Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لوصف العزلة حويصلات خارج الخلية (EVs) المتوسط في المختبر ومثقف من الكبار بلهارسيه بالبلەارسيات.
Abstract
حويصلات خارج الخلية (EVs) هي الحويصلات الغشائية التي صدر عن مجموعة متنوعة من الخلايا إلى المكروية خارج الخلية. المركبات الكهربائية تمثل أن حويصلات غير المتجانسة، التي حجم يتراوح بين 40 و 000 1 نانومتر. وأشارت الأدلة المتراكمة إلى أن المركبات الكهربائية تلعب أدواراً تنظيمية هامة في التفاعلات المضيف الممرض. وينبغي التبصير على فهم عميق للمركبات الكهربائية المنشقات الآليات الأساسية للتفاعلات المنشقات-المضيف، مما يتيح وضع استراتيجيات جديدة ضد مرض البلهارسيا. هنا، ونحن نهدف إلى مواصلة دراسة وظائف المركبات الكهربائية في المنشقات بتقديم بروتوكول لعزل وتوصيف المركبات الكهربائية من الكبار بلهارسيه بالبلەارسيات (بالبلەارسيات S.). وكانت المركبات الكهربائية معزولة من المتوسطة الثقافة في المختبر باستخدام الطرد المركزي جنبا إلى جنب مع مجموعة مواد عزل اكسوسومي تجارية. معزولة بالبلەارسيات س. المركبات الكهربائية (سجيفس) عادة ما تمتلك يبلغ قطرها 100-400 نانومتر، وتتميز مجهر إلكتروني والنشاف الغربية. وأثبتت استخدام الصبغة المسماة سجيفس PKH67 أن سجيفس يتم استيعابه بالخلايا المتلقية. إجمالاً، لدينا بروتوكول يوفر طريقة بديلة لعزل المركبات الكهربائية من المنشقات الكبار؛ سجيفس معزولة قد تكون مناسبة للتحليل الوظيفي.
Introduction
حويصلات خارج الخلية (EVs) عدد سكان صغير الحويصلات الغشاء زمنياً مغلفة بمختلف البروتينات والدهون والأحماض النووية. الدراسات التي أجريت مؤخرا أظهرت أن المركبات الكهربائية تلعب دوراً حاسما في خلية خلية الاتصال، ويشاركون في تنظيم العديد من العمليات الفيزيولوجية، بما في ذلك التنمية الخلية والتنظيم المناعي والأوعية وخلية الهجرة2، 3،،من45. تتراكم الأدلة تشير إلى أن المركبات الكهربائية، تعميم اكسوسوميس، وحمولتها ميرنا تمثل المؤشرات الحيوية المحتملة لبعض الأمراض6.
البروتوزوا عدة مثل المشعرة المهبليةو مثقبيه الكروزية ليشمانيا spp.، أظهرت أن تكون قادرة على إفراز المركبات الكهربائية؛ بالإضافة إلى ذلك تم العثور على الديدان لإفراز المركبات الكهربائية في المعيشة وتستضيف7. أظهرت المركبات الكهربائية الطفيلية إلى المشاركة في الحفاظ على الإصابة والقدرة الإمراضية8التنظيم المناعي9. الدراسات الأخيرة في المنشقات كل 10، المنسونيه بلهارسيه (س. المنسونيه)11 و بالبلەارسيات س.12 قد أشارت إلى أن تفرز المنشقات الكبار حويصلات مثل اكسوسومي التي قد تكون وتشارك في اللوائح الفنية لعمليات بيولوجية معينة.
وحتى الآن، استخدمت عدة طرق لعزل حويصلات خارج الخلية، مثل تنبيذ فائق، أولترافيلتريشن13، واستخدام الكواشف المستندة إلى البوليمر، وحجم الاستبعاد اللوني والعزلة إيمونوافينيتي. هذه الأساليب المختلفة تمتلك14المزايا والقيود الخاصة بها. وبوجه عام، يعتبر تنبيذ فائق الأسلوب المعيار الذهبي لعزل حويصلة. ومع ذلك، يعاني هذا الأسلوب من الحد من التراكم EV المحتملة14.
في المنشقات، أبلغ عن اثنين من الأساليب لعزل EV: وتشمل هذه تنبيذ فائق11،،من1210 واستخدام التجاري EV العزلة طقم16 لعدة مراحل (16من البيض، شيستوسومولا11المنشقات البالغين10،،من1217). نظراً لأن ميكروفيسيكليس هم من طائفة واسعة من حجم نانومتر مئات عدة من آلاف نانومتر، قمنا بتطوير أسلوب بديل يجمع بين استخدام الطرد المركزي مقاعد البدلاء، أولترافيلتريشن، ومجموعة EV عزلة تجارية لعزل المركبات من بلهارسيه بالبلەارسياتمن الكبار. المركبات الكهربائية المعزولة عادة ما يمتلك يبلغ قطرها 100-400 نانومتر وتم استيعابه بنجاح بالخلايا المتلقية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع التجارب على الحيوانات كانت وافقت لجنة الأخلاقيات المحلية التابعة لمعهد شانغهاي لبحوث الطب البيطري، الأكاديمية الصينية "العلوم الزراعية" (تصريح رقم: شفرياو-14-0101).
1-الثقافة في المختبر المنشقات
ملاحظة: المنشقات تمثل الإخطار البيولوجية. يجب ارتداء العمال قفازات مطاط في جميع الأوقات عند معالجة الديدان، والمعلقات شيستوسومال، أو أخرى ذات الصلة بالمواد البيولوجية. كانوا مصابين بأرانب نيوزيلندا سيركاريا ~ 2,000 التعرض عن طريق البطن. وجمعت المنشقات في مرحلة الكبد من الأرانب المصابين سيركاريا بالبلەارسيات س في الإصابة بعد 28 يوما قبل التروية الكبد والاوردة المساريقي العلوي. تمت الإشارة إليها إجراءات جمع دودة في المنشورات السابقة الإبلاغ عن الدراسات في الفئران18.
- جمع الطفيليات في كوب 500 مل. غسلها جيدا ويسخن برفق 3 x مع 200 مل من (37 درجة مئوية) برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.4).
- فصل أزواج دودة ~ 200 لكل طبق بيتري 90 ملم. ثم غسل الطفيليات جيدا ويسخن برفق 2 x مع 50 مل من (37 درجة مئوية) RPMI 1640 الثقافة المتوسطة التي تحتوي على 100 يو للبنسلين و 100 مغ/مل من والستربتوميسين.
- الحفاظ على الطفيليات في 40 مل من RPMI 1640 مسخن الثقافة المتوسطة دون المضادات الحيوية في 37 درجة مئوية تحت 5% طبق CO2 في كثافة دودة ~ 5 أزواج/mL ل 2 ح في 90 ملم بيتري.
ملاحظات: لا ينبغي أن تتضمن المتوسط RPMI 1640 المصل، وإلا سيتم عرض خارجية حويصلة خارج الخلية.
2-ما قبل المعالجة شرط وسائل الإعلام
- جمع المتوسطة الثقافة وثم الطرد المركزي المتوسطة في 4 درجات مئوية في 2,000 ز × مدة 30 دقيقة إزالة البيض والدودة tegmental الحطام.
- نقل المادة طافية إلى أنبوب جديد وقم بتصفية الحل باستخدام عامل تصفية حقنه 0.22 ميكرومتر.
- جمع الحل التي تمت تصفيتها في كيس دياليزيد (وقف الوزن الجزيئي: 3.5kD) وبعد ذلك دياليزي الحل باستخدام محلول 8% PEG8000 في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
ملاحظات: تعد هذه الخطوة مهمة لإثراء سجيفس لزيادة عائد العزلة سجيفس.
3-عزل سجيفس
- نقل الحل دياليزيد إلى أنبوب جديد ثم قم بإضافة 0.5 حجم الكاشف العزل التام اكسوسومي.
- مزيج الحل جيدا من قبل فورتيكسينج أو بيبيتينج صعودا وهبوطاً لضمان التجانس للحل.
- احتضان هذا الخليط عند درجة مئوية 2 إلى 8 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- الطرد المركزي الخليط في 15,000 ز × ح 1 عند 2 درجة مئوية إلى 8 درجات مئوية.
- نضح وتجاهل المادة طافية.
ملاحظات: وترد المركبات الكهربائية في بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب (غير مرئي في معظم الحالات). - ريسوسبيند بيليه المركبات الكهربائية في 2 مل من برنامج تلفزيوني ومن ثم تخزين حل المركبات الكهربائية في-80 درجة مئوية حتى إجراء مزيد من التحليل.
4-توصيف المركبات الكهربائية من النشاف الغربية
- تحديد تركيز العينة سجيفس، مثلاً، باتفاق التعاون الأساسي مقايسة البروتين.
- إعداد 10-20 ميكروغرام من المركبات الكهربائية في ميليلتر 22.5 ريبا المخزن المؤقت. قم بإضافة ميليلتر 7.5 من 4 × تحميل المخزن المؤقت والحرارة لمدة 5 دقائق في 95 درجة مئوية.
- فصل البروتينات سجيفس بهلام الحزب الديمقراطي الصربي صفحة 12%.
- نقل البروتينات إلى غشاء PVDF والتحقيق ثم مع الأجسام المضادة-CD63 (1:1، 000 تمييع)، متبوعاً بالتحقيق مع أرنب المضادة مفتش-برنامج الصحة الإنجابية (1:5، وتمييع 000).
- استخدام كاشف كشف مسافنة للتنمية الغشاء والكشف عن الإشارات التي تشيميلومينيسسينسي نظام التصوير.
5-توصيف المركبات الكهربائية مجهر إلكتروني
- إضافة 2 ميليلتر من سجيفس معزولة إلى 200 شبكة الشبكات المغلفة فورمفار وثم السماح له جاف في درجة حرارة الغرفة.
- وصمة عار مع 2% حمض فوسفوتونجستيك لمدة 1 دقيقة وثم السماح له جاف في درجة حرارة الغرفة.
- تحميل الشبكات على صاحب العينة المجهر الإلكتروني انتقال ويتعرضون لشعاع إلكترون كيلوفولت 80 لالتقاط الصور.
6-سجيفس التسمية مع PKH67 ومقايسة الامتصاص الخلية
ملاحظات: وأجريت كل الخطوات اللاحقة في درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية)، ما لم يبين خلاف ذلك.
- نقل 5 ميكروغرام الحل سجيفس في أنبوب البولي بروبلين قاع مخروطي وضبط مستوى الصوت إلى 12 مل بإضافة المتوسط RPMI 1640.
- الطرد المركزي في سجيفس في 110,000 × ز لمدة 90 دقيقة في 4 درجات مئوية بيليه سجيفس.
- بعد الطرد المركزي، بعناية نضح المادة طافية.
ملاحظة: صبغ اثانوليك PKH67 أن لا تضاف مباشرة إلى بيليه سيف، كهذا سيؤدي في تلطيخ غير متجانسة واستمرارية انخفاض الخلية. - إعداد حل تعليق EV 2 x بإضافة 1 مل من "مادة ج" بيليه سيف؛ للتأكد من تشتت كاملة، ريسوسبيند مع بيبيتينج لطيف.
- قبل تلوين في "مادة ج"، إعداد 2 جديدة × صبغ الحل بإضافة 2 ميليلتر من الحل صبغ اثانوليك PKH67 إلى 1 مل من "مادة سي" في أنبوب الطرد مركزي البوليبروبيلين وخلط جيدا لتفريق.
- سرعة إضافة 1 مل x 2 تعليق EV (6.4 خطوة) إلى 1 مل 2 × "صبغ الحل" (الخطوة 6، 5) وعلى الفور خلط العينة بيبيتينج.
- احتضان هذا الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 دقائق.
- إيقاف تلطيخ بإضافة 4 مل FBS ومن ثم احتضانها لمدة 1 دقيقة.
- إضافة RPMI1640 المتوسطة ضبط حجم الصوت إلى 12 مل وثم الطرد المركزي في 110,000 ز × عند 4 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.
- إزالة المادة طافية وإضافة المتوسطة RPMI1640 ريسوسبيند PKH67 المسمى الكريات سيف.
- الطرد المركزي في 110,000 ز × عند 4 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة يغسل مرة واحدة ثم قم بإضافة برنامج تلفزيوني الكريات سجيفس ريسوسبيند.
7-مقايسة الامتصاص الخلية سجيفس
- خلايا الثدييات البذور مثل NCTC استنساخ 1469 الخلايا أو الخلايا HEK293T في البئر 6 لوحات (2 × 105 خلايا، كل بئر) والثقافة الخلايا بين عشية وضحاها.
- إضافة 5 ميكروغرام المسمى PKH67 سجيفس والثقافة ثم الخلايا في 37 درجة مئوية ح 2-4.
- بعد الحضانة، إزالة المتوسطة وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني مرتين.
- إصلاح الخلايا مع 4% فورمالدهايد الحل لمدة 15 دقيقة وغسلها مرتين أكثر مع برنامج تلفزيوني.
- وصمة عار نواة الخلية مع 4, 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI).
- مراقبة الخلايا باستخدام مجهر الأسفار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لتحديد مقدار عائد سجيفس معزولة باستخدام بروتوكول وصف، استخدمنا مقايسة البروتين اتفاق التعاون الأساسي للوصول إلى تركيز البروتين سجيفس المعزولة من المنشقات الكبار 28 يوما. كما هو مبين في الجدول 1، وتركيز البروتين سيف تراوحت ميكروغرام 208 إلى 250 ميكروغرام في 100 مل متوسطة (الجدول 1). حجم الجسيمات، كما يحدده تحليل نانوحبيبات مالفيرن، أشار إلى أن سجيفس المعزولة تتراوح من 100 نانو متر إلى 400 نانومتر، مع أعلى نسبة سكان حوالي 220 نانومتر في الحجم (الشكل 1). وصف المزيد من سجيفس واسطة مجهر إلكتروني كشف المركبات الكهربائية لتكون حويصلات جولة من حوالي 100-200 نانومتر في القطر (الشكل 2). الغربية النشاف التحليل أشار إلى أن سجيفس معزولة معترف بها باستخدام الأجسام المضادة CD63، وهي علامة EV نموذجية (الشكل 3). ملاحظة مجهرية الأسفار أشار إلى أنه تم استيعاب سجيفس المسمى PKH67 NCTC استنساخ خلايا 1,469، وأن سجيفس ووزعت أساسا في السيتوبلازم للخلايا المتلقية (الشكل 4).
| عينات | المركبات الكهربائية/100 مل الثقافة المتوسطة |
| #1 | 250 ميكروغرام |
| #2 | ميكروغرام 208 |
| #3 | 220 ميكروغرام |
الجدول 1: سجيفس البروتين التي تم الحصول عليها من الثقافة المتوسطة؛ ويرد مبلغ سجيفس الوصول إليها بواسطة الإنزيم اتفاق التعاون الأساسي في 100 مل من الثقافة المتوسطة، التي تحتوي على أزواج دودة ~ 500،.
الشكل 1 : حجم التوزيع من "سجيفس معزولة" من المتوسطة مثقف. كان المخفف 20 ميليلتر لحل سجيفس مع PBS 1000 ميليلتر؛ ثم، وقد تم تحليل الخليط باستخدام الجسيمات اثنين من زاوية عالية الأداء ومحلل الحجم الجزيئي. النتيجة أظهرت هو الممثل للبيانات من العزلة المستقلين الثلاثة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : وصف سجيفس مجهر إلكتروني- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : غربي النشاف تحليل سجيفس المعزولة ضد أجسام CD63. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : الإقبال على سجيفس بخلايا الثدييات. بخ المسمى سجيفس تظهر باللون الأخضر، بينما تظهر نواة الخلية باللون الأزرق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد أثبتت الدراسات الأخيرة على المركبات الكهربائية المنشقات تلك المركبات دوراً هاما في المضيف الممرض التفاعلات3،9،،من1216. مواصلة التصدي لمهامها التنظيمية، من الضروري عزل المركبات الكهربائية من المنشقات. هنا، يمكننا وصف طريقة بديلة لعزل سيف. هذا الأسلوب ينتج حجم مجموعة واسعة من سجيفس، من 100 نانو متر إلى 400 نانومتر، في البالغين بالبلەارسيات س. مقايسة الامتصاص الخلية التالية أشارت إلى أن المركبات الكهربائية المعزولة تحت وصف البروتوكول تم استيعابه بنجاح بالخلايا المتلقية، وأن ميرناس المرتبطة بها يحتمل أن تلعب الأدوار التنظيمية17.
المركبات الكهربائية، التي قد تكون يفرزها العديد من أنواع مختلفة من الخلايا، توجد أيضا في أنواع مختلفة من سوائل الجسم19. ونتيجة لذلك، من المهم تجنب إدخال اصطناعياً المركبات الكهربائية الخارجية أثناء عملية عزل سجيف. على سبيل المثال، يجب إلا يتضمن المتوسطة الثقافة المصل. ينبغي أن تكون كثافة دودة في الثقافة في المختبر معقولة تقليل إجهاد استجابة محتملة، وخفض معدلات الوفيات من الديدان. وبالإضافة إلى ذلك، تجدر الإشارة إلى أن مختلف مراحل المنشقات أو الديدان من المضيفين مختلفة بتقديم مختلف المركبات الكهربائية. ونتيجة لذلك، لا بد من الحفاظ على الطفيليات في البيئات في المختبر التي تشبه البيئة المضيفة، والشروط التي تتم تحت سجيف الذي عزل يجب أن تكون متسقة. بالإضافة إلى ذلك، نحن غير قادرين على استبعاد إمكانية تباين تتصل سجيفس الناجمة عن الإجهاد الثقافة.
نقدم هنا، بروتوكولا لعزل سجيفس من ح 2 في المختبر وسائط الثقافة المنشقات الكبار. ميزة لهذا البروتوكول هو أن الثقافة قصير الوقت يقلل من الإجهاد التي يتعرض لها الطفيليات، مما قد يتسبب في إفراز EV غير الفسيولوجية. وبالإضافة إلى ذلك، وجدنا أن سجيفس معزولة كما هو موضح في هذا البروتوكول تم استيعابه بالخلايا المتلقية، مما يوحي بأن هذه سجيفس قد يكون نشاطا بيولوجيا17. وعموما، يسمح هذا البروتوكول كفاءة عزل سجيفس عن بالغ الديدان باستخدام معدات المختبرات القياسية، ويمكن توصيف استخدام النشاف الغربية ومقايسة الامتصاص الخلية. يمكن استخدام المركبات الكهربائية المعزولة لزيادة وصف التفاعلات المضيف الممرض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذه الدراسة كانت، جزئيا أو كلياً، تدعمها الوطنية العلوم الطبيعية مؤسسة الصين (31472187 و 31672550) والعلوم الزراعية والتكنولوجيا برنامج الابتكار من الأكاديمية الصينية للعلوم الزراعية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 4478359 | For isolating S. japonicum extracellular vesicles |
| PKH67 | Sigma-aldrich | MINI67 | For labeling Evs |
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11875119 | For parasite culture |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher SCIENTIFIC | 15140122 | |
| 0.22μm syringe filter | Merck | SLGP033RB | |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo SCIENTIFIC | 68035 | |
| PEG8000 | Sangon Biotech | A100159 | |
| RIPA | Beyotime | P0013B | |
| EMD Millipore™ Immobilon™ Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) | Fisher scientific | WBKLS0100 | |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083 | |
| BCA kit | Beyotime | P0010 | |
| CD63 antibodies | Sangon Biotech | D160973-0025 | |
| PVDF | Bio-Rad | 1704273 | |
| Formvar/Carbon 400 mesh | Ted Pella | 01754-F | |
| Phosphotungstic Acid | Ted Pella | 19402 | |
| anti-mouse IgG-HRP | CWBIO | CW0102 | |
| NCTC clone 1469 cells | ATCC | ATCC® CCL-9.1™ | |
| FBS | HyClone | SV30087.02 | |
| Equipments | |||
| GE chemoluminescance imaging system | GE | ImageQuant LAS4000mini | |
| Transmission electron microscopy | Hitachi | H-7600 | |
| Milli-Q water | Milli-Q | Milli-Q Elix | |
| Eppendor Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5804R | |
| Zetasizer Nano | Malvern | Zetasizer Nano ZS | |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima L-100 XP Ultracentrifuge | |
| Incubator | ESCO | CCL-107B | |
| Microscope | Zeiss | Zeiss Axin Observer Z1 |
References
- Tetta, C., Ghigo, E., Silengo, L., Deregibus, M. C., Camussi, G. Extracellular vesicles as an emerging mechanism of cell-to-cell communication. Endocrine. 44 (1), 11-19 (2013).
- Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to Extracellular Vesicles: Biogenesis, RNA Cargo Selection, Content, Release, and Uptake. Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).
- Riaz, F., Cheng, G. Exosome-like vesicles of helminths: implication of pathogenesis and vaccine development. Ann Transl Med. 5 (7), 175 (2017).
- Zhang, H. G., Grizzle, W. E. Exosomes and cancer: a newly described pathway of immune suppression. Clin Cancer Res. 17 (5), 959-964 (2011).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).
- Li, Y., et al. Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis. Cell Res. 25 (8), 981-984 (2015).
- Marcilla, A., et al.
- Cwiklinski, K., et al. The Extracellular Vesicles of the Helminth Pathogen, Fasciola hepatica: Biogenesis Pathways and Cargo Molecules Involved in Parasite Pathogenesis. Mol Cell Proteomics. 14 (12), 3258-3273 (2015).
- Buck, A. H., et al. Exosomes secreted by nematode parasites transfer small RNAs to mammalian cells and modulate innate immunity. Nat Commun. 5, 5488 (2014).
- Sotillo, J., et al. Extracellular vesicles secreted by Schistosoma mansoni contain protein vaccine candidates. Int J Parasitol. 46 (1), 1-5 (2016).
- Nowacki, F. C., et al. Protein and small non-coding RNA-enriched extracellular vesicles are released by the pathogenic blood fluke Schistosoma mansoni. J Extracell Vesicles. 4, 28665 (2015).
- Wang, L., et al. Exosome-like vesicles derived by Schistosoma japonicum adult worms mediates M1 type immune- activity of macrophage. Parasitol Res. 114 (5), 1865-1873 (2015).
- Koh, Y. Q., Almughlliq, F. B., Vaswani, K., Peiris, H. N., Mitchell, M. D. Exosome enrichment by ultracentrifugation and size exclusion chromatography. Front Biosci (Landmark Ed). 23, 865-874 (2018).
- Safdar, A., Saleem, A., Tarnopolsky, M. A. The potential of endurance exercise-derived exosomes to treat metabolic diseases. Nat Rev Endocrinol. 12 (9), 504-517 (2016).
- Livshits, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Sci Rep. 5, 17319 (2015).
- Zhu, S., et al. Release of extracellular vesicles containing small RNAs from the eggs of Schistosoma japonicum. Parasit Vectors. 9 (1), 574 (2016).
- Zhu, L., et al. Molecular characterization of S. japonicum exosome-like vesicles reveals their regulatory roles in parasite-host interactions. Sci Rep. 6, 25885 (2016).
- Lewis, F.
- Cheng, G. Circulating miRNAs: roles in cancer diagnosis, prognosis and therapy. Adv Drug Deliv Rev. 81, 75-93 (2015).
