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Immunology and Infection

अलगाव और वयस्क Schistosoma japonicum से Extracellular बुलबुले के लक्षण वर्णन

Published: May 22, 2018 doi: 10.3791/57514
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1, 1, 2, 1
1Shanghai Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Animal Parasitology, Ministry of Agriculture, 2Tianjin Agricultural University
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम एक प्रोटोकॉल वर्तमान में extracellular बुलबुले (ईवीएस) अलगाव का वर्णन इन विट्रो में वयस्क Schistosoma japonicumसे प्रसंस्कृत माध्यम ।

Abstract

Extracellular बुलबुले (ईवीएस) Extracellular microenvironment में कोशिकाओं की एक किस्म द्वारा जारी झिल्लीदार बुलबुले हैं । ईवीएस विषम बुलबुले, जिसका आकार ४० और १,००० एनएम के बीच सीमा की आबादी का प्रतिनिधित्व करते हैं । संचित सबूत संकेत दिया कि ईवीएस रोगज़नक़-मेजबान बातचीत में महत्वपूर्ण नियामक भूमिका निभाते हैं । schistosome ईवीएस की गहरी समझ schistosome-मेजबान बातचीत अंतर्निहित तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करना चाहिए, schistosomiasis के खिलाफ उपंयास रणनीतियों के विकास को सक्षम करने । यहां, हम और वयस्क Schistosoma japonicum (एस. japonicum) से ईवीएस के अलगाव और लक्षण वर्णन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करने से schistosomes में ईवीएस कार्यों का अध्ययन करने का लक्ष्य । ईवीएस से अलग थे इन विट्रो संस्कृति मध्यम केंद्रापसारक एक वाणिज्यिक exosome आइसोलेशन किट के साथ संयुक्त का उपयोग कर । पृथक एस japonicum ईवीएस (SjEVs) आम तौर पर १००-४०० एनएम के एक व्यास के अधिकारी, और संचरण इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोस्कोपी और पश्चिमी सोख्ता द्वारा विशेषता है । PKH67 डाई का उपयोग-लेबल SjEVs प्रदर्शन किया है कि SjEVs प्राप्तकर्ता कोशिकाओं द्वारा आंतरिक हैं । कुल मिलाकर, हमारे प्रोटोकॉल वयस्क schistosomes से ईवीएस को अलग करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका प्रदान करता है; पृथक SjEVs कार्यात्मक विश्लेषण के लिए उपयुक्त हो सकता है ।

Introduction

Extracellular बुलबुले (ईवीएस) विभिन्न प्रोटीन, लिपिड, और न्यूक्लिक एसिड के साथ समझाया छोटे झिल्ली बंधे बुलबुले की आबादी है । हाल के अध्ययनों से प्रदर्शन किया है कि ईवीएस सेल में एक महत्वपूर्ण भूमिका-सेल संचार खेलते हैं, और कई शारीरिक प्रक्रियाओं के विनियमन में शामिल हैं, सेल विकास, प्रतिरक्षा विनियमन, angiogenesis, और सेल माइग्रेशन2सहित, 3,4,5. सबूत जमा इंगित करता है कि ईवीएस, परिचालित exosomes, और उनके miRNA कार्गो कुछ रोगों के संभावित उपमार्क्स6का प्रतिनिधित्व करता है ।

कई प्रोटोजोआ जैसे ट्रायकॉमोनास वेजिनेलिस, Trypanosoma cruzi, और Leishmania एसपीपी., को चुपके से ईवीएस कर दिखाया गया है; helminths इसके अतिरिक्त के लिए रहने वाले में ईवीएस चुपके पाया गया है7मेजबान । परजीवी ईवीएस को संक्रमण के रखरखाव, pathogenicity8, और प्रतिरक्षा विनियमन9में शामिल होना दिखाया गया है । schistosomes में हाल के अध्ययनों से दोनों Schistosoma mansoni (एस. mansoni) 10,11 और एस japonicum12 ने संकेत दिया है कि वयस्क schistosomes स्रावी exosome-बुलबुले की तरह है कि हो सकता है विशिष्ट जैविक प्रक्रियाओं के कार्यात्मक विनियमों में शामिल ।

तिथि करने के लिए, कई तरीकों extracellular बुलबुले अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, ऐसे ultracentrifugation के रूप में, ultrafiltration13, बहुलक आधारित रिएजेंट का उपयोग, आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी, और immunoaffinity अलगाव । इन विभिंन तरीकों के पास अपने स्वयं के फायदे और सीमाएं14। आम तौर पर, ultracentrifugation पुटिका अलगाव के लिए सोने की मानक विधि माना जाता है । हालांकि, इस विधि संभावित EV एकत्रीकरण14की सीमा से ग्रस्त है ।

schistosomes में, EV अलगाव के लिए कुछ विधियों की रिपोर्ट की गई है: इनमें ultracentrifugation11,12,10 और कई चरणों के लिए वाणिज्यिक EV आइसोलेशन किट16 का उपयोग शामिल है (अंडे16, schistosomula११, प्रौढ schistosomes१०,१२,१७). यह देखते हुए कि microvesicles कई सौ nanometers से हजार nanometers के आकार की एक विस्तृत श्रृंखला के हैं, हम एक वैकल्पिक तरीका है कि बेंच केंद्रापसारक, ultrafiltration, और एक वाणिज्यिक EV आइसोलेशन किट के उपयोग के साथ जोड़ती है विकसित से ईवीएस को अलग प्रौढ Schistosoma japonicum. अलग ईवीएस आम तौर पर १००-४०० एनएम के एक व्यास के पास और सफलतापूर्वक प्राप्तकर्ता कोशिकाओं द्वारा आंतरिक थे ।

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Protocol

शंघाई पशु चिकित्सा अनुसंधान संस्थान, चीनी अकादमी कृषि विज्ञान (परमिट संख्या: SHVRIAU-14-0101) की स्थानीय नैतिकता समिति द्वारा सभी पशु प्रयोगों को अनुमोदित किया गया ।

1. इन विट्रो कल्चर ऑफ़ Schistosomes

नोट: Schistosomes एक बाधा का प्रतिनिधित्व करते हैं । श्रमिक हर समय जब कीड़े हैंडलिंग लेटेक्स दस्ताने पहनना चाहिए, schistosomal निलंबन, या अंय संबंधित जैविक सामग्री । न्यूजीलैंड खरगोश पेट जोखिम के माध्यम से ~ २,००० cercariae से संक्रमित थे । जिगर के स्तर पर Schistosomes 28 दिनों के बाद जिगर और mesenteric नसों के छिड़काव द्वारा संक्रमण पर एस japonicum cercariae से संक्रमित खरगोशों से एकत्र किए गए थे । कीड़ा संग्रह की कार्यविधियों को पिछले प्रकाशन रिपोर्टिंग अध्ययन में चूहों18में संदर्भित किया गया है ।

  1. एक ५०० मिलीलीटर चोंच में परजीवी ले लीजिए । उंहें अच्छी तरह से धोने और पहले से गरम (३७ डिग्री सेल्सियस) पंजाबियों (पीएच ७.४) के २०० मिलीलीटर के साथ 3x ।
  2. अलग ~ २०० प्रत्येक ९० mm पेट्री डिश के लिए कीड़ा जोड़े । फिर परजीवी धो अच्छी तरह से और धीरे से ५० मिलीलीटर की कचौरी (३७ डिग्री सेल्सियस) RPMI-१६४० संस्कृति मध्यम से युक्त १०० पेनिसिलिन के यू और १०० मिलीग्राम/streptomycin के एमएल ।
  3. बनाए रखने के ४० मिलीलीटर से गरम RPMI-१६४० संस्कृति मध्यम में एंटीबायोटिक दवाओं के बिना ३७ ° c के तहत 5% सह2 के घनत्व पर ~ 5 कृमि जोड़े/mL के लिए ९० mm पेट्री डिश में 2 ज ।
    नोट: RPMI १६४० मध्यम सीरम शामिल नहीं करना चाहिए, अन्यथा exogenous extracellular पुटिका पेश किया जाएगा.

2. पूर्व इलाज हालत मीडिया

  1. संस्कृति माध्यम लीजिए और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर मध्यम केंद्रापसारक 30 के लिए २,००० × जी में अंडे और कीड़ा tegmental मलबे को दूर करने के लिए ।
  2. एक ताजा ट्यूब के लिए supernatant स्थानांतरण और फिर एक ०.२२ µm सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर समाधान फिल्टर.
  3. एक dialyzed बैग में फ़िल्टर्ड समाधान लीजिए (आणविक वजन कट-ऑफ: 3.5 केडी) और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 8% PEG8000 समाधान का उपयोग कर समाधान dialyze ।
    नोट: यह कदम SjEVs अलगाव की उपज बढ़ाने के लिए SjEVs को समृद्ध करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

3. SjEVs का अलगाव

  1. dialyzed समाधान एक नई ट्यूब के लिए स्थानांतरण और उसके बाद कुल exosome आइसोलेशन एजेंट के ०.५ वॉल्यूम जोड़ें ।
  2. घोल को अच्छी तरह से मिलाकर हल करें या समाधान की एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए ऊपर और नीचे pipetting ।
  3. रात भर 8 डिग्री सेल्सियस के लिए 2 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण की मशीन ।
  4. 2 डिग्री सेल्सियस से 8 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए १५,००० × g पर मिश्रण केंद्रापसारक ।
  5. supernatant को महाप्राण और त्यागें ।
    नोट: ईवीएस ट्यूब के तल पर गोली में निहित है (ज्यादातर मामलों में दिखाई नहीं) ।
  6. पंजाब के 2 मिलीलीटर में ईवीएस गोली reसस्पेंड और फिर पर ईवीएस समाधान की दुकान-८० ° c आगे विश्लेषण तक ।

4. पश्चिमी सोख्ता द्वारा ईवीएस का लक्षण वर्णन

  1. SjEVs नमूना के प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण, जैसे, बीसीए परख द्वारा ।
  2. तैयार 10-20 µ g को ईवीएस के २२.५ µ l RIPA बफर में । फिर ९५ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 4x लोडिंग बफर और हीट के ७.५ µ एल जोड़ें ।
  3. 12% एसडीएस द्वारा अलग SjEVs प्रोटीन-पृष्ठ जेल ।
  4. PVDF झिल्ली के लिए प्रोटीन स्थानांतरण और फिर विरोधी CD63 एंटीबॉडी (1:1000 कमजोर पड़ने), विरोधी खरगोश आईजीजी-एचआरपी (1:5000 कमजोर पड़ने) के साथ की जांच के बाद के साथ जाँच ।
  5. झिल्ली के विकास के लिए ECL का पता लगाने के एजेंट का प्रयोग करें और एक chemiluminescence इमेजिंग प्रणाली द्वारा संकेतों का पता लगाने ।

5. संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा ईवीएस का लक्षण वर्णन

  1. २०० मेष formvar लेपित ग्रिड के लिए अलग SjEVs के 2 µ एल जोड़ें और फिर यह कमरे के तापमान पर शुष्क करने की अनुमति ।
  2. 1 मिनट के लिए 2% Phosphotungstic एसिड के साथ दाग और फिर यह कमरे के तापमान पर शुष्क करने की अनुमति ।
  3. संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के नमूने धारक पर ग्रिड लोड और छवि पर कब्जा करने के लिए एक ८० केवी इलेक्ट्रॉन बीम से अवगत कराया ।

6. PKH67 और सेल के साथ SjEVs लेबल को ले लो परख

नोट: बाद के सभी चरणों परिवेश तापमान (20-25 डिग्री सेल्सियस) पर प्रदर्शन किया, जब तक अंयथा संकेत दिया गया ।

  1. स्थानांतरण 5 µ g SjEVs समाधान एक शंकु नीचे के में ट्यूब और RPMI १६४० मध्यम जोड़कर 12 मिलीलीटर के लिए मात्रा समायोजित करें ।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर ९० मिनट के लिए ११०,००० × जी में SjEVs केंद्रापसारक गोली SjEVs ।
  3. केंद्रापसारक के बाद, ध्यान से supernatant महाप्राण ।
    नोट: PKH67 इथेनॉल डाई सीधे SjEV गोली के लिए नहीं जोड़ा जाना चाहिए, के रूप में यह विषम धुंधला और कम सेल व्यवहार्यता में परिणाम होगा ।
  4. SjEV गोली के लिए मंदक सी की 1 मिलीलीटर जोड़कर एक 2x EV निलंबन समाधान तैयार; पूरा फैलाव सुनिश्चित करने के लिए, कोमल pipetting के साथ पुनर्निलंबित ।
  5. बस मंदक सी में धुंधला से पहले, मंदक सी की 1 मिलीलीटर के लिए PKH67 इथेनॉल डाई समाधान के 2 µ एल जोड़ने के द्वारा एक नए 2x डाई समाधान तैयार करते हैं और अच्छी तरह से फैलाने के लिए मिश्रण ।
  6. तेजी से 2x EV निलंबन के 1 मिलीलीटर (चरण ६.४) 2x डाई समाधान (६.५ कदम) के 1 मिलीलीटर जोड़ने और तुरंत pipetting द्वारा नमूना मिश्रण ।
  7. 4 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण की मशीन ।
  8. FBS के 4 मिलीलीटर जोड़ने से धुंधलाना बंद करो और फिर 1 मिनट के लिए मशीन ।
  9. RPMI1640 मध्यम जोड़ने के लिए मात्रा को समायोजित करने के लिए 12 मिलीलीटर और फिर ११०,००० × g पर 4 ° c पर ९० मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
  10. supernatant निकालें और PKH67 लेबल SjEV छर्रों reसस्पेंड करने के लिए RPMI1640 माध्यम जोड़ें ।
  11. ९० मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ११०,००० × जी में केंद्रापसारक एक बार धोने और फिर पंजाबियों जोड़ने के लिए SjEVs छर्रों reसस्पेंड ।

7. SjEVs सेल को लें परख

  1. बीज स्तनधारी कोशिकाओं NCTC क्लोन १४६९ कोशिकाओं या 6 में HEK293T कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह से प्लेटें (2 × 105 प्रति अच्छी तरह से कोशिकाओं) और संस्कृति रात भर कोशिकाओं ।
  2. जोड़ें 5 µ g PKH67-बला SjEVs और फिर ३७ ° c पर संस्कृति कोशिकाओं 2-4 एच के लिए ।
  3. मशीन के बाद, मध्यम निकालें और पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को दो बार धो लें ।
  4. 15 मिनट के लिए 4% formaldehyde समाधान के साथ कोशिकाओं को ठीक और दो बार पंजाब के साथ और अधिक धोया ।
  5. दाग 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) के साथ सेल नाभिक ।
  6. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर कोशिकाओं का निरीक्षण ।

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Representative Results

वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर पृथक SjEVs की उपज का अंदाजा लगाने के लिए, हम 28 दिन वयस्क schistosomes से अलग SjEVs के प्रोटीन एकाग्रता का उपयोग करने के लिए बीसीए प्रोटीन परख का इस्तेमाल किया । के रूप में तालिका 1में दिखाया गया है, SjEV प्रोटीन एकाग्रता २०८ µ जी से लेकर २५० µ ग्राम प्रति १०० मिलीलीटर (तालिका 1) । कण आकार, Malvern nanoparticle विश्लेषण द्वारा निर्धारित के रूप में, संकेत दिया कि अलग SjEVs १०० एनएम से ४०० एनएम के लिए, आकार में २२० एनएम के आसपास सबसे अधिक आबादी के साथ (चित्रा 1) से लेकर । इसके अलावा संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा SjEVs के लक्षण वर्णन से पता चला ईवीएस के लगभग १००-२०० एनएम के व्यास में दौर बुलबुले (चित्रा 2) । पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण संकेत दिया कि अलग SjEVs CD63 एंटीबॉडी, जो एक ठेठ EV मार्कर (चित्रा 3) है का उपयोग कर मांयता प्राप्त थे । प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी अवलोकन संकेत दिया है कि PKH67-लेबल SjEVs NCTC क्लोन १,४६९ कोशिकाओं द्वारा आंतरिक थे और कि SjEVs मुख्य रूप से प्राप्तकर्ता कोशिकाओं के कोशिका द्रव्य में वितरित किया गया (चित्रा4) ।

नमूने ईवीएस/100ml कल्चरल मीडियम
#1 २५० µ छ
#2 २०८ µ छ
#3 २२० µ छ

तालिका 1: SjEVs संस्कृति माध्यम से प्राप्त प्रोटीन; संस्कृति माध्यम के १०० मिलीलीटर प्रति बीसीए परख द्वारा पहुंचा SjEVs की राशि, ~ ५०० कृमि जोड़े, युक्त दिखाया गया है ।

Figure 1
चित्र 1 : SjEVs के आकार का वितरण प्रसंस्कृत माध्यम से पृथक । SjEVs समाधान के 20 µ l को १००० µ l पंजाबियों के साथ पतला किया गया; फिर, मिश्रण एक उच्च प्रदर्शन दो कोण कण और आणविक आकार विश्लेषक का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था । दिखाया परिणाम तीन स्वतंत्र अलगाव से डेटा के प्रतिनिधि है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा SjEVs के लक्षण वर्णन. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : CD63 एंटीबॉडी के खिलाफ अलग SjEVs के पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : स्तनधारी कोशिकाओं द्वारा SjEVs के ऊपर ले । PKH लेबल्ड SjEVs को हरे रंग में दिखाया गया है, जबकि सेल नाभिक नीले रंग में दर्शाए गए हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

ईवीएस पर हाल के अध्ययनों से प्रदर्शन किया है कि schistosome ईवीएस मेजबान में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा-रोगज़नक़ बातचीत3,9,12,16। और उनके विनियामक कार्यों को संबोधित करने के लिए, यह schistosomes से ईवीएस को अलग करने के लिए आवश्यक है । यहां, हम SjEV अलगाव के लिए एक वैकल्पिक पद्धति का वर्णन । इस विधि SjEVs की एक विस्तृत श्रृंखला आकार, १०० एनएम से ४०० एनएम के लिए, वयस्क एस japonicumमें पैदावार । निंन कक्ष के आगे की ओर परख ने संकेत दिया कि वर्णित प्रोटोकॉल के अंतर्गत पृथक ईवीएस प्राप्तकर्ता कक्षों द्वारा सफलतापूर्वक आंतरिक रूप से और उनके संबद्ध miRNAs संभावित रूप से विनियामक भूमिकाएं17चलाएं ।

ईवीएस, जो कई कोशिकाओं के विभिंन प्रकार के द्वारा स्रावित किया जा सकता है भी शरीर के तरल पदार्थ के विभिंन प्रकार में मौजूद है19। नतीजतन, यह कृत्रिम रूप से SjEV अलगाव की प्रक्रिया के दौरान exogenous ईवीएस शुरू करने से बचने के लिए महत्वपूर्ण है । उदाहरण के लिए, संस्कृति माध्यम सीरम शामिल नहीं होना चाहिए । इन विट्रो संस्कृति में कीड़ा घनत्व संभावित तनाव प्रतिक्रिया को कम करने और कीड़े की मृत्यु दर कम करने के लिए उचित होना चाहिए । इसके अलावा, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि विभिंन मेजबानों से schistosomes या कीड़े के विभिंन चरणों विभिंन ईवीएस मौजूद हो सकता है । नतीजतन, यह इन विट्रो वातावरण है कि बारीकी से मेजबान पर्यावरण के समान है, और शर्तों जिसके तहत SjEV अलगाव किया जाता है संगत होना चाहिए में परजीवी बनाए रखने के लिए आवश्यक है । इसके अतिरिक्त, हम संस्कृति तनाव के कारण SjEVs से संबंधित विचरण की संभावना को शासन करने में असमर्थ हैं ।

यहां, हम वयस्क schistosomes के लिए इन विट्रो संस्कृति मीडिया में 2 ज से SjEVs के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद । इस प्रोटोकॉल का एक लाभ यह है कि लघु संस्कृति समय तनाव को कम करता है जो परजीवी उजागर कर रहे हैं, जो गैर शारीरिक EV स्राव में परिणाम हो सकता है । इसके अतिरिक्त, हमने पाया है कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में पृथक SjEVs प्राप्तकर्ता कोशिकाओं द्वारा आंतरिक थे, सुझाव है कि इन SjEVs हो सकता है जैविक रूप से सक्रिय17। कुल मिलाकर, वर्तमान प्रोटोकॉल वयस्क कीड़े मानक प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग करने से SjEVs के कुशल अलगाव की अनुमति देता है, और उनके पश्चिमी सोख्ता और सेल का उपयोग कर परख के लक्षण वर्णन सक्षम बनाता है । अलग ईवीएस आगे होस्ट-रोगज़नक़ बातचीत की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन में भाग या पूरे में, चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित (३१४७२१८७ और ३१६७२५५०) और कृषि विज्ञान और चीनी कृषि विज्ञान अकादमी के प्रौद्योगिकी नवाचार कार्यक्रम था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media) ThermoFisher SCIENTIFIC 4478359 For isolating S. japonicum extracellular vesicles
PKH67 Sigma-aldrich MINI67 For labeling Evs
RPMI 1640 Medium ThermoFisher SCIENTIFIC 11875119 For parasite culture
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher SCIENTIFIC 15140122
0.22μm syringe filter Merck SLGP033RB
SnakeSkin Dialysis Tubing Thermo SCIENTIFIC 68035
PEG8000 Sangon Biotech A100159 
RIPA Beyotime P0013B
EMD Millipore™ Immobilon™ Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) Fisher scientific WBKLS0100 
DAPI Cell Signaling Technology 4083
BCA kit Beyotime P0010
CD63 antibodies Sangon Biotech D160973-0025
PVDF Bio-Rad 1704273
Formvar/Carbon 400 mesh Ted Pella 01754-F
Phosphotungstic Acid Ted Pella 19402
anti-mouse IgG-HRP CWBIO CW0102
NCTC clone 1469 cells ATCC ATCC® CCL-9.1™
FBS HyClone SV30087.02
Equipments
GE chemoluminescance imaging system GE ImageQuant LAS4000mini
Transmission electron microscopy Hitachi H-7600
Milli-Q water Milli-Q Milli-Q Elix
Eppendor Centrifuge  Eppendorf Centrifuge 5804R
Zetasizer Nano Malvern Zetasizer Nano ZS 
Ultracentrifuge Beckman Optima L-100 XP Ultracentrifuge
Incubator ESCO CCL-107B
Microscope Zeiss Zeiss Axin Observer Z1

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण मुद्दा १३५ Extracellular बुलबुले अलगाव Schistosomes लक्षण वर्णन इन विट्रो संस्कृति निदान
अलगाव और वयस्क <em>Schistosoma japonicum</em> से Extracellular बुलबुले के लक्षण वर्णन
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Liu, J., Zhu, L., Wang, L., Chen,… More

Liu, J., Zhu, L., Wang, L., Chen, Y., Giri, B. R., Li, J., Cheng, G. Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum. J. Vis. Exp. (135), e57514, doi:10.3791/57514 (2018).

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