニングシステムを使用しない場合、プロトコルを最適化する必要がある。
Y1.5Hのための提示されたプロトコールは、任意の研究系のためのDNA餌でタンパク質複合体を検証する有利な戦略である;植物または哺乳動物である。この方法は、植物の倍数性レベルおよび時間および労力を要する形質転換手順を考慮すると、インビボでの検証が困難な場合がある植物ゲノミクスの研究に非常に有用である。したがって、このmの使用少なくとも異種システムにおいて仮説検定を加速することができる。
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Disclosures
著者は利害の衝突を宣言しない。
Acknowledgments
SS Wang、M. Amar、A. Gallaに原稿の批評を読んだことに感謝します。この刊行物で報告された研究は、受賞番号RO1GM067837およびRO1GM056006（SAKへ）の下、国立衛生研究所の国立総合医療研究所によって支持された。内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pDEST22 vector | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest Two hybrid system kit |
| pDEST32delatDBD | Invitrogen | PQ1000102 | Pro-Quest Two hybrid system kit; this vecor is modified. It is pDEST32 minus DNA binding Domain |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K240020 | |
| YM4271 Strain | Clontech | K1603-1 | MATCHMAKER One-Hybrid System |
| pEXP-AD502 | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest Two hybrid system kit |
| GATEWAY LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen | 11791020 | |
| YPDA media | Clontech | 630410 | |
| SD-Agar | Clontech | 630412 | |
| SD minimal media | Clontech | 630411 | |
| Uracil DO Supplement | Clontech | 630416 | |
| Tryptophan Do Supplement | Clontech | 630413 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
| LiAc | Sigma-Aldrich | L4158 | |
| Saplmon Sperm (10mg/ml) | Invitrogen | 15632011 | |
| 96 well round bottom Plate | Greiner bio-one | 650101 | |
| PEG3350 | Sigma-Aldrich | 1546547 | |
| 96-deep well block | USA Scientific | 1896-2000 | |
| Sealable Foil | USA Scientific | 2923-0110 | |
| Araseal | Excel Scientific | B-100 | |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Scientific | 034461-100 | |
| ONPG | Sigma-Aldrich | 73660 | |
| Na2CO3 | Sigma-Aldrich | 223484 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | |
| KCL | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 83266 | |
| HCL | Fisher Scientific | SA54-4 | |
| Drybath | Thermo Fischer | ||
| Voretx | Thermo Fischer | ||
| Centrifgue | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
| Plate Reader | Molecular Device | SPECTRAMAX PLUS Microplate Spectrophotometer | |
| Incubator | Thermo Fisher | Model No. 5250- 37 Degree, 6250-30 degrees | |
| Shaker Incubator | New Brunswick | ||
| Water Bath | Thermo Fisher | IsoTemp 205 | |
| Puncher | |||
| 50 ml Falocn | BD Falcon | ||
| Beaker | Nalgene | ||
| Flask | Nalgene | ||
| Petriplates (150mm) | Greiner bio-one |
References
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