Summary
Il saggio di un ibrido di lievito modificato qui descritto è un'estensione del saggio classico del lievito un ibrido (Y1H) per studiare e convalidare l'interazione heteromera della proteina-complesso del DNA in un sistema eterologo per qualsiasi studio genomico funzionale.
Abstract
Nel corso degli anni il test di un ibrido del lievito ha dimostrato di essere una tecnica importante per l'identificazione e la convalida delle interazioni fisiche tra proteine quali i fattori di trascrizione (TFs) e il loro target di DNA. Il metodo presentato qui utilizza il concetto sottostante del Y1H ma è modificato ulteriormente per studiare e validare complessi proteici legati al loro DNA target. Quindi, viene definito come il lievito modificato un ibrido (Y1.5H). Questo test è economico e può essere facilmente eseguito in un normale ambiente di laboratorio. Sebbene utilizzando un sistema eterologo, il metodo descritto potrebbe essere un valido strumento per testare e convalidare il complesso proteomico eteromerico legato al loro target di DNA per la genomica funzionale in qualsiasi sistema di studio, in particolare la genomica vegetale.
Introduction
In generale, per comprendere le interazioni proteine-DNA, il saggio Y1H è il sistema preferito utilizzato con successo in un ambiente di laboratorio 1 . Il test Y1H di base coinvolge due componenti: a) un costruttore di reporter con DNA di interesse con successo clonato a monte di un gene che codifica una proteina reporter; E b) un costrutto di espressione che genera una proteina di fusione tra il TF di interesse e un dominio di attivazione della trascrizione di lieviti (AD). Il DNA di interesse è comunemente indicato come 'esca' mentre la proteina di fusione è conosciuta come 'preda'. Negli ultimi anni sono state sviluppate più versioni del test Y1H per soddisfare le esigenze specifiche con i propri vantaggi 2 . Il test Y1H esistente può essere implementato con successo per identificare e convalidare l'interazione di una proteina alla volta con l'esca del DNA, ma manca la capacità di identificare interazioni tra proteine e DNA eterodimeriche o multimeriche.
"> Il metodo descritto qui è una versione modificata dei ricercatori che consentono Y1H di studiare contemporaneamente più proteine legate alla loro sequenza di DNA target. L'obiettivo di questo test è quello di esprimere la proteina di interesse con un dominio di attivazione (pDEST22: TF) e valutare l'attivazione delle regioni del DNA candidato fuso ad un reporter in presenza e / o assenza del partner proteico interagente (pDEST32ΔDBD-TF) nel sistema di lievito.Questo dosaggio ci permetterà di determinare se l'interazione tra questi due Proteine è necessario per l'attivazione del bersaglio.Questo è un sistema compatibile di clonazione GATEWAY e quindi è possibile utilizzare in un ambiente di laboratorio regolare.Questo protocollo è basato sulla trasformazione diretta, che fornisce la facilità di co-trasformazione di TF differenti in un sistema di lievito , Quindi è una strategia vantaggiosa per convalidare i complessi proteici che si legano ai loro possibili bersagli del DNA per la convalida molecolare e funzionale in vitro fO qualsiasi sistema. Le tecniche attuali quali i metodi di purificazione di affinità tandem (TAP) sono costosi e impegnativi nel lavoro, ma consentono la rilevazione di hetrocomplex proteici su larga scala 3 , 4 , 5 . Questo ibrido di lievito modificato può essere eseguito con successo in una regolazione regolare di laboratorio su piccola scala ( figura 1 ) ed è anche conveniente. Il test Y1.5H può facilitare i ricercatori in tutta la comunità per verificare e convalidare la loro ipotesi per definire il ruolo del complesso proteico multimerico legato ad un comune obiettivo del DNA utilizzando un sistema eterologo. Sulla base dei risultati, l'ipotesi potrebbe essere convalidata in vivo nel sistema di studio preferito. Recentemente, abbiamo utilizzato questo approccio per definire il ruolo di un TF e il suo modo di azione per regolare la fioritura in Arabidopsis 6 .Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Costruire e preparare il Plasmide Reporter
- PCR amplificano le regioni / "frammenti" del promotore (preferibilmente ~ 250-500 bp) del DNA target da analizzare per ulteriore clonazione nel vettore di ingresso usando E. coli (TOP10).
- Dopo la conferma della sequenza, subclone il clone positivo in un vettore di espressione pGLacZi compatibile 7 come descritto precedentemente 8 , 9 , 10 , 11 .
- Trasformare il ceppo di lievito per l'integrazione del promotore (YM4271) mediante ricombinazione omologa di pGLacZi per generare ceppo del reattore di lievito come descritto precedentemente 12 , 13 . Le fasi di trasformazione e di conferma del ceppo di lievito con la regione del DNA insieme alla ricetta dei supporti non sono descritte qui, in quanto i passaggi sono simili al protocollo classico Y1HAss = "xref"> 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Il plasmide di controllo pEXP-AD502 può essere utilizzato per la normalizzazione, mentre quantifica l'attività di β-galattosidasi come descritto in precedenza 8 .
- Clonare il TF o la proteina di interesse e successivamente clonare il partner proteico interagente nei vectori di espressione pDEST22 e pDEST32ΔDBD (pDEST32 minus DNA Binding Domain). I frammenti di promotore del lievito trasformato ei cloni TF vengono poi ulteriormente utilizzati nel protocollo.
2. Protocollo modificato Y1.5H
- Il giorno 1 (pomeriggio), iniziare con 5 ml di coltura in SD-Ura da un piatto di Petri o da glicerolo e incubare per una notte in un agitatore a 30 ° C.
NOTA: Questa coltura può essere avviata da una piastra appena striata o direttamente da un glicerolo 25% o 30% del lievitoClone con il frammento del DNA. - Il giorno 2 (pomeriggio), inoculare 10 mL di supporti YPDA con 500 μL di coltura durante la notte e incubare per una notte in un agitatore a 30 ° C.
- Giorno 3 (mattina presto e tutto il pomeriggio): preparare cellule competenti (la mattina presto).
- Inoculare 100 mL di supporti YPDA con 2 mL di coltura notturna e incubare in un agitatore a 30 ° C. Crescere questa cultura fresca fino a quando l'OD 600 raggiunge 0.4-0.8 (3-5 h).
NOTA: Verificare l'OD 600 della coltura durante la notte e assicurarsi che il punto iniziale OD 600 per questo passo sia 0.1 - 0.2. L'uso di culture troppo o meno sviluppate può prolungare l'esperimento. - Centrifugare per 5 min a 1000 xg e 21 ° C. Scartare il surnatante.
- Ricostituire i pellet in 10 ml di acqua sterile utilizzando un vortice o pipettare su e giù.
- Centrifugare per 5 min a 1000 xg e 21 ° C. Scartare il surnatante.
- ricostituiti(TE) / acetato di litio (LiAc) usando un vortice o pipettare verso l'alto e verso il basso in 2 mi di pellets in 2 ml di tris-etilendiammetraaceticacid (TE) / acetato di litio (LiAc).
NOTA: Si prega di vedere la ricetta per TE / LiAc nella tabella 1 . - Centrifugare per 5 min 1000 xg e 21 ° C. Scartare il surnatante.
- Sospendere il pellet in 4 ml di TE / LiAc + 400 μL di DNA sperma di salmone (10 mg / ml) pipettando su e giù e procedere alla fase successiva.
- Inoculare 100 mL di supporti YPDA con 2 mL di coltura notturna e incubare in un agitatore a 30 ° C. Crescere questa cultura fresca fino a quando l'OD 600 raggiunge 0.4-0.8 (3-5 h).
- Co-trasformazione: scossa calore le cellule (tardi nel pomeriggio)
- Distribuire 20 μL di cellule per pozzetto in una piastra di miscelazione a 96 pozzetti (fondo U).
- Aggiungere 150 ng (~ 1,5 μL) ciascuno dei plasmidi pDEST22: TF, pDEST32ΔDBD: TF plasmid e pEXP-AD502 più pDEST32ΔDBD: TF (controllo di normalizzazione) ai pozzetti.
NOTA: Si prevedono risultati ottimali con ~ 150 ng ciascuno di pDEST22: TF e pDEST32ΔDBD: plasmide TF per una corretta co-trasformazione. Può variare con espressioni di construct e plasmide, in questo modoDevono essere ottimizzati con ogni esperimento. Un altro controllo pDEST22-TF più pDEST32deltaDBD può anche essere incluso a discrezione dell'utente. - Aggiungere 100 μL di TE / LiAc / polietilenglicole (PEG) per pozzetto ( mescolare tre volte ).
NOTA: Si prega di vedere la ricetta per TE / LiAc / PEG nella tabella 1 . - Coprire la piastra con una tenuta traspirante e incubare per 20-30 minuti (può essere più lungo) a 30 ° C (senza agitazione necessaria).
- Scossa termica per 20 minuti ( precisamente ) a 42 ° C.
- Piastra le cellule.
- Centrifugare per 5 min a 1000 xg e 21 ° C. Rimuovere il surnatante usando una pipetta multicanale. Aggiungere 110 μL di TE e mescolare.
- Centrifugare per 5 min a 1000 xg e 21 ° C. Rimuovere 100 μL del supernatante usando una pipetta multicanale. Riposizionare il pellet con il puncher.
- Trasferire le cellule sulle piastre agar SD-Trp-Leu . Incubare le piastreA 30 ° C fino al passo successivo.
- Giorno 5 (pomeriggio): Trasferire le celle su piastre nuove usando il picherello / microplate replicator.
- Riempire una piastra sterile a 96 pozzetti (fondo U) con 50 μL di TE utilizzando una pipetta multicanale. Pre-bagnare il puncher in TE.
NOTA: il pacchiere o il replicatore di micropiastre devono essere sterilizzati prima di questo passaggio e successivamente successivamente nel protocollo. È possibile applicare il metodo comune di sterilizzazione di puncher come l'immersione in etanolo (100%, non la biologia molecolare) e poi bruciandolo alla fiamma. Attendere 1 min per raffreddare i perni del punzone.
Attenzione: eseguire la sterilizzazione sul banco; Assicurarsi che la panca sia pre-pulita con etanolo e priva di qualsiasi materiale combustibile in giro. Indossare adeguati dispositivi di protezione individuale (PPE). - Colonie di punzonatura e ri-sospensione in piastra piena di TE.
NOTA: Se sulla piastra è presente una crescita liscia, le colonie possono essere fornite direttamenteAlla piastra riempita con TE o in alternativa, una singola colonia (in caso di colonie multiple) deve essere prelevata usando uno stuzzicadenti sterilizzato sulla piastra TE riempita e successivamente il puncher può essere utilizzato per la fase successiva. - Trasferitelo su nuove piastre agar SD-Trp-Leu per una copertura superficiale ottimale. Incubare le piastre a 30 ° C fino alla fase successiva.
- Riempire una piastra sterile a 96 pozzetti (fondo U) con 50 μL di TE utilizzando una pipetta multicanale. Pre-bagnare il puncher in TE.
- Giorno 7 (pomeriggio): avviare la cultura per misurare l'attività di β-galattosidasi.
- Riempire una piastra sterile a 96 pozzetti (fondo U) con 50 μL di supporti SD-Trp-Leu usando una pipetta multicanale.
- Riempire un blocco sterile a 96 piani con 180 μL di supporto SD-Trp-Leu usando una pipetta multicanale.
- Pre-bagnare il punzone nei supporti e trasferire le colonie dalla piastra ai 50 μL di supporti.
- Trasferire 20 μL di lievito nel 180 μL di supporti SD-Trp-Leu e sigillare il blocco con una tenuta traspirante. covarePer 36 h ad agitatore a 30 ° C.
- Giorno 9 (mattina): Avviare la cultura per la misura enzimatica.
- Trasferire 100 μl di coltura a 500 μL di supporti YPDA in un blocco sterile a 96 pozzetti profondi.
- Coprire la piastra profonda sterilizzata con una tenuta traspirante e incubare per 3-5 ore a 30 ° C con agitazione a 200 giri / min (fino a OD 600 0,3-0,6).
- Riposizionare la cultura e trasferire 125 μL usando una pipetta multicanale su una piastra di spettrofotometro (misura OD 600 ).
NOTA: Attenzione: Non lasciare l'ultima goccia per evitare le bolle, se l'OD 600 è inferiore a 0,3 - 0,6, incubare le altre cellule per 1-2 ore in più sulla base della lettura. La coltura da 125 μl utilizzata a questo passaggio può essere scartata o trasferita al blocco profondo originale a discrezione dell'utente. - Centrifugare le celle residue nel pozzetto profondo per 10 minuti a 3000 xg e 21 ° C. Rimuovi supernatanteInvertendo.
- Aggiungere 200 μl di Z-buffer e vortex.
NOTA: vedere la ricetta per Z-buffer nella tabella 1 . - Centrifugare per 5 min a 3000 xg e 21 ° C. Togliere il supernatante dall'invertimento.
- Aggiungere 20 μl di Z-buffer e vortex.
- Coprire la piastra con una lamina di tenuta che può resistere ai cicli di gelata di congelamento. Eseguire 4 cicli di congelamento / scongelamento usando l'azoto liquido in un cappuccio e poi 42 ºC in un bagno d'acqua (2 min ciascuno).
- Aggiungere 200 μl di Z-buffer / beta-mercaptoetanolo (β-ME) / Ortho-nitrofenile-β-galattoside (ONPG) (12 mL, 21 μL, rispettivamente 8.4 mg producendo 20 mL di soluzione, prepararsi sempre fresco ).
NOTA: l'ONPG impiegherà un po 'di tempo per sciogliere correttamente per preparare la soluzione un'ora prima di raggiungere questo passaggio. ONPG serve come substrato per la misura dell'attività di β-galattosidasi. - Incubare fino a 17 - 24 h a 30 ° C (controllare tra, se il colore si sviluppa prPassare al passo successivo).
- Giorno 10 (mattina): interrompere la reazione e misurare.
- Aggiungere 110 μl di 1M Na 2 CO 3 per fermare la reazione e il tempo di registrazione.
- Vortice e centrifuga per 10 min a 3000 xg e 21 ° C.
- Prendere 125 μL di supernatante usando il multicanale e misurare OD 420 .
NOTA: Attenzione, non dispensare l'ultima goccia per evitare le bolle. - Calcola l'attività di β-gal: 1000 x OD 420 / (tempo (min) x volume (mL) x OD 600 in un foglio di calcolo.
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Representative Results
La procedura generale di preparazione delle piastre per la co-trasformazione delle regioni del DNA nelle cellule del lievito con proteina di interesse ( Figura 2 ). La configurazione del piatto può essere modificata in base alla necessità dell'esperimento e del numero di regioni / frammenti di DNA sperimentati. Dopo il giorno 5 del protocollo dovrebbe essere visibile una piastra ben sviluppata e positiva come nella figura 3 . Nel nostro studio, la regione promotore di 2600 bp a monte dall'inizio del sito di inizio della trascrizione è stata segmentata in sei regioni o frammenti (FR 1-6) 6 . Nella figura rappresentativa ( Figura 3 ), le regioni del DNA 1 e 4 mostrano interazione positiva con il complesso proteico A e B. Dopo la misura dell'attività di β-galattosidasi ( Tabella supplementare 1 ) solo il frammento-1 mostra l'induzione quadruplicata dell'attività del gene reporter, mentre il frammento-4 non ha superato l'interoSoglia di ≥ due volte.
Figura 1: Una panoramica del miele ibrido modificato (Y1.5H). Il layout descrive la procedura passo-passo del saggio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Una rappresentazione semplificata del set-up della piastra per la co-trasformazione delle cellule di lievito con proteina (TF) di interesse. In una configurazione sperimentale generale, la piastra può essere disposta come mostrato in figura. La combinazione di costrutti e controlli può essere modificata secondo la necessità ed è completamente a discrezione dell'utente.
Figura 3: Immagine rappresentativa della piastra positiva (SD-Trp-Leu) per replicare 1 dopo una riuscita co-trasformazione. Un risultato simile dovrebbe essere osservato con più repliche. Il frammento 1-6 rappresenta la regione del DNA; Nessun frammento è un controllo negativo.
| Tampone TE 10X (10 ml) | |
| Auspicabile | Dalla scorta |
| 100 mM Tris-Cl (pH8.0 | 1mL di Tris 1M |
| 10mM EDTA (pH8,0) | 200uL di EDTA 0,5M |
| Compilare il volume con acqua | |
| TE / LiAc (10 ml) | |
| Dalla scorta | |
| 1X | 1mL TE 10X |
| 0,1 mA LiAc | 1mL LiAc 1M |
| Compilare il volume con acqua | |
| TE / LiAc / PEG (50 mL) | |
| Auspicabile | Dalla scorta |
| 1X | 5 mL TE 10X |
| 0,1 mA LiAc | 5 mL LiAc 1M |
| 40 mL di PEG3350 50% | |
| Z-buffer (1L) pH 7,0 | |
| Na 2 HPO 4 16.1g di eptavidrato o 8.52g di anidra | |
| NaH 2 PO 4 5.5g di idrato o 4g di anidra | |
| KCl 0,75 g | |
| MgSO 4 0,246 g di idrato o 0,12 g di anidra | |
| Mantenere il pH con HCL | |
| Nota: | |
| Tutte le soultions sono sterilizzate prima dell'uso. | |
| Le piastre di agar e di media utilizzate nel protocollo (YPDA, SD-Ura, SD-Trp-Ura e SD-Trp-Ura agar) seguono la stessa ricetta di Y1H | |
Tabella 1: La ricetta per le soluzioni utilizzate nel protocollo. La tabella fornisce la ricetta per le soluzioni di magazzino e di lavoro dei buffer principali utilizzati nel saggio.
Supplementare Tabella 1: misurazione dell'attività di β-galattosidasi. Il foglio di calcolo presentato qui può essere utilizzato come modello per la misura dell'attività di β-galattosidasi usando la formula data nel protocollo. La combinazioneLa costruzione dei costrutti può essere modificata a discrezione dell'utente. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
La procedura standard esistente Y1H è idonea per identificare una singola preda di proteine legata all'esca del DNA. Con varie modifiche tecniche, il sistema esistente è stato sfruttato per la definizione di reti regolatorie trascrizionali. Tuttavia, TFs sono noti per funzionare come parte di complessi che coinvolgono due o più TF o proteine, con solo alcuni dei TF in grado di legarsi al DNA. Le proteine oi TF che possiedono solo i domini leganti alla proteina e che non dispongono della capacità di legarsi al DNA sono più probabili a lavorare in un complesso, preferibilmente con un TF capace di legarsi al DNA. Le schermate ad alto rendimento usando il tradizionale Y1H saltano occasionalmente a quelle interazioni biologicamente importanti. Pertanto, è imperativo adattare il test Y1H per rilevare interazioni tra proteine e DNA eteromeriche.
Il metodo presentato qui è un tale adattamento con la capacità di rilevare interazioni protein-DNA che coinvolgono più di una proteina o TF. L'unico fIl metodo descritto è la trasformazione del lievito attraverso la co-trasformazione che consente l'integrazione di TF differenti in un sistema di lievito e ulteriormente applicato per testare il legame del complesso alle regioni del DNA di destinazione. Un merito significativo di questo metodo è la sua capacità di testare due proteine con l'esca del DNA. Questo metodo non fornisce le informazioni di siti specifici (promotori), ma fornisce informazioni per le regioni del DNA. Allo stesso tempo, l'uso di questo metodo è consigliato solo dopo la conferma della interazione proteina-proteina proposta. Sulla base dei risultati, ulteriori esperimenti come il test di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSA) o il test di Chromatin-immunoprecipitazione (ChIP) o altri dosaggi adeguati al sistema di studio devono essere eseguiti per identificare i siti di destinazione, preferibilmente in vivo se desiderabile. L'applicazione della misurazione ONPG dell'attività di β-galattosidasi fornisce una migliore conferma rispetto alla classica qualità X-gal assay. Tuttavia, i requisiti complessivi sperimentali e le proprietà delle proteine da testare dovrebbero essere presi in considerazione se necessario. Occorre verificare l'implementazione del metodo descritto per lo schermo su larga scala, utilizzando più di due partner di proteine con diversi obiettivi del DNA. Il test Y1.5H è un metodo conveniente, che può essere eseguito su piccola scala in un normale ambiente di laboratorio. Forse questo test potrebbe essere eseguito con l'uso di altri sistemi vettoriali, ma il protocollo deve essere ottimizzato se non utilizza il sistema di clonazione compatibile con gateway.
Il protocollo presentato per Y1.5H è una strategia vantaggiosa per convalidare i complessi proteici con il loro esca del DNA per qualsiasi sistema di studio; Piante o mammiferi. Questo metodo è molto utile per studiare la genomica vegetale dove la convalida in vivo potrebbe essere difficile dato il livello di ploidia dell'impianto e le procedure di trasformazione a tempo e di lavoro. Così, l'uso di questo mIl metodo può accelerare il test dell'ipotesi almeno in un sistema eterologo.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Ringraziamo SS Wang, M. Amar e A. Galla per una lettura critica del manoscritto. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dall'Istituto Nazionale delle Scienze Mediche Generali degli Istituti Nazionali di Salute con i numeri di premio RO1GM067837 e RO1GM056006 (a SAK). Il contenuto è esclusivamente responsabile degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali degli Istituti Nazionali di Salute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pDEST22 vector | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest Two hybrid system kit |
| pDEST32delatDBD | Invitrogen | PQ1000102 | Pro-Quest Two hybrid system kit; this vecor is modified. It is pDEST32 minus DNA binding Domain |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K240020 | |
| YM4271 Strain | Clontech | K1603-1 | MATCHMAKER One-Hybrid System |
| pEXP-AD502 | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest Two hybrid system kit |
| GATEWAY LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen | 11791020 | |
| YPDA media | Clontech | 630410 | |
| SD-Agar | Clontech | 630412 | |
| SD minimal media | Clontech | 630411 | |
| Uracil DO Supplement | Clontech | 630416 | |
| Tryptophan Do Supplement | Clontech | 630413 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
| LiAc | Sigma-Aldrich | L4158 | |
| Saplmon Sperm (10mg/ml) | Invitrogen | 15632011 | |
| 96 well round bottom Plate | Greiner bio-one | 650101 | |
| PEG3350 | Sigma-Aldrich | 1546547 | |
| 96-deep well block | USA Scientific | 1896-2000 | |
| Sealable Foil | USA Scientific | 2923-0110 | |
| Araseal | Excel Scientific | B-100 | |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Scientific | 034461-100 | |
| ONPG | Sigma-Aldrich | 73660 | |
| Na2CO3 | Sigma-Aldrich | 223484 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | |
| KCL | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 83266 | |
| HCL | Fisher Scientific | SA54-4 | |
| Drybath | Thermo Fischer | ||
| Voretx | Thermo Fischer | ||
| Centrifgue | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
| Plate Reader | Molecular Device | SPECTRAMAX PLUS Microplate Spectrophotometer | |
| Incubator | Thermo Fisher | Model No. 5250- 37 Degree, 6250-30 degrees | |
| Shaker Incubator | New Brunswick | ||
| Water Bath | Thermo Fisher | IsoTemp 205 | |
| Puncher | |||
| 50 ml Falocn | BD Falcon | ||
| Beaker | Nalgene | ||
| Flask | Nalgene | ||
| Petriplates (150mm) | Greiner bio-one |
References
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