Summary
Nous présentons ici un protocole visant à décrire l’isolement vésicules extracellulaires (EVs) en milieu de cultivés in vitro des adultes Schistosoma japonicum.
Abstract
Vésicules extracellulaires (EVs) sont des vésicules membranaires libérés par une variété de cellules dans le microenvironnement extracellulaire. Véhicules électriques représentent une population de vésicules hétérogènes, dont calibre compris entre 40 et 1 000 nm. Données accumulées ont indiqué que EVs jouent un rôle réglementaire important dans les interactions hôte-pathogène. Une compréhension profonde du schistosome SVE doit donner un aperçu les mécanismes qui sous-tendent les interactions de schistosomes-hôte, permettant ainsi le développement de nouvelles stratégies de lutte contre la schistosomiase. Ici, nous visons à étudier davantage les fonctions EVs dans schistosomes en présentant un protocole pour l’isolement et la caractérisation des véhicules électriques du adult Schistosoma japonicum (S. japonicum). EVs ont été isolées in vitro milieu de culture par centrifugation, combinée avec un kit d’isolation exosome commerciale. L' isolé S. japonicum EVs (SjEVs) généralement posséder un diamètre de 100 à 400 nm et sont caractérisées par la microscopie électronique à transmission et transfert Western. L’utilisation de PKH67 dye-labeled SjEVs a démontré que les SjEVs sont internalisés par les cellules réceptrices. Dans l’ensemble, notre protocole fournit une méthode alternative pour isoler l’EVs de schistosomes adultes ; la SjEVs isolée peut être adapté à l’analyse fonctionnelle.
Introduction
Les vésicules extracellulaires (EVs) sont une population de petites vésicules membranaires encapsulé avec diverses protéines, lipides et acides nucléiques. Des études récentes ont démontré que EVs jouent un rôle crucial dans la communication de cellule-cellule et sont impliquées dans la régulation de nombreux processus physiologiques, y compris le développement cellulaire, régulation immunitaire, angiogenèse et cell migration2, 3,4,5. Accumulation de preuves indique que EVs, diffuser les exosomes et leur cargaison de miRNA représentent des biomarqueurs potentiels de certaines maladies6.
Plusieurs des protozoaires tels que Trichomonas vaginalis, Trypanosoma cruziet Leishmania spp., auraient dû être divulgués pour pouvoir sécréter EVs ; helminthes ont en outre été découverts à sécréter des EVs en vie accueille7. EVs parasitaires ont démontré d’être impliqués dans le maintien de l’infection, pathogénicité8et9de la régulation immunitaire. Récentes études sur les schistosomes deux Schistosoma mansoni (S. mansoni) 10,11 et S. japonicum12 ont indiqué que les schistosomes adultes sécrètent exosome-comme des vésicules qui peuvent être impliqués dans la réglementation fonctionnelle des processus biologiques spécifiques.
A ce jour, plusieurs méthodes ont été utilisées pour isoler des vésicules extracellulaires, telles que l’ultracentrifugation, ultrafiltration13, l’utilisation de réactifs à base de polymère, chromatographie d’exclusion et l’isolement d’immuno-affinité. Ces différentes méthodes possèdent leurs propres avantages et limitations14. En règle générale, ultracentrifugation est considérée comme la méthode de l’étalon-or pour l’isolement de la vésicule. Toutefois, cette méthode souffre de la limitation de potentiel EV agrégation14.
Dans schistosomes, deux méthodes ont été signalés pour l’isolement de l’EV : il s’agit d’ultracentrifugation11,12,10 et l’utilisation commerciale EV isolation kit16 pour plusieurs stades (œufs,16, schistosomula11, schistosomes adultes10,12,,17). Étant donné que microvésicules sont d’une large gamme de taille de quelques nanomètres de cent à mille nanomètres, nous avons développé une méthode alternative qui associe l’utilisation d’un kit d’isolation commercial EV pour isoler le SVE de centrifugeuse de paillasse et ultrafiltration adultes de Schistosoma japonicum. Le SVE isolé en général possède un diamètre de 100 à 400 nm et ont été avec succès internalisé par les cellules réceptrices.
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Protocol
Toutes les expériences animales ont été approuvées par le Comité d’éthique local de l’Institut de recherche vétérinaire de Shanghai, Académie chinoise des Sciences agricoles (numéro de permis : SHVRIAU-14-0101).
1. la Culture in Vitro des Schistosomes
Remarque : Schistosomes représentent un danger biologique. Travailleurs devraient porter des gants en latex à tous les temps quelle manipulation vers, des suspensions faites ou autres associés biomatériaux. Lapins de Nouvelle-Zélande abritaient des cercaires ~ 2 000 via abdominale exposition. Schistosomes au stade hépatique ont été recueillis de lapins infectés par S. japonicum cercaires à 28 jours après l’infection par la perfusion du foie et les veines mésentériques. Les procédures de collecte de ver ont été référencés dans des publications antérieures, rapports d’études chez la souris18.
- Recueillir les parasites dans un bécher de 500 mL. Laver soigneusement et doucement 3 x 200 ml de réchauffé (37 ° C) PBS (pH 7,4).
- Séparer les paires de ver ~ 200 pour chaque boîte de Pétri 90 mm. Puis laver les parasites soigneusement et doucement 2 x avec 50 mL de réchauffé RPMI 1640 milieu de culture contenant 100 U de pénicilline et de 100 mg/mL de streptomycine (37 ° C).
- Maintenir les parasites dans 40 mL de milieu de culture RPMI 1640 préchauffé sans antibiotiques à 37 ° C, moins de 5 % de CO2 à une densité de ver ~ 5 paires/ml pendant 2 h à 90 mm Petri dish.
Notes : Le milieu RPMI 1640 ne doit pas contenir sérum, sinon des vésicules extracellulaires exogène seront mis en place.
2. pré-traité Condition Media
- Récupérer le milieu de culture et puis centrifuger le milieu à 4 ° C à 2 000 × g pendant 30 min retirer les œufs et les débris tegmentale à vis sans fin.
- Transférer le surnageant dans un nouveau tube et puis filtrer la solution à l’aide d’une seringue-filtre de 0,22 µm.
- Recueillir la solution filtrée dans un sac dialysée (seuil de poids moléculaire : 3.5kD) et puis dialyser la solution en utilisant la solution 8 % PEG8000 à 4 ° C durant la nuit.
Notes : Cette étape est importante pour enrichir SjEVs pour augmenter le rendement d’isolement SjEVs.
3. isolement de SjEVs
- Transférer la solution dialysée dans un nouveau tube et puis ajouter 0,5 volumes du réactif exosome total isolement.
- Mélanger la solution bien de Vortex ou de pipetage de haut en bas afin de garantir l’homogénéité de la solution.
- Incuber le mélange à 2 ° C à 8 ° C pendant la nuit.
- Centrifuger le mélange à 15 000 × g pendant 1 h à 2 ° C à 8 ° C.
- Aspirer et éliminer le surnageant.
Notes : SVE figurent dans le culot en bas du tube (non visible dans la plupart des cas). - Resuspendre le culot d’EVs dans 2 mL de PBS et ensuite stocker la solution EVs à-80 ° C jusqu'à ce qu’une analyse plus approfondie.
4. caractérisation des EVs Western Blot
- Déterminer la concentration de protéines de l’échantillon de SjEVs, par exemple, par dosage de la BCA.
- Préparer 10 à 20 µg d’EVs à 22,5 µL de tampon de RIPA. Puis ajouter 7,5 µL de 4 x chargement de tampon et la chaleur pendant 5 min à 95 ° C.
- Séparer des protéines SjEVs par 12 % sur gel SDS-PAGE.
- Transférer les protéines de membrane de PVDF et puis sonde avec anticorps anti-CD63 (1:1, 000 dilution), suivis en sondant avec anti-lapin IgG-HRP (1:5, 000 de dilution).
- Utiliser le réactif de détection ECL pour le développement de la membrane et détecter les signaux par une système d’imagerie de la chimiluminescence.
5. caractérisation des EVs par microscopie électronique à Transmission
- Ajouter 2 µL de SjEVs isolé à 200 mesh enduit formvar grilles et puis laissez-les sécher à température ambiante.
- Tache avec 2 % d’acide phosphotungstique pendant 1 min et puis laissez-les sécher à température ambiante.
- Charger les grilles sur le porte-échantillon du microscope électronique à transmission et exposé à un faisceau d’électrons 80 kV pour la capture d’image.
6. SjEVs Label avec PKH67 et analyse de l’absorption de cellules
Notes : Toutes les étapes subséquentes ont été effectuées à température ambiante (20-25 ° C), sauf indication contraire.
- Transférer 5 µg SjEVs solution dans un tube en polypropylène à fond conique et régler le volume à 12 mL par adjonction de ce milieu RPMI 1640.
- Centrifuger le SjEVs à 110 000 × g pendant 90 min à 4 ° C pour SjEVs à pellets.
- Après centrifugation, soigneusement aspirer le surnageant.
Remarque : Le colorant dans l’éthanol de PKH67 ne doit pas être ajouté directement au culot chadhouli, comme cela se traduirait par une coloration hétérogène et la viabilité cellulaire réduite. - Préparer une solution de Suspension EV 2 x en ajoutant 1 mL de diluant C au culot chadhouli ; pour assurer la dispersion totale, resuspendre avec douceur de pipetage.
- Juste avant la coloration en diluant C, préparer une douce 2 x Solution de colorant en ajoutant 2 µL de la solution éthanolique de colorant de PKH67 à 1 mL de diluant C dans un tube à centrifuger en polypropylène et en mélangeant bien pour disperser.
- Rapidement ajouter le 1 mL x 2 EV Suspension (étape 6.4) à 1 mL de 2 x Solution de colorant (étape 6.5) et immédiatement mélanger l’échantillon de pipetage.
- Incuber le mélange à température ambiante pendant 4 min.
- Arrêter la coloration en ajoutant 4 mL de FBS et puis incuber pendant 1 min.
- Ajouter RPMI1640 moyen pour régler le volume à 12 mL et puis centrifuger à 110 000 × g à 4 ° C pendant 90 min.
- Retirez le surnageant et ajouter RPMI1640 moyen pour remettre en suspension les PKH67 étiqueté chadhouli granulés.
- Centrifuger à 110 000 × g à 4 ° C pendant 90 min laver une fois puis ajouter PBS pour remettre en suspension les granules de SjEVs.
7. analyse de l’absorption de cellules SjEVs
- Cellules de mammifères de graines comme le NCTC cloner 1469 cellules ou cellules HEK293T en plaques 6 puits (2 × 105 cellules / puits) et culture les cellules pendant la nuit.
- Ajouter 5 µg SjEVs PKH67 marqué et ensuite la culture des cellules à 37 ° C pendant 2 à 4 h.
- Après incubation, enlever le milieu et laver les cellules avec du PBS.
- Fixer les cellules avec une solution de formaldéhyde de 4 % pendant 15 minutes et laver deux fois plus avec du PBS.
- Tacher les noyaux des cellules au 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI).
- Observer les cellules à l’aide de la microscopie de fluorescence.
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Representative Results
Afin de quantifier le rendement de SjEVs isolé en utilisant le protocole décrit, nous avons utilisé dosage protéique BCA pour accéder le taux protéique de la SjEVs isolée de schistosomes adultes de 28 jours. Comme indiqué dans le tableau 1, la concentration de protéine chadhouli variait entre 208 µg et 250 µg / 100 mL de milieu (tableau 1). La taille des particules, tel que déterminé par analyse de nanoparticules de Malvern, a indiqué que le SjEVs isolés se situait entre 100 nm et 400 nm, avec la plus haute population environ 220 nm en taille (Figure 1). Une caractérisation plus poussée de la SjEVs en microscopie électronique a révélé EVs pour être des vésicules rondes d’environ 100 à 200 nm de diamètre (Figure 2). Western blotting analyse a indiqué que le SjEVs isolés ont été reconnus à l’aide d’anticorps CD63, qui est un marqueur de EV typique (Figure 3). Observation de la microscopie de fluorescence a indiqué que les SjEVs PKH67 marqués ont été internalisés par les cellules de 1 469 clone NCTC et que les SjEVs étaient principalement répartis dans le cytoplasme des cellules réceptrices (Figure 4).
| Échantillons | EVs / 100ml de milieu de culture |
| #1 | 250 µg |
| #2 | 208 µg |
| #3 | 220 µg |
Tableau 1 : SjEVs protéine provenant de milieu de culture ; montre la quantité de SjEVs accédé par dosage de la BCA par 100 mL de milieu de culture, contenant environ 500 paires de ver,.
Figure 1 : Taille de répartition des SjEVs isolées du milieu cultivé. 20 µL de solution de SjEVs a été dilué avec 1000 µL PBS ; Ensuite, le mélange a été analysé à l’aide d’une particule d’angle deux hautes performances et l’analyseur de taille moléculaire. Le résultat présenté est représentant des données de trois isolats indépendants. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Caractérisation des SjEVs par microscopie électronique à transmission. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Western blotting analyse de le SjEVs isolés contre les anticorps CD63. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Absorption de SjEVs par les cellules de mammifères. Le PKH étiqueté SjEVs apparaissent en vert, tandis que les noyaux cellulaires sont indiquées en bleu. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Des études récentes sur les EVs ont démontré que schistosome Qu'evs jouent un rôle important dans host-pathogen interactions3,9,12,16. Afin de répondre leurs fonctions de régulation, il est essentiel d’isoler le SVE de schistosomes. Nous décrivons ici une autre méthode d’isolement chadhouli. Cette méthode génère une taille de large gamme de SjEVs, de 100 nm à 400 nm, en adulte S. japonicum. L’essai d’absorption cellulaire suivant indiqué que EVs isolés conformément au protocole décrit ont été avec succès internalisés par les cellules réceptrices et que leur miARN associées éventuellement joue des rôles régulateurs17.
EVs, qui peuvent être sécrétées par différents types de cellules, sont également présents dans différents types de fluides corporels19. Par conséquent, il est important d’éviter d’introduire artificiellement EVs exogènes au cours du processus d’isolement chadhouli. Par exemple, le milieu de culture ne doit pas contenir sérum. La densité de ver dans la culture in vitro doit être raisonnable afin de minimiser la réponse au stress potentiel et abaisser les taux de mortalité de worms. En outre, il convient de noter que les différentes étapes de schistosomes ou vers de différents hôtes peuvent présenter différents EVs. Par conséquent, il est impératif de maintenir les parasites dans les environnements in vitro qui ressemblent étroitement à l’environnement hôte, et les conditions dans laquelle chadhouli isolement est effectué doivent être cohérentes. En outre, nous ne pouvons pas exclure la possibilité de la variance liée aux SjEVs causés par le stress de la culture.
Nous présentons ici un protocole pour l’isolement des SjEVs de 2 h en vitro milieux de culture pour les schistosomes adultes. Un avantage de ce protocole est que le temps court culturel minimise le stress auquel sont exposés les parasites, qui peut provoquer la sécrétion EV non physiologiques. En outre, nous avons trouvé que les SjEVs isolés tel que décrit dans le présent protocole ont été internalisés par les cellules réceptrices, suggérant que ces SjEVs peuvent être biologiquement actif17. Dans l’ensemble, le présent protocole permet l’isolement efficace des SjEVs d’adulte vers à l’aide de matériel de laboratoire standard et permet à leur caractérisation par western blot et dosage de l’absorption des cellules. Le SVE isolé peut servir à mieux caractériser les interactions hôte-pathogène.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette étude a été, en partie ou en totalité, soutenu par la Fondation de sciences naturelles nationales de la Chine (31472187 et 31672550) et The Agricultural Science et Technology Innovation Program de l’Académie chinoise des Sciences agricoles.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 4478359 | For isolating S. japonicum extracellular vesicles |
| PKH67 | Sigma-aldrich | MINI67 | For labeling Evs |
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11875119 | For parasite culture |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher SCIENTIFIC | 15140122 | |
| 0.22μm syringe filter | Merck | SLGP033RB | |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo SCIENTIFIC | 68035 | |
| PEG8000 | Sangon Biotech | A100159 | |
| RIPA | Beyotime | P0013B | |
| EMD Millipore™ Immobilon™ Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) | Fisher scientific | WBKLS0100 | |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083 | |
| BCA kit | Beyotime | P0010 | |
| CD63 antibodies | Sangon Biotech | D160973-0025 | |
| PVDF | Bio-Rad | 1704273 | |
| Formvar/Carbon 400 mesh | Ted Pella | 01754-F | |
| Phosphotungstic Acid | Ted Pella | 19402 | |
| anti-mouse IgG-HRP | CWBIO | CW0102 | |
| NCTC clone 1469 cells | ATCC | ATCC® CCL-9.1™ | |
| FBS | HyClone | SV30087.02 | |
| Equipments | |||
| GE chemoluminescance imaging system | GE | ImageQuant LAS4000mini | |
| Transmission electron microscopy | Hitachi | H-7600 | |
| Milli-Q water | Milli-Q | Milli-Q Elix | |
| Eppendor Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5804R | |
| Zetasizer Nano | Malvern | Zetasizer Nano ZS | |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima L-100 XP Ultracentrifuge | |
| Incubator | ESCO | CCL-107B | |
| Microscope | Zeiss | Zeiss Axin Observer Z1 |
References
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